老年人腸道乳酸菌的分離與鑒定及其來源發(fā)酵乳桿菌的遺傳進(jìn)化分析

張振東，王玉榮，向凡舒，侯強(qiáng)川，李寶坤，郭 壯,*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

人體腸道有大量復(fù)雜多樣的細(xì)菌，因此腸道微生物被稱為人體的“隱形器官”。腸道中的乳酸菌是最重要的一類益生菌，具有抑制有害菌群、維持腸道菌群平衡、保護(hù)腸黏膜屏障、合成維生素、降低腸道pH值、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)和調(diào)節(jié)免疫炎癥等作用[1-2]。研究表明，乳桿菌（Lactobacillus）是人類腸道中最主要的乳酸菌，同時(shí)腸道也是益生菌類乳桿菌的重要分離來源[2-3]，常見腸道源益生菌有乳球菌和雙歧桿菌等，而在種水平上發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）是重要的益生乳酸菌資源[4-5]。

發(fā)酵乳桿菌是一類呈革蘭氏陽性、兼性厭氧菌，能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，屬于專性異型乳酸發(fā)酵菌[6]，在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，還能作為益生菌，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。發(fā)酵乳桿菌能調(diào)節(jié)天然免疫與適應(yīng)性免疫，具有抗炎癥作用[7]。發(fā)酵乳桿菌廣泛存在于發(fā)酵食品，人體與動(dòng)物的口腔、腸道等生境[4,6,8]。目前用作益生菌的菌株主要來自人體[4,9]，對(duì)人體的唾液、乳及腸道的益生菌研究較多，但是對(duì)腸道來源的發(fā)酵乳桿菌研究較少。

益生菌的一些重要特征，往往與特定的亞種或株相關(guān)，因此對(duì)發(fā)酵乳桿菌的分子分型研究，將有助于篩選具有潛在益生特性的菌種資源。分子分型技術(shù)包括擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)[10]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA片段[10]、脈沖場凝膠電泳[11-12]、多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）[11-12]和多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析[12]等，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定、分型溯源、種群結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化分析。MLST往往能反映更多的遺傳信息，更好地反映種群進(jìn)化情況，且有豐富的數(shù)據(jù)庫支撐，因此應(yīng)用更為廣泛。

對(duì)乳桿菌的遺傳進(jìn)化研究表明，一些乳桿菌的進(jìn)化和多樣性與地理分布或分離源相關(guān)[13-14]，如同一面團(tuán)來源的L.sanfranciscensis遺傳多樣性較低，而不同面團(tuán)來源的L.sanfranciscensis則遺傳多樣性較高[15]，傳統(tǒng)發(fā)酵食品來源的發(fā)酵乳桿菌則與分離源及地理分布不相關(guān)[16]。為明確老人腸道來源與發(fā)酵食品來源的發(fā)酵乳桿菌間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，本研究對(duì)湖北襄陽市與恩施市老年人腸道的乳酸菌進(jìn)行分離與鑒定，并基于持家基因，與已發(fā)表發(fā)酵乳桿菌共同進(jìn)行MLST分析[16]，以期為發(fā)酵乳桿菌的篩選、開發(fā)與溯源，并為其遺傳進(jìn)化研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)菌基因組總DNA提取試劑盒DP302 天根生化科技（北京）有限公司；Pfu高保真DNA聚合酶、DNA Marker DL2000、dNTP混合物 寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨、酵母粉 英國Oxoid公司；MRS（de Man, Rogosa and Sharpe）培養(yǎng)基[17]青島海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像系統(tǒng)美國ProteinSimple公司；CT15E臺(tái)式高速離心機(jī) 日本日立公司；BG-160隔水式培養(yǎng)箱 上海博訊公司；瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 北京六一生物科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；HR40-IIB2型生物安全柜 青島海爾公司；DG250厭氧工作站 英國Don Whitley公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

