新型冠狀病毒SARS-CoV-2簡介及黑腹果蠅在該病毒研究中的潛在應(yīng)用

陳 笛 藍(lán) 曉 蔡 華

果蠅是已經(jīng)被使用了一百多年的模式生物，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)揮著重要的作用，主要有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢[1]：①果蠅個體小，發(fā)育快，養(yǎng)殖成本小，無倫理問題，可進(jìn)行大規(guī)模操作；②具有非常成熟完善的遺傳學(xué)背景，基因組全測序并注解，具有完善的基因敲除等遺傳學(xué)操作工具；③對發(fā)育，代謝，免疫等相關(guān)功能以及分子通路可實(shí)現(xiàn)全基因組無偏見的體內(nèi)篩選，也可為新的調(diào)控機(jī)制和生物反應(yīng)過程提供新的發(fā)現(xiàn)；④在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里值得引起關(guān)注的是，75%已知的與人類健康/疾病相關(guān)的基因在果蠅中有同源基因。的確，果蠅在天然免疫識別病原體領(lǐng)域做出巨大貢獻(xiàn)。果蠅不具有適應(yīng)性免疫，只具有天然免疫，然而果蠅卻可以抵抗大多數(shù)病毒、細(xì)菌和真菌的感染，提示天然免疫在抵抗病原體感染中的重要作用。法國國家科研中心朱爾斯霍夫曼教授利用果蠅為模型，發(fā)現(xiàn)Toll受體在識別真菌和細(xì)菌感染中的作用，革命性的改變了對天然免疫的理解，而獲得2011年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎。截止目前，已經(jīng)有六個諾獎授予果蠅相關(guān)的研究。

新型冠狀病毒可感染人、豬、牛、貓、犬、貂、駱駝、蝙蝠、老鼠和刺猬等，嚴(yán)重威脅人類健康(1)。2019年底爆發(fā)的SARS-CoV-2疫情，截止目前已導(dǎo)致超過380萬人感染，目前沒有有效的可供臨床使用的疫苗和特效藥，對SARS-CoV-2的了解也非常有限。本文將首先簡要介紹SARS-CoV-2以及生命周期，然后思考黑腹果蠅模型在SARS-CoV-2研究中的潛在應(yīng)用。

1 新型冠狀病毒SARS-CoV-2

冠狀病毒SARS-CoV-2是一種直徑為120nm球形帶有囊膜的病毒，基因組為正鏈單股RNA，基因組大小為～ 29.87 -29,891bp[2-3]。病毒RNA 5’端具有Cap結(jié)構(gòu)，3’端多聚腺苷化，具有多個開放讀碼框?；虻谋磉_(dá)順序是5’-replicase-S-E-M-N-3’。起始的大約2/3基因組表達(dá)多聚蛋白pp1ab，后者可被剪切為16個非結(jié)構(gòu)蛋白?？拷?’端基因組表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白，包括S蛋白、囊膜蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N。

2 SARS-CoV-2的生命周期

SARS-CoV-2生命周期與大多數(shù)病毒一樣，包括三個階段入侵、復(fù)制和包裝釋放階段。病毒囊膜上S蛋白可在宿主組織蛋白酶L(cathepsin L)切割為S1和S2兩個亞基，其中S1亞基與受體結(jié)合，并誘發(fā)S2亞基發(fā)生構(gòu)象改變，后者使得病毒囊膜與細(xì)胞膜融合，然后釋放出SARS-CoV-2病毒核衣殼。SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白的氨基酸序列一致性為76.47%[4]，二者都利用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)為入侵受體[4-6]。SARS-CoV-2主要感染表達(dá)于富含有ACE2的支氣管上皮細(xì)胞和人肺II 型上皮細(xì)胞。病毒殼子進(jìn)入細(xì)胞后，釋放到細(xì)胞內(nèi)的SARS-CoV-2基因組開始以Cap依賴的方式翻譯病毒蛋白，包括多聚蛋白pp1a和pp1ab。二者可被蛋白酶剪切為15-16個非結(jié)構(gòu)蛋白。其中nsp3編碼木瓜樣蛋白酶(PLPro)。nsp5編碼主要蛋白酶(Mpro)。這兩種酶可作為藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。nsp3、nsp4和nsp6誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)形成雙層膜結(jié)構(gòu)，這是復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合物組裝(RTC)的地方。nsp12編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)。

病毒RNA復(fù)制時，利用病毒基因組正鏈RNA為模板合成負(fù)鏈的RNA，后者可作為模板進(jìn)一步合成新的基因組正鏈RNA。病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄主要都在RTC中進(jìn)行，由病毒復(fù)制酶介導(dǎo)的。病毒顆粒的包裝發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的中間結(jié)構(gòu)上。在病毒顆粒組裝時，病毒的M蛋白作為支架，利用結(jié)構(gòu)蛋白間的相互作用招募結(jié)構(gòu)蛋白到包裝復(fù)合物上。E蛋白與M蛋白相互作用促進(jìn)病毒顆粒包裝并且會誘導(dǎo)膜結(jié)構(gòu)形成。最終，形成的病毒顆粒通過實(shí)壁囊泡分泌到細(xì)胞外。

3 SARS-CoV-2的致病性

關(guān)于SARS-CoV-2的致病蛋白，目前認(rèn)識還比較有限。結(jié)合SARS-CoV的研究結(jié)果，我們可以推斷SARS-CoV-2的幾種致病或者潛在致病蛋白，包括S蛋白以及一些非結(jié)構(gòu)蛋白。SARS的S蛋白注射小鼠可以起急性的肺損傷，并且阻斷腎素-血管緊張素通路可以減輕肺損傷[7]。SARS-CoV-2感染可以誘發(fā)肝臟損傷，胃腸異常。最近的一些研究表明SARS-CoV-2可感染腸道細(xì)胞[8]。此外，一些研究表明，SARS-CoV-2的其他結(jié)構(gòu)蛋白也具有致病功能。

