蔡宜諾,劉景華,周 凡,王吉剛,田 華,劉麗欣,張 帆,劉彥琴,佟丹江,孟廣晗,張美玉
多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)由于其高度的異質(zhì)性,患者生存時間存在較大差異,而導(dǎo)致其異質(zhì)性的重要因素之一為細胞遺傳學(xué)的異常。根據(jù)細胞遺傳學(xué)異常所發(fā)生的時間及在MM起病及疾病進展中的作用,分為原發(fā)異常及繼發(fā)異常。超二倍體和非超二倍體的改變均屬于原發(fā)異常,如常見的免疫球蛋白重鏈IgH的重排,而13號染色體缺失、17p13缺失、1p缺失、1q擴增及c-myc易位為常見的繼發(fā)異常[1]。細胞遺傳學(xué)的異常嚴重影響了患者的預(yù)后,因此,在ISS分期的基礎(chǔ)上,根據(jù)乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)及高危細胞遺傳學(xué)[17p-、t(4;14)、t(14;16)],進一步將MM進行ISS-R危險分層[2]。為研究新診斷的多發(fā)性骨髓癥(NDMM)患者對硼替佐米治療的反應(yīng)是否受細胞遺傳學(xué)異常的影響,本文回顧性分析2017年1月至2020年6月的110例接受以硼替佐米為基礎(chǔ)治療的NDMM患者的療效與細胞遺傳學(xué)細胞的相關(guān)性。
1.1 實驗材料
1.1.1 標本來源 對110例NDMM患者進行骨髓穿刺,均留取3 ml骨髓液,其中85例進行FISH檢測,8例患者因放棄治療、失訪等原因無法進行療效評估,最后選取77例可評估療效的病例進行分析。
1.1.2 主要實驗試劑 MACSprep MM CD138 MicroBeads (# 130-111-744)-CD138骨髓分選磁珠;Whole Blood Column Kit (# 130-093-545)-全血分選柱套裝;MACS BSA Stock Solution (# 130-091-376);autoMACS?Rinsing Solution (# 130-091-222);autoMACSTMRunning Buffer (# 130-091-221);1∶20稀釋用于配制separation buffer或separation buffer;MACS?SmartStrainers,100 μm (# 130-098-463)。濾器:過濾骨碎片/骨髓脂肪顆粒/細胞團。探針:雅培,CYCTOCELL??ㄖZ氏固定液:乙酸和甲醇,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 CD38磁珠分選漿細胞 ①從抗凝管中取3 ml骨髓;②骨髓樣本處理:通過MACS?智能過濾器(100 μm)傳遞細胞,以去除骨碎片或細胞團塊;③在445×g下離心10 min,取出棄上清;④每1 ml抗凝骨髓或全血加入50 μl MACSprep多發(fā)骨髓瘤CD138微珠;⑤混勻,室溫下孵育15 min(19~25 ℃);⑥進行磁選:將全血柱放置在合適的MACS分離器的磁場中,用3 ml分離緩沖液沖洗準備柱,將磁性標記的細胞懸液滴在制備的全血柱上,收集被標記的細胞,未標記細胞的流過;⑦用2×2 ml分離緩沖液沖洗全血柱;⑧從分離器中取出全血柱,放置在新的收集管上;⑨將4 ml全血柱稀釋緩沖液輸送到全血柱上,立即沖洗磁性標記的細胞,推動柱塞進入柱收集細胞;⑩將富集之后的細胞用卡諾氏固定液進行2次固定,制成細胞懸液,滴片,56 ℃老化2 h,進行清洗,探針雜交。