于2018年1月從湖北襄陽市龐公雪美養(yǎng)老公寓和漢丹社區(qū)招募到10 名健康的老人志愿者，從恩施市六角亭老街坊敬老院和花果山社會(huì)福利院征募到20 名老人志愿者（要求：年齡在65～94 歲之間，身體健康，短期內(nèi)（近兩周）未服用藥物）。首先使用無菌采樣勺將糞便樣品收集到無菌離心管中，裝入內(nèi)置冰袋的采樣箱后，快速送到實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 菌株分離

乳酸菌的分離使用倍比稀釋涂布法。首先添加無菌生理鹽水到裝有腸道糞便樣品的無菌離心管充分混勻，按照10 倍的濃度梯度進(jìn)行稀釋，選取10-4～10-6梯度的稀釋液，涂布于含有1%碳酸鈣的MRS平板，然后置于厭氧工作站（含80% N2、10% H2和10% CO2），設(shè)置溫度為37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)[18]。3～5 d后，將平板取出，使用接種環(huán)挑取帶有透明圈的疑似乳酸菌菌落，通過連續(xù)劃線法進(jìn)行純化至少3 次，經(jīng)過革蘭氏染色后鏡檢，通過細(xì)胞形態(tài)觀察確認(rèn)為純菌后，將分離到的菌株使用含有30%甘油的MRS液體培養(yǎng)基保存在-70 ℃?zhèn)溆肹18]。

1.3.3 乳酸菌的分子鑒定

使用細(xì)菌總DNA提取試劑盒獲得菌株的總DNA：取保存在-70 ℃冰箱的備用純菌，在MRS培養(yǎng)基中連續(xù)活化3 次，收集對(duì)數(shù)期的菌體細(xì)胞，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）按照說明書提取總DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢查提取到的DNA質(zhì)量。

以提取到的菌體總DNA為模板，使用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F與1495R[19]，通過PCR獲得該基因的片段。使用16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，挑取陽性克隆子測序[18]。將獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTn比對(duì)，并使用MEGA X構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.3.4 發(fā)酵乳桿菌的MLST分析

根據(jù)Dan Tong等[16]建立的發(fā)酵乳桿菌MLST分析方法，選取dnaA（染色體復(fù)制起始蛋白DnaA）、dnaK（分子伴侶DnaK）、groEL（分子伴侶GroEL）、murC（UDP-N-乙酰氨基甲酸-L-丙氨酸連接酶）、murE（UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基庚二酸酯連接酶）、pepX（X-脯氨酰-二肽氨基肽酶）、recA（重組酶A）、ropB（RNA聚合酶β亞基），共8 個(gè)持家基因進(jìn)行MLST分析。使用提取的發(fā)酵乳桿菌總DNA為模板，以發(fā)酵乳桿菌的MLST引物[16]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，然后進(jìn)行雙末端測序。將獲得的測序原件使用BioNumeric v7.6進(jìn)行序列的拼接與引物去除，并使用該軟件下載發(fā)酵乳桿菌已發(fā)表的MLST分析使用的基因序列及分離菌特征信息。將所有菌株的持家基因按照dnaA-dnaX-groEL-murC-murE-pepX-recA-ropB順序合并進(jìn)行MLST分析，包括等位基因確定、序列型（sequence type，ST）確定、構(gòu)建最小生成樹。

使用軟件LIAN v3.0[21]進(jìn)行連鎖不平衡分析，并使用SplitTree v4.0[22]分別以單個(gè)基因的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并以8 個(gè)持家基因的串聯(lián)序列構(gòu)建分裂重組樹，評(píng)價(jià)重組事件對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹的影響。使用DnaSP v6.0[23]計(jì)算各個(gè)持家基因的平均G+C含量、多態(tài)性位點(diǎn)、多樣性（π）值，并通過Tajima’s D檢驗(yàn)持家基因在進(jìn)化過程中是否遵循中性進(jìn)化模型。使用paml v4.7j[24]，基于零假設(shè)（Null hypothesis）計(jì)算每個(gè)持家基因的Ka/Ks（即非同義替換率與同義置換速率的比值），進(jìn)行選擇壓力分析。使用PHYLOViZ v2.0a[25]軟件的goeBURST算法對(duì)發(fā)酵乳桿菌不同基因型進(jìn)行分組和聚類，以明確菌株之間的進(jìn)化關(guān)系。使用MEGA X內(nèi)置的ClustalW對(duì)8 個(gè)持家基因分別進(jìn)行多重比對(duì)，然后使用bioedit v7.0.5.2將比對(duì)后對(duì)齊的序列按照dnaA-dnaX-groEL-murC-murE-pepX-recA-ropB順序串聯(lián)合并，使用MEGA X軟件基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，檢驗(yàn)次數(shù)為1 000 次，使用FigTree v1.4.3展示系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 核酸序列登錄號(hào)