4 黑腹果蠅在SARS-CoV-2致病性研究中的潛在應(yīng)用

果蠅的脂肪體類似于人類的肝臟，具有氣道和腸道。構(gòu)建S蛋白的轉(zhuǎn)基因果蠅，然后評價果蠅S蛋白對氣道，脂肪體和腸道的影響，將可能揭示S蛋白致病的機(jī)制。此外，構(gòu)建其他潛在的致病蛋白，并觀察果蠅生存率，運(yùn)動，消化等指標(biāo)，有助于揭示新的致病機(jī)制。利用果蠅的組織特異性的Gal4和果蠅的UAS驅(qū)動的過表達(dá)系統(tǒng)，將實(shí)現(xiàn)果蠅組織特異性的表達(dá)不同的SARS-CoV-2蛋白，從而更好的研究SARS-CoV-2蛋白在不同組織器官中的致病性。

5 黑腹果蠅在SARS-CoV-2誘導(dǎo)的天然免疫研究中的潛在應(yīng)用

黑腹果蠅是天然免疫研究的模式生物。截止目前，在抗病毒研究方面，果蠅感染模型可以為人類的抗病毒天然免疫提供重要的研究模型，發(fā)現(xiàn)了一系列保守的抗病毒機(jī)制[9]，比如Jak-Stat通路[10]、STING-IKKβ[11]抗等。近幾年發(fā)現(xiàn)哺乳動物中也存在抗病毒RNAi通路，從而表明果蠅的RNAi[12, 13]抗病毒通路在進(jìn)化上也被保留下來。此外一些研究表明果蠅抵抗細(xì)菌和真菌的Toll和IMD信號通路也參與病毒感染[14-15]。Toll于IMD類似哺乳動物細(xì)胞中的Toll和TNF-α通路。在抗病毒天然免疫方面果蠅相對于哺乳動物中的保守性，為研究SARS-CoV-2誘導(dǎo)的抗病毒通路提供重要的備選。盡管目前沒有證據(jù)表明，SARS-CoV-2能夠感染黑腹果蠅，但是可以通過以下辦法利用果蠅研究SARS-CoV-2對天然免疫的調(diào)控作用：構(gòu)建SARS-CoV-2蛋白的轉(zhuǎn)基因果蠅，然后觀察不同天然免疫信號通路下游基因的變化，從而發(fā)現(xiàn)潛在SARS-CoV-2的天然免疫通路抑制蛋白。

6 果蠅SARS-CoV-2替代研究模型的可行性

水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)是人畜共患病毒，可以在果蠅中感染復(fù)制并建立有效的感染[13-14, 16]。SARS-CoV-2病毒的S蛋白替VSV的G蛋白，從而構(gòu)建成功可以表達(dá)S蛋白，包裹著VSV基因組的SARS-CoV-2的假病毒。另外，通過構(gòu)建人源ACE2的轉(zhuǎn)基因果蠅，從而可能實(shí)現(xiàn)SARS-CoV-2的VSV假病毒，感染表達(dá)ACE2的轉(zhuǎn)基因果蠅，從而實(shí)現(xiàn)果蠅的SARS-CoV-2的替代研究系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以在普通的生物安全二級實(shí)驗室進(jìn)行，解決SARS-CoV-2只能在生物安全三級實(shí)驗室進(jìn)行的限制。該模型可以用于中和抗體評價或者針對S蛋白與ACE2結(jié)合抑制劑[17]的評價。

7 黑腹果蠅在抗SARS-CoV-2藥物篩選研究中的潛在應(yīng)用

黑腹果蠅是藥物篩選的重要模型，其優(yōu)勢在于可進(jìn)行大規(guī)模的活體篩選。當(dāng)下對SARS-CoV-2的抗病毒藥物篩選是在細(xì)胞水平進(jìn)行驗證，需要活體抗病毒數(shù)據(jù)的支持。以下系統(tǒng)可能作為潛在的SARS-CoV-2藥物篩選研究系統(tǒng)。①SARS-CoV-2蛋白的轉(zhuǎn)基因果蠅，如果果蠅表現(xiàn)出一些病變的表型，該表型可以作為藥物篩選模型；②SARS-CoV-2的VSV假病毒模型結(jié)合人源化ACE2轉(zhuǎn)基因果蠅，可為SARS-CoV-2研究提供果蠅替代模型，可作為抗病毒藥物篩選系統(tǒng)。

8 討論

本文綜述了SARS-CoV-2的分子病毒學(xué)和生命周期。思考并總結(jié)了黑腹果蠅在SARS-CoV-2研究中的潛在應(yīng)用，包括在SARS-CoV-2致病性，天然免疫調(diào)控，感染系統(tǒng)建立以及抗病毒藥物篩選中的潛在應(yīng)用。利用果蠅模型研究SARS-CoV-2主要有以下幾方面的優(yōu)勢：①黑腹果蠅作為經(jīng)典的遺傳學(xué)研究模型，可進(jìn)行全基因組水平的基因篩選；②SARS-CoV-2的VSV假病毒模型，結(jié)合人源ACE2轉(zhuǎn)基因果蠅，將可能解決只能在生物安全三級實(shí)驗室操作SARS-CoV-2活病毒的限制；③果蠅具有諸多保守的抗病毒天然免疫通路，可以實(shí)現(xiàn)快速篩選SARS-CoV的天然免疫抑制蛋白。④果蠅具有與人類一定程度相似的肝臟，氣道和腸道，為研究SARS-CoV-2蛋白的組織致病性提供重要的替代研究模型。