1.2.2 漿細胞FISH檢測 ①將新鮮骨髓液標本進行前期處理,取2 ml骨髓液,離心棄上清,經(jīng)過濃度為0.075 mol/L低滲液進行低滲處理,再用卡諾氏固定液對低滲過后的懸液進行3次固定處理,制成細胞懸液。調(diào)制成適宜的細胞濃度進行滴片。②將滴好的玻片放入56 ℃的烤箱進行老化處理,時間為30 min~1 h。③將玻片從烤箱取出恢復(fù)至室溫后,浸入50 ml 2×SSC中各洗滌3 min,梯度脫水70%酒精、80%酒精、100%酒精各3 min,晾干(≤6個載玻片/缸)。④加相應(yīng)檢測項目的探針標準用量在玻片上,先將探針試劑混勻后加于玻片雜交區(qū)域內(nèi),蓋上蓋玻片,膠(美國Vysis公司產(chǎn)品)封片后置于37 ℃原位雜交儀中雜交過夜。雜交后標本在(72±1) ℃,0.4×SSC/0.3%NP-40的洗液中洗滌5 min,待其溫度降下,將玻片浸入50 ml 2×SSC中,兩缸各1 min,梯度脫水70%酒精、80%酒精、100%酒精各1 min,晾干(≤6個載玻片/缸)。避光晾干后加二咪基苯基吲哚(DAPII)/抗淬滅劑(Vysis公司產(chǎn)品)復(fù)染。用蔡司(Iamger.A2)熒光顯微鏡,在熒光通道下觀察間期細胞的熒光雜交信號,至少分析200個細胞,不計數(shù)重疊細胞。
1.2.3 FISH結(jié)果的判讀 分析200個細胞。1q21(CKS1B)基因擴增:紅色熒光標記CKS1B(1q21)探針,正常信號模式為2R(注:R為紅色信號),陽性結(jié)果判斷閾值6.87%。t(4;14)易位形成的IGH/FGFR3融合基因:綠色熒光標記IGH(14q32)探針,紅色熒光標記FGFR3(4p16)探針,IGH/FGFR3融合基因顯示黃色或綠色與紅色疊加信號,正常信號模式為2G2R(注:G為綠色信號,R為紅色信號),陽性結(jié)果判斷閾值6.47%。t(14;16)易位形成的IGH/MAF融合基因:綠色熒光標記IGH(14q32)探針,紅色熒光標記MAF(16q23)探針,IGH/MAF融合基因顯示黃色或綠色與紅色疊加信號,正常信號模式為2G2R(注:G為綠色信號,R為紅色信號),陽性結(jié)果判斷閾值3.37%。t(14;20)易位形成的IGH/MAFB融合基因:綠色熒光標記IGH(14q32)探針,紅色熒光標記MAFB(20q12)探針,IGH/MAF融合基因顯示黃色或綠色與紅色疊加信號,正常信號模式為2G2R(注:G為綠色信號,R為紅色信號),陽性結(jié)果判斷閾值1.32%。17p13.1(p53)基因缺失:紅色熒光標記p53(17p13.1)探針,正常信號模式為2R(注:R為紅色信號),陽性結(jié)果判斷閾值6.09%(見圖1)。
圖1 FISH各探針正常圖像
1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間計數(shù)資料之間比較應(yīng)用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 FISH檢測結(jié)果 110例以硼替佐米為基礎(chǔ)誘導(dǎo)化療的NDMM中,77例骨髓細胞進行了CD38磁珠分選后1q21、t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)、17p-的FISH檢測。77例患者中陰性29例,1項異常34例,2項異常13例,3項異常1例。1q21陽性39例,其中7例合并t(4;14)陽性,4例合并17p-陽性,2例合并t(14;16)陽性,1例合并t(4;14)和17p-陽性,單純1q21陽性25例;1q21陰性38例,其中4例t(4;14)陽性,5例17p-陽性,單純1q21陰性29例;t(4;14)陽性12例,t(4;14)陰性65例;t(14;16)陽性2例,t(14;16)陰性75例;17p-陽性10例,17p-陰性67例;77例均t(14;20)陰性。見表1。
表1 FISH檢測結(jié)果[例(%)]
