陳志云 秦長生 王 玲 徐金柱李東文 莫 羨 趙丹陽 楊 華

（1.中山市林業(yè)有害生物防治檢疫站，廣東 中山 528403；2.廣東省林業(yè)科學(xué)研究院/廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣東 廣州 510520）

橙帶藍尺蛾Milionia basalis（鱗翅目Lepidoptera；尺蛾科Geometridae），主要危害羅漢松屬和陸均松屬植物，在廣西有該蟲對竹柏Podocarpus nagi造成危害的報道[1]。該蟲以幼蟲危害葉片，大爆發(fā)時可將整株植株全部吃光，嚴重影響植株生長及品質(zhì)。同時成蟲具有一定的遷飛能力；幼蟲、卵、蛹等亦可隨植株轉(zhuǎn)移進行遠距離傳播。該蟲在我國廣西省博白[1]、浙江省杭州[2]、廣東省深圳[3]、陽春、肇慶[4]、江西省大余縣[5]、海南省及臺灣地區(qū)均有發(fā)生。

昆蟲病原真菌對多種農(nóng)林業(yè)害蟲具有高毒力，對環(huán)境友好。多年來，作為一種重要的害蟲防治措施受到廣泛研究。因侵染過程涉及多種因素作用，寄主一般難于產(chǎn)生抗藥性，此外，病原真菌還能在土壤中大量宿存，不但可以寄生昆蟲，而且能夠在生態(tài)系統(tǒng)中寄主昆蟲缺乏的情況下在不同環(huán)境下營腐生生活，在適宜條件下能隨蟲口的增加而大量繁殖，與害蟲的發(fā)生保持較好的一致性，能起到對害蟲持續(xù)控制的作用。但是也有一些不可避免的缺點，例如防治效果較為緩慢；控制有害生物的范圍較窄；易受到環(huán)境因素的制約和干擾等。

將化學(xué)殺蟲劑和生物農(nóng)藥的聯(lián)合應(yīng)用可以有效避免或緩解化學(xué)殺蟲劑和生物農(nóng)藥的防治弊端[6-9]。但目前關(guān)于橙帶藍尺蛾生物防治的相關(guān)報道較少，因此本文以8 株具有較高毒力的昆蟲病原真菌（7株綠僵菌和1 株白僵菌）為研究對象，分別測定其對橙帶藍尺蛾2～3 齡幼蟲的室內(nèi)毒力。并針對已篩選出的高毒力菌株，探究其與4 種高效低毒的化學(xué)藥劑混用對橙帶藍尺蛾的協(xié)同致死作用，為協(xié)調(diào)橙帶藍尺蛾的化學(xué)防治與生物防治提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試昆蟲 橙帶藍尺蛾飼養(yǎng)參考Yoshinori Shintani[10]的飼養(yǎng)方法，成蟲采集于廣東省中山市，放在塑料保鮮盒里帶到實驗室。將收集的成蟲根據(jù)腹部頂端的形態(tài)進行性別鑒定，可見到產(chǎn)孵瓣者為雌性，可見抱握器者為雄性，將雌雄成蟲按照1 ∶3 的比例置于三面尼龍網(wǎng)的 (34 cm×25 cm×34 cm)昆蟲籠中，籠底放置一層報紙。以20%蜂蜜水進行飼喂。養(yǎng)蟲籠置于25℃（光周期為L ∶D=16 ∶8）條件下。將羅漢松Podocarpus macrophyllus的枝條（高約30 cm 長，直徑約3 cm）放置于籠中作為產(chǎn)卵處。用小毛筆和鑷子將產(chǎn)于樹枝上的卵塊收集至培養(yǎng)皿中（直徑9 cm），培養(yǎng)皿內(nèi)放入保濕的紙巾，在25 ℃下光照培養(yǎng)，光周期為16L ∶8D，相對濕度 70%。幼蟲孵化后，每30 只一組，用小毛筆將其轉(zhuǎn)移到每一個培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)皿底部鋪上保濕的紙巾。以羅漢松葉片進行飼喂，每日補充葉片。待幼蟲蛻皮1 次后，將2 齡幼蟲移入15 cm 培養(yǎng)皿中用于室內(nèi)毒力測定。