本實(shí)驗(yàn)所用的核酸序列均提交到NCBI網(wǎng)站，乳酸菌分離株的16S rRNA基因序列登錄號(hào)為MH473232～MH473259、MH473261～MH473273、MH473275～MH473284、MH473286～MH473319、MH473321～MH473335；選用的8 個(gè)持家基因登錄號(hào)為MT620776～MT620950、MT603636～MT603660。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離與鑒定

從30 份老人糞便樣品中，共分離純化了75 株菌，其中從襄陽市老年人腸道糞便樣品中分離到22 株，從恩施市樣品中分離到53 株。對(duì)乳酸菌進(jìn)行鏡檢，所有乳酸菌均呈革蘭氏陽性，細(xì)胞形態(tài)有桿狀和球狀，部分乳酸菌菌落與鏡檢圖片見圖1。

圖1 部分乳酸菌菌落（A）與細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.1 Colony (A) and cell morphology (B) of selected LAB strains

對(duì)75 株乳酸菌的菌體總DNA進(jìn)行提取，以此為模板進(jìn)行16S rRNA片段的PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物的DNA片段長度約為1.5 kb[26]，符合細(xì)菌16S rRNA片段的大小。對(duì)這些乳酸菌的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆與測序，將得到的DNA序列去除引物序列后，在NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 老年人腸道乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of LAB strains isolated from the gut of elderly people

從襄陽市和恩施市健康老人腸道中分離到的乳酸菌75 株，鑒定為5 個(gè)菌屬，分別為雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳桿菌屬、乳球菌屬（Lactococcus）和鏈球菌屬（Streptococcus）共15 個(gè)種。從襄陽市健康老人腸道分離到的乳酸菌共22 株：1 株長雙歧桿菌（B.longum），2 株糞腸球菌（E.faecalis），4 株屎腸球菌（E.faecium），3 株海氏腸球菌（E.hirae），1 株格氏乳桿菌（L.gasseri），3 株黏膜乳桿菌（L.mucosae），2 株植物乳桿菌（L.plantarum），4 株唾液乳桿菌（L.salivarius），1 株格氏乳球菌（L.garvieae），1 株S.lutetiensis；從恩施市健康老人腸道共分離到乳酸菌53 株：1 株鳥腸球菌（E.avium），1 株糞腸球菌（E.faecalis），8 株屎腸球菌（E.faecium），1 株泰國腸球菌（E.thailandicus），17 株發(fā)酵乳桿菌，2 株黏膜乳桿菌，2 株植物乳桿菌（L.plantarum），1 株羅伊氏乳桿菌（L.reuteri），19 株唾液乳桿菌（L.salivarius），1 株S.pasteurianus。結(jié)合董蘊(yùn)等[27]研究結(jié)果看，發(fā)酵乳桿菌占老年人總?cè)樗峋蛛x株的25.5%，而唾液乳桿菌占29.6%，共占55%。這兩種乳酸菌屬于衛(wèi)生部頒布的可用于食品的菌種，而腸道是這兩種乳酸菌的重要分離來源。由于發(fā)酵乳桿菌在益生菌開發(fā)和食品工業(yè)中的重要性，接下來對(duì)圖2中的發(fā)酵乳桿菌進(jìn)行分子分型分析。

2.2 持家基因序列多樣性分析

使用paml v4.7j軟件與DnaSP v6.0軟件對(duì)分離到的25 株發(fā)酵乳桿菌的8 個(gè)看家基因（dnaA、dnaK、groEL、murC、murE、pepX、recA和rpoB）進(jìn)行分析，其等位基因多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量、G+C含量、核苷酸多樣性、Ka/Ks等的計(jì)算結(jié)果見表1。

