查晴 肖凡 張倩茹 葉佳雯 張煜 楊玲 楊克 劉艷

鈣化性瓣膜疾病是導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣膜功能失調(diào)的常見(jiàn)原因，其主要臨床表現(xiàn)有運(yùn)動(dòng)后呼吸困難、心律失常、昏厥、心絞痛等[1-5]。在鈣化性瓣膜疾病進(jìn)展過(guò)程中，間質(zhì)細(xì)胞作為主動(dòng)脈瓣膜中主要細(xì)胞，參與胞外基質(zhì)合成和鈣化[6]。研究表明，主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞過(guò)表達(dá)Sox9可減緩鈣化進(jìn)程，而Notch通路對(duì)Sox9激活起調(diào)控作用。當(dāng)敲除Notch1與Sox9相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域后，Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)對(duì)Sox9轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用大幅削減。因此，抑制Notch信號(hào)通路可下調(diào)Sox9表達(dá)，促使主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化[7-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Sox9作為轉(zhuǎn)錄激活因子，通過(guò)直接或間接作用與其他信號(hào)通路協(xié)同參與軟骨分化形成過(guò)程。

胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是胰高血糖素降解產(chǎn)物[10]。GLP-1通過(guò)結(jié)合其特異性GLP-1受體(GLP-1R)抑制胰高血糖素分泌，刺激胰島素和促生長(zhǎng)素抑制素分泌，從而緩解胰島素抵抗[11-12]。而GLP-1R激動(dòng)劑如艾塞那肽、利拉魯肽、利西拉來(lái)等除具有降糖作用，還可減輕體質(zhì)量，降低血壓，改善血脂，減少心血管事件，提高生存率[13-16]。GLP-1R活化還可通過(guò)激活多種激酶降低心肌缺血性損傷，抑制局部缺血后重構(gòu)。本研究探討在主動(dòng)脈瓣膜鈣化過(guò)程中，GLP-1及其受體對(duì)于Notch1-Sox9信號(hào)通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM∶F12培養(yǎng)基 ( 1∶1，低糖含20%胎牛血清)、低糖培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清)、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基均購(gòu)自GIBCO公司。免疫組織化學(xué)染色試劑盒、BCA試劑盒均購(gòu)自邁新公司；Sox9、GLP-1R、NICD和β-actin一抗均購(gòu)自Abcam公司，免疫熒光檢測(cè)二抗購(gòu)自CST公司；水性封片劑(含DAPI)購(gòu)自Invitrogen公司；SYBR Green Real-time PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司。C57BL/6小鼠購(gòu)自上海斯萊克公司。

1.2 主動(dòng)脈瓣鈣化組織收集

納入2016年6月至2017年5月于上海瑞金醫(yī)院心外科和上海市第九人民醫(yī)院心外科就診的36例患者，其中16例為主動(dòng)脈瓣病變患者，排除風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病及炎癥性疾病，行外科主動(dòng)脈瓣置換手術(shù)，設(shè)為瓣膜鈣化組；20例為因病情進(jìn)行心臟移植，但瓣膜組織無(wú)退行性病變的患者，設(shè)為對(duì)照組。于病案室收集患者基本信息，外科手術(shù)時(shí)收集患者主動(dòng)脈瓣膜組織。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審批同意，所有患者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.3 主動(dòng)脈瓣膜組織蘇木精-伊紅染色、茜素紅染色及免疫組織化學(xué)染色

外科手術(shù)時(shí)獲得瓣膜鈣化組和對(duì)照組主動(dòng)脈瓣膜組織，即刻使用4%福爾馬林液固定24 h，石蠟包埋，以5 μm厚度連續(xù)切片。

蘇木精-伊紅染色(HE染色)：切片放入蘇木精水溶液中染色5～10 min；置于醋酸及氨水中各5 s；沖洗脫水后放入伊紅染色液中染色2～3 min；脫水固定后樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。

茜素紅染色：切片放入茜素紅染色液中10 min，沖洗脫水固定后，樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。