2.2 FISH異常各亞組以硼替佐米為基礎(chǔ)誘導(dǎo)化療的療效 FISH檢測陰性組共29例(38%),其中(0 FISH組)CR 5例,VGPR 11例,PR 6例,MR 1例,SD 6例,ORR 75.9%;FISH檢測1項異常組(1 FISH組)共34例(44%),其中CR 5例,VGPR 19例,PR 7例,MR 1例,SD 1例,PD 1例,ORR 91.2%;FISH檢測2項及以上異常組(2FISH組)共14例(18%),其中CR 4例,VGPR 7例,PR 1例,MR 1例,SD 1例,ORR 85.7%。三組ORR兩兩對比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。
圖2 FISH異常各亞組的療效
2.3 各不良預(yù)后FISH異常組以硼替佐米為基礎(chǔ)誘導(dǎo)化療的療效 25例單純1q21陽性的患者中,CR 5例,VGPR 11例,PR 6例,MR 1例,SD 1例,PD 1例,ORR 88%;29例單純1q21陰性的患者中,CR 5例,VGPR 11例,PR 6例,MR 1例,SD 6例,ORR 75.8%。兩組ORR比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.25)。見圖3。
圖3 1q21陽性與1q21陰性組的療效的比較
12例t(4;14)陽性的患者中,8例合并1q21擴增,其中1例合并17p-。12例患者中CR 4例,VGPR 8例,ORR 100%,但2例患者分別在3個月、6個月疾病進展,且1例患者發(fā)生髓外浸潤(死亡);65例t(4;14)陰性的患者中,31例1q21擴增,其中4例合并17p-,2例合并t(14;16),另34例患者中17p- 5例;29例單純t(4;14)陰性的患者中,CR 5例,VGPR 11例,PR 6例,MR 1例,SD 6例,ORR 75.8%。t(4;14)陽性與陰性組的ORR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.062)。見圖4。
圖4 t(4;14)陽性與t(4;14)陰性組療效比較
10例17p-陽性的患者中,5例合并1q21擴增,其中1例合并t(4;14),10例患者中CR 1例,VGPR 6例,PR 1例,MR 1例,SD 1例,ORR 80%,但1例患者在16個月疾病進展;67例17p-陰性的患者中,34例1q21擴增,其中7例合并t(4;14),2例合并t(14;16),另33例患者,4例t(4;14),29例單純17p-陰性(CR 5例,VGPR 11例,PR 6例,MR 1例,SD 6例,ORR 75.8%),兩組ORR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.58)。見圖5。
圖5 17p-陽性與17p-陰性組的療效的比較
本組77例行FISH檢測的患者中僅有2例t(14;16),因陽性患者較少,陽性組與陰性組之間療效未能進行比較。
多發(fā)性骨髓瘤作為一種高度異質(zhì)性的克隆性漿細胞腫瘤,其總體生存期2~10年。高異質(zhì)性除與白蛋白、β2微球蛋白、乳酸脫氫酶相關(guān)外,更重要的是細胞遺傳學(xué)的異常。由于骨髓瘤細胞的低增殖特性,傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)檢測漏掉了很多細胞遺傳學(xué)異常,因此,間期FISH(iFISH)是首選方法,可檢測大于60%的遺傳變化[2]。本組77例NDMM做了高危細胞遺傳學(xué)[17p-、t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)]及1q21的檢測,結(jié)果陽性率為62.3%,高危細胞遺傳學(xué)異常的陽性率為29.9%,與文獻報道的陽性率大致相符[2-3]。