1.1.2 供試菌株 供試驗的菌株由廣東省林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)生物殺蟲劑團隊保藏（表1），各菌株均用馬鈴薯蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PPDA 培養(yǎng)基）連續(xù)培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 待篩選菌株來源Table 1 Origin of 8 entomopathogenic fungi

1.1.3 化學(xué)藥劑 5%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑（美國杜邦公司）；1.2%煙堿·苦參堿乳油（內(nèi)蒙古赤峰市帥旗農(nóng)藥有限責(zé)任公司）；2.5%高效氯氟氰菊酯懸浮劑（南京紅太陽股份有限公司）；3%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽水乳劑（廣西田園生化股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 橙帶藍尺蛾高毒力菌株篩選 采用噴霧塔法進行綠僵菌和白僵菌對橙帶藍尺蛾的室內(nèi)毒力測定，將供試菌株配制成濃度為1×108孢子/mL的孢子懸浮液備用，將橙帶藍尺蛾2～3 齡幼蟲的培養(yǎng)皿置于噴霧塔的載物上，每次噴霧體積為2 mL，每組處理幼蟲 30 頭，重復(fù) 3 次，將處理后試蟲幼蟲重新放入9cm 培養(yǎng)皿中置于培養(yǎng)箱中，于25 ℃、相對濕度 70% 、光周期16L:8D 條件下培養(yǎng)，以羅漢松葉片進行飼喂并且每日觀察死亡情況。用鑷子輕觸蟲體，不能活動者視為死亡。根據(jù)公式計算校正死亡率。

根據(jù)上述結(jié)果篩選出致病力較好的病原菌株，用0.05%吐溫-80 水溶液依次將其稀釋為1×108孢子/mL、1×107孢子/mL、1×106孢子/mL、1×105孢子/mL、1×104孢子/mL，采用噴霧法對橙帶藍尺蛾2～3 齡幼蟲進行處理，方法同上，以0.05%吐溫-80 水溶液為空白對照。根據(jù)校正死亡率與藥劑濃度進行回歸分析，得到毒力回歸方程及致死中濃度LC50。

1.2.2 綠僵菌和化學(xué)藥劑的最佳混配試驗 根據(jù)上述結(jié)果將已經(jīng)篩選出來的高毒力綠僵菌菌株配成孢子濃度為1.00×108孢子/mL 的懸浮液，化學(xué)藥劑分別配成試蟲死亡率保持在30%～70%的濃度，5%氯蟲苯甲酰胺為25 ug/mL；1.2%煙堿·苦參堿乳油為12 ug/mL；2.5%高效氯氟氰菊酯懸浮劑為12.5 ug/mL；3%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽為15 ug/mL。采用噴霧法，每組處理幼蟲30 頭，重復(fù) 3 次，處理第3 天統(tǒng)計死亡數(shù)量，計算死亡率。根據(jù)Mansour[11]的協(xié)同毒力指數(shù)（c.f）定性評判混用的聯(lián)合作用，其中c.f ≥20 時為增效作用，c.f ≤-20 時為拮抗作用，-20 ＜c.f ＜20 時為相加作用。

混劑理論死亡率Pm= 1-(1-Pa)×(1-Pb)，Pa、Pb分別為各單劑的試蟲死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行處理分析，采用Duncan 氏新復(fù)極差測驗進行差異顯著性分析。并運用Probit 機率值分析法求出毒力回歸方程、致死中時間LT50、致死中濃度LC50、95%置信區(qū)間等。

2 結(jié)果與分析

2.1 8 株昆蟲病原真菌對橙帶藍尺蛾2～3 齡幼蟲室內(nèi)毒力

采用定量噴霧法測定了8 株昆蟲病原真菌對橙帶藍尺蛾幼蟲的室內(nèi)毒力，從死亡率隨時間變化的趨勢來看（圖 1），不同菌株均表現(xiàn)出相同趨勢，即幼蟲死亡率隨著處理時間的延長而逐步增大。接種后1～2 d 未出現(xiàn)死蟲，第3 天部分菌株處理組開始出現(xiàn)幼蟲行動遲緩甚至死亡現(xiàn)象，死亡高峰基本出現(xiàn)在4～6 d（圖2）。