GLP-1R免疫組織化學(xué)檢測(cè)：切片進(jìn)行抗原修復(fù)，5%馬血清封閉30 min，滴加1∶100稀釋的抗GLP-1R抗體，4 ℃過(guò)夜，加入1∶250稀釋的二抗孵育30 min，沖洗二抗。DAB法顯色，復(fù)染蘇木精，脫水固定后，樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。

1.4 主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)

取4周齡C57BL/6小鼠，完整分離出主動(dòng)脈瓣膜，在無(wú)菌條件下，將主動(dòng)脈瓣膜剪為0.5 mm×0.5 mm大小組織塊，使用200 μL的胎牛血清重懸組織塊，將該組織塊懸液均勻涂布于細(xì)胞培養(yǎng)皿表面，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，1 h后取出。加入DMEM∶F12培養(yǎng)基，繼續(xù)放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)后進(jìn)行傳代。

1.5 主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)及GLP-1處理

待原代培養(yǎng)的小鼠主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)至細(xì)胞融合時(shí)，將細(xì)胞分為3組，正常培養(yǎng)組以含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，鈣化培養(yǎng)組使用鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d誘導(dǎo)鈣化，鈣化培養(yǎng)+GLP-1組在鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)同時(shí)加入終濃度為100 pmol/L的GLP-1處理7 d。

1.6 主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞茜素紅染色及免疫熒光檢測(cè)

培養(yǎng)小鼠原代主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛37 ℃固定20 min。加入茜素紅染色液染色，觀察細(xì)胞鈣化情況。

細(xì)胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛固定后，加入0.2%Triton室溫放置2 min，5%的馬血清4 ℃封閉1 h，加入抗Sox9、NICD抗體(1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜。加入相應(yīng)二抗(1∶400)，室溫孵育1 h。DAPI染色封片，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

TRIzol裂解液提取鈣化培養(yǎng)組及正常培養(yǎng)組細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)試驗(yàn)盒說(shuō)明書(shū)行qRT-PCR。Sox9上游引物5′-AGGTGCTCAAAGGCTACGACTG-3′，下游引物5′-CGCGGCTGGTACTTGTAATCC-3′；β-actin上游引物5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游引物5′-TCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Sox9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測(cè)

蛋白裂解液提取正常培養(yǎng)組、鈣化培養(yǎng)組及鈣化培養(yǎng)+GLP-1組蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗GLP-1R、SOX9、NICD、β-actin抗體 (1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化酶 (HRP)標(biāo)記的二抗 (1∶5 000)，室溫孵育2 h后加入ECL工作液顯影，ImageJ分析軟件對(duì)圖像的灰度值進(jìn)行定量，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊時(shí)，組間采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布則使用秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLP-1R在人主動(dòng)脈瓣膜鈣化組織中的定位及表達(dá)

對(duì)人主動(dòng)脈瓣組織進(jìn)行染色分析，HE染色示瓣膜鈣化組瓣膜厚度大于對(duì)照組。茜素紅染色結(jié)果顯示對(duì)照組無(wú)紅色鈣化染色區(qū)域，而瓣膜鈣化組組織中心區(qū)域呈強(qiáng)陽(yáng)性紅色染色，提示鈣化。免疫組織化學(xué)染色顯示，對(duì)照組中GLP-1R表達(dá)于瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中，并呈陽(yáng)性表達(dá)(棕色染色)，瓣膜鈣化組中雖有GLP-1R表達(dá)但較對(duì)照組呈弱表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 2組人主動(dòng)脈瓣膜組織中鈣化情況及GLP-1R表達(dá)情況

2.2 鈣化培養(yǎng)下GLP-1對(duì)原代瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中GLP-1R表達(dá)的影響

分組培養(yǎng)小鼠主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)組呈纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)狹長(zhǎng)并呈放射狀生長(zhǎng)。鈣化培養(yǎng)組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，表現(xiàn)為細(xì)胞變大，細(xì)胞核清晰但細(xì)胞輪廓邊緣不清，鈣化培養(yǎng)+GLP-1培養(yǎng)組細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)狹長(zhǎng)呈放射狀生長(zhǎng)。