表1 用于MLST分析的持家基因序列多樣性Table 1 Diversity of eight house-keeping gene sequences used for MLST analysis

對(duì)測序結(jié)果的分析表明，用作MLST分析的8 個(gè)持家基因的長度為255（dnaA）～613 bp（murC），合并后序列總長度為3 862 bp。將分離到的25 株發(fā)酵乳桿菌與已發(fā)表的發(fā)酵乳桿菌共同進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在這8 個(gè)持家基因中，等位基因數(shù)量為14～30 個(gè)，其中pepX的等位基因數(shù)量最多，dnaA和groEL的等位基因數(shù)量最少，分別為14 個(gè)和15 個(gè)。8 個(gè)持家基因的多態(tài)性位點(diǎn)為17～37 個(gè)，murC基因的多態(tài)性位點(diǎn)最多，為37 個(gè)，而groEL和rpoB的多態(tài)性位點(diǎn)最少，均為17 個(gè)。從G+C含量上看，基因pepX最高，為65%，而dnaA基因的G+C含量最低，為48.3%。通常可以用Ka/Ks值判斷生物在進(jìn)化過程中基因是否受到環(huán)境因素的選擇壓力作用[28]。本研究中，這8 個(gè)基因的Ka/Ks值在0.079 25（dnaA）～0.472 02（pepX）之間，均小于1，且均大于已報(bào)道的發(fā)酵食品中發(fā)酵乳桿菌的Ka/Ks值，表明它們大多進(jìn)行同義替換，在進(jìn)化過程中更多受到純化選擇作用，且在老年人腸道環(huán)境中受到的純化選擇作用更強(qiáng)。Tajima’s D統(tǒng)計(jì)檢測能鑒定基因在進(jìn)化過程中是否符合中性理論模型，即是否受到選擇壓力作用。如果Tajima’s D值小于0，表明檢測的基因受到純化選擇作用，而該值大于0，表明受到多樣化選擇作用[29]。本研究中，選擇的8 個(gè)持家基因的Tajima’s D值均小于0，表明它們均受到純化選擇作用，與使用paml v4.7j計(jì)算的Ka/Ks值分析結(jié)果一致。

2.3 ST型劃分

使用BioNumeric v7.6軟件對(duì)227 株不同來源的發(fā)酵乳桿菌依據(jù)選擇的8 個(gè)持家基因進(jìn)行了分析，結(jié)果表明這227 個(gè)發(fā)酵乳桿菌可以劃分為75 個(gè)ST型。ST型劃分如下：ST34、ST39、ST60、ST62和ST63菌有2 株菌；ST26、ST33、ST36、ST44、ST46、ST48、ST51、ST64、ST67、ST69和ST75均有3 株菌；ST49和ST58各有4 株菌；ST43和ST54和ST74各有5 株菌；ST31、ST41和ST57分別含有6、7 株和8 株菌；而ST45、ST30和ST29所含的菌株最多，分別為16、23 株和53 株。進(jìn)一步來說，分離自襄陽與恩施地區(qū)老人的發(fā)酵乳桿菌25 株，劃分為25 個(gè)ST型，且來源于其他環(huán)境中的菌株均不屬于這25 個(gè)ST型，表明這2 個(gè)地區(qū)老人腸道中的發(fā)酵乳桿菌多樣性較高，可能是受到腸道環(huán)境的影響所致。

2.4 持家基因重組分析

在進(jìn)行多序列分子分型分析中，通常使用LIAN v3.0分析持家基因是否存在基因重組情況[21]。經(jīng)計(jì)算，所選取的8 個(gè)持家基因（dnaA、dnaK、groEL、murC、murE、pepX、recA和rpoB）的IAS值為0.456 5（P＜0.01），顯著高于0，因此存在克隆結(jié)構(gòu)，即這8 個(gè)持家基因連鎖不平衡。