MM患者的總體生存期很大程度上取決于腫瘤細胞的細胞遺傳學(xué)改變,因此,2015年開始在ISS分期的基礎(chǔ)上增加高危細胞遺傳學(xué)參數(shù),即目前我們廣泛采用的ISS-R臨床分期[4]。從MM長遠的生存期看,尤其是17p-患者,目前尚無藥物克服這一遺傳學(xué)的改變,使得這一高危遺傳學(xué)改變的患者總體生存期明顯縮短。在本研究的77例患者中,0 FISH組、1 FISH組、2 FISH組的陽性率分別為38%、44%、18%。0 FISH組與Grzasko等[5]報道的37.3%相似,1 FISH組大于其報道的29.8%,2 FISH組小于報道的32.9%。本研究中,3組CR率分別為17.2%、14.7%、28.7%,CR+VGPR率分別為55.1%、70.6%、78.7%,結(jié)果表明,F(xiàn)ISH檢測異常數(shù)目增加,但緩解率并沒有下降(不除外各組患者應(yīng)用除硼替佐米之外的其他藥物所致的高緩解率)。
近年對于17p-、t(4;14)數(shù)據(jù)研究較多,而t(14;16)在骨髓瘤中發(fā)生率較低,約3%~5%[6-7]。Avet-Loiseau等[6]回顧性分析1 003例新診斷的多發(fā)性骨髓瘤患者t(14;16),發(fā)現(xiàn)染色體易位發(fā)生率較低,僅為3.2%(32例)。進一步按照細胞遺傳學(xué)的改變,我們對1q21、t(4:14)及17p-進行了緩解率的比較。
IMWG 1q21擴增尚不屬于高危細胞遺傳學(xué)[8],大多數(shù)研究證明其具有不良預(yù)后意義,其存在與較短的PFS和OS有關(guān)[9]。1q21的擴增對預(yù)后的影響主要與擴增的拷貝數(shù)相關(guān),擴增拷貝數(shù)>3對生存的負影響已成為定論[10]。本組77例患者中1q21陽性39例,但15例患者合并了其他高危的細胞遺傳學(xué)改變,38例1q21陰性的患者中,9例合并了其他高危的細胞遺傳學(xué)改變,為避免其他細胞遺傳學(xué)的影響,我們對單純1q21陽性和陰性患者的緩解率進行了比較,兩組CR率分別為20%、17.2%,CR+VGPR分別為64%、55.1%,可見1q21的擴增并沒有影響以硼替佐米為基礎(chǔ)誘導(dǎo)化療的療效。同樣Chen等[11]研究中,1q21陽性硼替佐米組與非硼替佐米CR率分別為52.94%、10%(P=0.019),可見硼替佐米可改善1q21陽性緩解率的負面影響。
由于硼替佐米的一線應(yīng)用,t(4;14)異常這一高危細胞遺傳學(xué)改變已逐漸被向中危劃分[12]。本研究中,77例患者的t(4;14)陽性率為15.9%,CR率33.3%,VGPR率66.7%,與Grzasko等[5]報道的t(4;14)陽性率為16.3%相似。29例單純t(4;14)陰性的患者中,CR率17.2%,VGPR率37.9%,與 Mateos等[13]結(jié)論相似(VMP/VTP誘導(dǎo)化療后包括17p-在內(nèi)的高危組CR率24%,標危組25%),表明t(4;14)不影響硼替佐米的緩解率。
盡管MM新的治療藥物不斷涌現(xiàn)[14],目前仍沒有藥物能夠克服17p-的不良預(yù)后,17p-仍然是MM最高危的細胞遺傳學(xué)改變,短期內(nèi)硼替佐米誘導(dǎo)可改善t(4;14)患者的預(yù)后,但不能改善del(17p)患者的預(yù)后[12]。本研究中的77例NDMM患者,17p-的陽性率12.9%,CR率10%,VGPR率60%,ORR 80%。與Cohen等[15]回顧性研究中,應(yīng)用硼替佐米誘導(dǎo)治療17p-總緩解率為85%一致。17p-陰性29例患者中,CR率17.2%,VGPR率37.9%,與Liu等[16]報道一致,17p-陽性和陰性患者短期緩解率差異不顯著,表明17p-陽性不影響硼替佐米的緩解率。
NDMM細胞遺傳學(xué)改變很大程度上影響患者的總生存期,但從短期療效看,即使存在高危細胞遺傳學(xué)改變,也不影響硼替佐米的緩解率。因此,硼替佐米仍然是NDMM患者的首選用藥。