圖1 不同菌株對橙帶藍尺蛾2～3 齡幼蟲的毒力Fig. 1 Virulence of different strains to the 2nd-3rd instar larvae of M. basalis

圖2 不同菌株處理橙帶藍尺蛾2～3 齡幼蟲日死亡數(shù)量Fig. 2 The daily death of differemt fungi against 2nd-3rd instar larvae of M. basalis

當(dāng)孢懸液濃度為1.00×108孢子/mL 時，處理8 d 后，供試的8 株病原菌對橙帶藍尺蛾幼蟲的毒力存在顯著差異（P<0.05），校正死亡率為46.15%～98.89%，LT50值為 4.043～6.563 d（表2）。其中菌株M09、Mac985、Ma3297 和Mf1245 的校正死亡率均大于85%，分別為98.72%、96.15%、88.46%和87.18%。此外，M09、Mac985、Ma3297菌株的LT50均小于5 d，分別為4.043、4.226、4.868 d。綜合校正死亡率、LT50值，菌株M09、Mac985、Ma3297 顯示出較強的殺蟲毒力。

表2 8 株昆蟲病原真菌對橙帶藍尺蛾2～3 齡幼蟲室內(nèi)毒力Table2 Toxicity of 8 entomopathogenic fungi to M. basalis 2nd～3rd instar larvae

2.2 3 株高效綠僵菌不同濃度對橙帶藍尺蛾2～3齡幼蟲毒力

3 株綠僵菌對M09、Mac985、Ma3297 對橙帶藍尺蛾2～3 齡幼蟲的致死中濃度LC50有所不同，其中M09 的LC50最高，為1.64×104孢子/mL；Ma3297 次之，LC50為7.95×104孢子/mL；Mac985 毒力最低，LC50為1.62×106孢子/mL（表3）。

表3 M09、F985 和Ma3297 對橙帶藍尺蛾2～3 齡幼蟲的毒力Table3 Toxicity of M09, F985 and Ma3297 to M. basalis 2nd-3rd instar larvae

2.3 最佳混配組合篩選結(jié)果

以濃度為1.00×108孢子/mLM09 孢懸液與4 種化學(xué)藥劑混配后處理橙帶藍尺蛾3 齡幼蟲，致死效果都比較好，其死亡率分別為100%、92.41%、86.15%、87.50%，綠僵菌M09 與高效氯氟氰菊酯和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽混配后對橙帶藍尺蛾的聯(lián)合毒力為增效作用（表4）。

表4 混配藥劑對橙帶藍尺蛾聯(lián)合作用結(jié)果Table4 Synergism of Ma09 and 3 pesticides against M. basalis

3 結(jié)論與討論

本實驗中使用的7 株綠僵菌和1 株白僵菌均對橙帶藍尺蛾具有一定的毒力，但白僵菌毒力較弱。綠僵菌M09、Mac985、Ma3297 處理8 d 后的校正死亡率均大于85%，并且LT50小于5 d，LC50分別為1.64×104孢子/mL、1.62×106孢子/mL 和7.95×104孢子/mL，對橙帶藍尺蛾具有較強的毒力。綜合比較校正死亡率、LT50和LC50，綠僵菌M09 菌株表現(xiàn)出眾，用于與4 種化學(xué)殺蟲劑混配進行協(xié)同作用測定，結(jié)果表明4 種混配劑的致死率均大于85%，并且綠僵菌M09 與高效氯氟氰菊酯和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽混配后表現(xiàn)為增效作用。