使用SplitTree v4.0軟件分別構(gòu)建了8 個(gè)持家基因構(gòu)建了分裂重組分析圖，結(jié)果見圖3。在這8 個(gè)基因中，僅基因pepX和rpoB出現(xiàn)了明顯的平行四邊形結(jié)果，說明可能這兩個(gè)基因在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了基因重組事件，而其他基因未出現(xiàn)或出現(xiàn)了不明顯的平行四邊形，說明未經(jīng)歷或者經(jīng)歷了很少的基因重組事件。此外，基于SplitTree v4.0的phi-test分別檢驗(yàn)了8 個(gè)持家基因是否發(fā)生了重組事件（表1），結(jié)果顯示，這8 個(gè)持家基因發(fā)生重組事件的P值為0.007 931（rpoB）～1（dnaA和murE）之間，僅rpoB存在極顯著的重組現(xiàn)象，這與分裂重組圖一致；而8 個(gè)持家基因串聯(lián)序列的phi-test（P=1.22×10-4）表明，整體上發(fā)酵乳桿菌在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了重組事件[22,30]。

圖3 發(fā)酵乳桿菌8 個(gè)持家基因的等位基因分裂重組分析Fig.3 Split decomposition analysis of L.fermentum based on alleles of eight house-keeping genes

由圖4可知，除了少量ST型外，發(fā)酵乳桿菌菌株劃分的75 個(gè)ST型中的68 個(gè)可以劃分成6 個(gè)譜系，多數(shù)譜系存在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表明在發(fā)酵乳桿菌進(jìn)化過程中，發(fā)生了基因重組事件，該結(jié)果與phi-test結(jié)果一致。需要特別注意的是，一半以上（68%）來源于老年人腸道的發(fā)酵乳桿菌ST型聚集于譜系I中。譜系I中除了ST56和ST72外，無其他ST型劃入譜系I，這些譜系I中的老人腸道來源的發(fā)酵乳桿菌具有相近且獨(dú)特的進(jìn)化關(guān)系。另外，譜系V的多數(shù)ST型和VI的全部ST型由來源于老人腸道的發(fā)酵乳桿菌組成。

圖4 發(fā)酵乳桿菌8 個(gè)持家基因串聯(lián)序列的等位基因分裂重組分析圖Fig.4 Split decomposition analysis of L.fermentum based on concatenated allele sequences of eight house-keeping genes

2.5 ST型的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步明確各ST型間的進(jìn)化關(guān)系，使用選定的8 個(gè)持家基因串聯(lián)序列構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖5。由227 株發(fā)酵乳桿菌劃分成的ST型，可以劃分為5 個(gè)譜系，其中譜系II和譜系IV分別含有6 個(gè)和7 個(gè)來源于腸道的ST型；腸道來源的其他10 個(gè)ST型則分散分布與其他譜系中（譜系I中含6 個(gè)腸道來源的ST型，譜系III中含有2 個(gè)，譜系V中含有2 個(gè)）；與分裂重組分析圖類似的是，腸道來源的ST型18和19則單獨(dú)存在，未與其他ST型聚集在一起。這些結(jié)果表明腸道來源的發(fā)酵乳桿菌具有一定的宿主特異性，但是特異性并不強(qiáng)。

圖5 基于持家基因75 個(gè)ST型的串聯(lián)序列的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbor-joining phylogenetic tree obtained from the concatenated nucleotide sequence of 75 ST types

2.6 基于goeBURST算法的進(jìn)化分析

使用PHYLOViZ v2.0a軟件通過goeBURST算法能將BioNumeric v7.6劃分的等位基因進(jìn)行分組和聚類，劃分成不同的BGs（BURST group）[25]。由圖6可知，227 株菌的75 個(gè)ST型可以分為4 個(gè)BGs（BG1、BG2、BG3和BG4）和54 個(gè)獨(dú)特型，4 個(gè)BGs共包含215 株菌，占227 株菌的94.7%。BG1所包含的ST型和菌株最多，占總菌株數(shù)的90.3%。通常來說，BG1含有來源于老人腸道的ST型為ST4、ST5、ST8、ST9、ST10以及ST16、ST17、ST21和ST22，前5 個(gè)ST型以來源于酸粥的ST56為首要奠基者（primary founder），可能由ST56演化而來；后4 個(gè)ST型以分離自酸粥的ST62為首要奠基者。雖然BG1中包含了9 個(gè)不同的ST型，但是它們分別以ST56和ST62為中心，表明它們同樣受到老人腸道環(huán)境的影響，卻朝著兩個(gè)不同的方向進(jìn)化。

圖6 基于goeBURST算法的75 個(gè)STs型的譜系分析Fig.6 Clonal complex analysis of 75 STs based on goeBURST algorithm

此外，來源于恩施老人腸道的ST6、ST7、ST13、ST14、ST15和來源于襄陽老人腸道的ST23組成了BG2。在BG2中，ST15位于奠基者位置，可能其他ST型均由該型進(jìn)化而來。另外，來源于襄陽老人腸道的ST20和ST25組成了BG3，來源于恩施老人腸道的ST1和ST4組成了BG4。這些形成了特定譜系的腸道來源的發(fā)酵乳桿菌占總的腸道來源的發(fā)酵乳桿菌的40%，有24%的ST型作為獨(dú)特性存在，可能是由于老人腸道生境與其他發(fā)酵食品的環(huán)境差異較大所致，形成了有別于發(fā)酵食品源發(fā)酵乳桿菌譜系的新譜系[16]。

2.7 最小生成樹分析

基于Prim’s算法，使用BioNumeric v7.6構(gòu)建了最小生成樹（圖7），以進(jìn)一步分析納入本研究的227 株菌間的進(jìn)化關(guān)系。由圖7可知，227 株菌劃分的75 個(gè)ST型可以分為3 個(gè)大的分支，分別是A、B和C，圖中橘紅色圈代表源于老年人腸道的ST型。定義一個(gè)克隆譜系（clone complex，CC）至少含有2 個(gè)ST型。

圖7 227 株發(fā)酵乳桿菌最小生成樹Fig.7 Minimum spanning tree of 227 strains of L.fermentum

A分支包含1 個(gè)最大的克隆復(fù)合體CC1和10 個(gè)ST型，包含131 株菌。A分支包含的克隆復(fù)合體CC1含有的菌株數(shù)量是所有克隆復(fù)合體中最多的，并且A分支中其他未歸為CC1的ST型均來源于老人腸道，連成了2 個(gè)小分支，其中一個(gè)小分支包含4 個(gè)ST型，分別是ST11、ST12、ST18和ST24，它們均與CC1中分離自內(nèi)蒙古酸粥的ST50進(jìn)化關(guān)系最近，但是并未形成一個(gè)克隆復(fù)合體；另一個(gè)分離自腸道的小分支包含ST6、ST7、ST14、ST15和ST23，均與分離自蒙古酸奶的ST35進(jìn)化關(guān)系最近。其中ST6、ST7、ST11、ST12、ST14、ST15均來源于湖北恩施，而ST23、ST24來源于湖北襄陽，但是形成了不同的分支，表明盡管這些ST型來源于湖北不同地區(qū)，而這種環(huán)境因素的差異尚不足以使這些發(fā)酵乳桿菌朝著不同的方向進(jìn)化。

B分支包含5 個(gè)克隆復(fù)合體和11 個(gè)ST型，共容納了64 株發(fā)酵乳桿菌。B分支中來源于腸道的共有4 個(gè)ST型，其中ST16、ST17與分離自內(nèi)蒙古酸粥的ST53、ST66組成了一個(gè)克隆復(fù)合體CC8；另外兩個(gè)ST21和ST22則屬于獨(dú)特型。C分支含有3 個(gè)克隆復(fù)合體和13 個(gè)ST型，包括32 株菌。C分支中含有的分離自老人腸道的發(fā)酵乳桿菌最多，有11 株。C分支中來源于腸道的ST20和ST25組成了克隆復(fù)合體CC7，ST4和ST56則組成了克隆復(fù)合體CC6，而這與基于goeBURST算法的分析結(jié)果一致。

基于BioNumeric v7.6的分析表明，盡管來源于老人腸道的發(fā)酵乳桿菌同時(shí)位于A、B和C分支上，然而，不同分離來源的發(fā)酵乳桿菌趨近于聚集在一起，且多數(shù)情況下，這些聚集的分支中不含有發(fā)酵食品來源的發(fā)酵乳桿菌，進(jìn)一步表明了老人腸道與發(fā)酵食品的環(huán)境差異對(duì)發(fā)酵乳桿菌的影響。