昆蟲病原真菌是近年來國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的生物藥劑之一，近年來成為生物防治領(lǐng)域的熱點，且在多種農(nóng)林害蟲防治方面均有應(yīng)用范例。鄭宏[12]發(fā)現(xiàn)綠僵菌MaF-13 對橙帶藍尺蛾具有較強的毒力作用，以1.0×108孢子/mL 孢子懸浮液接種10 d 后幼蟲死亡率均達到100% ；LT50為3.99 d。何學(xué)友等人[13]測定了5 株綠僵菌對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力，其中MaFZ-13、MaXJ-04 菌株對幼蟲的致死率較高，以1.0×107孢子/mL 濃度處理15 d 后分別達到96.7% 、95.0% ，LT50分別為5.01、5.48 d。本實驗中3 株綠僵菌的校正死亡率在85%以上，LT50均小于5 d，由于昆蟲病原菌菌株之間具有差異性，因此所得結(jié)果與前人報道有差異，但從其校正死亡率、LT50和LC50考慮，本實驗篩選得到的3 株高毒力菌株也具有一定的生防應(yīng)用潛力。大量研究表明綠僵菌致死高峰出現(xiàn)在3～7 d，本研究中7 株綠僵菌的死亡高峰均在4～6 d 內(nèi)出現(xiàn)，與之前研究是一致的。但由于室內(nèi)毒力測定與林間試驗環(huán)境不同，通常林間防治效果結(jié)果大多在10 d 以后產(chǎn)生，因此使得昆蟲病原菌的防治時效較慢，限制了其在農(nóng)林生物防治中的應(yīng)用。為了解決這一問題，很多學(xué)者提出將昆蟲病原菌與低劑量化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配，以達到協(xié)同增效的作用，提高防治效果，如曹偉平等人[14]將球孢白僵菌Beauveria bassianaHFW-0514 與低劑量的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和氯蟲苯甲酰胺混用后LT50均顯著降低。Chunhua Zou 等人[9]將玫煙色棒束孢Paecilomyces fumosoroseus的菌株IfB01與吡蟲啉混配具有明顯增效作用，并且LT50明顯縮短。化學(xué)藥劑可以有助于昆蟲病原真菌侵入，從而提高侵染速度，使其更容易進入蟲體內(nèi)部。提高昆蟲病原真菌的防治時效同時還可以降低化學(xué)農(nóng)藥的使用量，避免化學(xué)藥劑過多使用而產(chǎn)生的“3R”問題。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[15]，氯蟲苯甲酰胺、煙堿·苦參堿、高效氯氟氰菊酯和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對橙帶藍尺蛾用藥后7 d的林間防治效果可以達90%以上，因此本試驗選用這4 種化學(xué)藥劑與綠僵菌Ma09 進行混配，發(fā)現(xiàn)綠僵菌M09 與高效氯氟氰菊酯和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽表現(xiàn)出增效作用，綠僵菌與上述2 種殺蟲劑混用，可以縮短殺蟲時間、提高殺蟲效率、減少化學(xué)殺蟲劑的使用。本實驗中單獨使用綠僵菌M09、Mac985、Ma3297 和Mf1245 處理8 d 后校正死亡率均大于85%，效果與化學(xué)藥劑相當(dāng)且明顯，因此可以考慮在早期預(yù)防上單獨使用綠僵菌進行防治，隨著綠僵菌大規(guī)模商品化，成本亦逐年降低，僅僅略高于化學(xué)農(nóng)藥，但是效果更好更環(huán)保。但是當(dāng)高齡蟲口密度上升，突然出現(xiàn)害蟲大爆發(fā)的時候則必須考慮如何在短時間內(nèi)將蟲口密度降下來，此時綠僵菌等生物防治的時效性較長，不適用于防治，因此可以考慮使用化學(xué)藥劑和生物藥劑進行混配，在短時間內(nèi)將蟲口密度降低。本實驗中使用混配劑在防治3 d 后就表現(xiàn)出了明顯的防治效果，與化學(xué)農(nóng)藥防效相當(dāng)且比生物農(nóng)藥防治時間短，十分適合用于害蟲大爆發(fā)或者應(yīng)急性防治中。本實驗利用了綠僵菌與化學(xué)藥劑進行混配，取得了明顯的室內(nèi)試驗效果，但上述結(jié)果還需在林間試驗中進一步驗證。