3 討 論

人體腸道中分布豐富的乳酸菌。研究顯示，發(fā)酵乳桿菌對(duì)人體具有多種有益作用，還能被開發(fā)為發(fā)酵食品的發(fā)酵劑，有較高的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值[31-32]。通過可培養(yǎng)方法對(duì)湖北省襄陽和恩施地區(qū)健康老人腸道乳酸菌進(jìn)行了分離與鑒定，結(jié)果顯示得到的主要細(xì)菌是發(fā)酵乳桿菌和唾液乳桿菌，分別占總分離菌株的25.5%和29.6%。該結(jié)果與對(duì)廣西地區(qū)青年人腸道乳酸菌分離的結(jié)果類似[33]，表明無論是青年人還是老年人腸道中，均存在豐富的發(fā)酵乳桿菌和唾液乳桿菌資源。

發(fā)酵乳桿菌是食品工業(yè)中的一個(gè)重要菌種，對(duì)其開發(fā)具有重要的社會(huì)效益，因而有必要對(duì)發(fā)酵乳桿菌的遺傳背景的進(jìn)行明確?；诔旨一蛐蛄械腗LST分析被認(rèn)為是最好的細(xì)菌分子分型方法。本研究通過8 個(gè)持家基因序列，將從老人腸道中獲得的發(fā)酵乳桿菌25 株與文獻(xiàn)報(bào)道的發(fā)酵食品來源的發(fā)酵乳桿菌共227 株，共同進(jìn)行了MLST分型分析。結(jié)果顯示這227 株菌共可以分為75 個(gè)ST型，而其中來自老年人腸道的25 株菌被分成了25 個(gè)ST型，這顯示人體腸道中的發(fā)酵乳桿菌多樣性較高，遠(yuǎn)高于其他來源的發(fā)酵乳桿菌[16]。

與羅伊氏乳桿菌等[34]不同，發(fā)酵乳桿菌具有一定的宿主特異性。根據(jù)持家基因的SpliTree分析，本研究中60%左右來源于腸道的發(fā)酵乳桿菌的ST型聚集在同一個(gè)譜系，且其中含有很少的其他環(huán)境來源的ST型；同樣goeBURST算法也表明，健康老人腸道來源的發(fā)酵乳桿菌單獨(dú)形成了有別于發(fā)酵食品環(huán)境來源的ST型的2 個(gè)新譜系；且最小生成樹分析也表明，健康老人腸道來源的發(fā)酵乳桿菌組成了4 個(gè)支鏈，2 個(gè)新的克隆譜系。這些現(xiàn)象提示來源于腸道的發(fā)酵乳桿菌具有一定的宿主特異性，但是并未聚集在一起形成同一個(gè)譜系，因此宿主特異性并不強(qiáng)。為適應(yīng)腸道環(huán)境，發(fā)酵乳桿菌經(jīng)歷了與來源于發(fā)酵食品環(huán)境的發(fā)酵乳桿菌有異的進(jìn)化過程，進(jìn)一步凸顯了環(huán)境因素在物種進(jìn)化中的作用，同時(shí)也表明人體腸道環(huán)境的特殊性。

總的來說，通過可培養(yǎng)方法，從健康老人與青年人腸道中分離到的乳酸菌中發(fā)酵乳桿菌和唾液乳桿菌占比較高?；? 個(gè)持家基因的MLST分析，無論是通過最小生成樹還是goeBUST算法，部分從健康老人腸道中得到的25 株發(fā)酵乳桿菌傾向于形成3～4 個(gè)分支，因此其具有一定的宿主特異性，表明來源于腸道的部分發(fā)酵乳桿菌為適應(yīng)腸道環(huán)境，可能經(jīng)歷了與來源于發(fā)酵食品環(huán)境的發(fā)酵乳桿菌有異的進(jìn)化過程。該研究為發(fā)酵乳桿菌的篩選與開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。