茜素紅染色后，鈣化培養(yǎng)組瓣膜間質(zhì)細(xì)胞呈紅色染色，鈣化培養(yǎng)+GLP-1組較鈣化培養(yǎng)組紅色染色明顯減弱。見(jiàn)圖2。

圖2 3組小鼠主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及鈣化情況

Western blot檢測(cè)示鈣化培養(yǎng)組GLP-1R的蛋白表達(dá)水平明顯低于正常培養(yǎng)組(0.87±0.65對(duì)2.54±1.81，P=0.041)，但鈣化培養(yǎng)+GLP-1組GLP-1R的蛋白表達(dá)水平明顯高于鈣化培養(yǎng)組(2.38±1.36對(duì)0.87±0.65，P=0.021)，見(jiàn)圖3。

圖3 3組小鼠主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞GLP-1R的蛋白表達(dá)情況

2.3 GLP-1對(duì)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Sox9表達(dá)的影響

鈣化培養(yǎng)+GLP-1組Sox9的mRNA表達(dá)水平(2.14±0.21對(duì)1.01±0.01，P<0.01)、蛋白表達(dá)水平(3.21±0.93對(duì)0.49±0.15，P<0.01)均明顯高于鈣化培養(yǎng)組，見(jiàn)圖4A。免疫熒光染色顯示，鈣化培養(yǎng)+GLP-1組Sox9的蛋白表達(dá)水平明顯強(qiáng)于鈣化培養(yǎng)組，見(jiàn)圖4B。

注：A為Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Sox9的蛋白表達(dá)水平；B為免疫熒光染色檢測(cè)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Sox9的表達(dá)和定位(×200)

2.4 GLP-1對(duì)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞NICD入核的影響

鈣化培養(yǎng)組NICD入核量低于正常培養(yǎng)組。與正常培養(yǎng)組和鈣化培養(yǎng)組相比，鈣化培養(yǎng)+GLP-1組NICD入核量增加，見(jiàn)圖5。

注：DAPI發(fā)藍(lán)色熒光，顯示細(xì)胞核；NICD為紅光熒光

2.5 GLP-1對(duì)主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞NICD表達(dá)的影響

與正常培養(yǎng)組相比，鈣化培養(yǎng)組中NICD蛋白表達(dá)水平明顯下降(0.41±0.15對(duì)0.87±0.15，P<0.05)。與鈣化培養(yǎng)組相比，鈣化培養(yǎng)+GLP-1組NICD蛋白表達(dá)水平明顯升高(0.94±0.26對(duì)0.41±0.15，P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 3組小鼠主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞NICD蛋白表達(dá)情況

3 討論

研究表明，GLP-1等胰島素受體增敏劑干預(yù)阿爾茲海默癥后，可有效提高患者的認(rèn)知能力并改善腦內(nèi)病變程度[17]。GLP-1可直接通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并與腦內(nèi)分布的GLP-1R結(jié)合，參與對(duì)胰島素信號(hào)下游通路的調(diào)節(jié)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，主要為減少凋亡、抑制β樣淀粉酶(Aβ)損傷作用，并減少Tau蛋白異常過(guò)度磷酸化[18]。而這些生物學(xué)效應(yīng)均涉及細(xì)胞的退行性病變過(guò)程。在同屬于退行性病變范疇的鈣化性主動(dòng)脈瓣膜疾病中，GLP-1的作用尚不可知。本研究發(fā)現(xiàn)，鈣化的主動(dòng)脈瓣膜GLP-1R的表達(dá)水平低于正常瓣膜組織。GLP-1可抑制主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化，這提示在主動(dòng)脈瓣膜鈣化這一退行性病變中，GLP-1可能具有對(duì)抗鈣化的作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，用鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞鈣化，結(jié)果顯示鈣化處理后的細(xì)胞GLP-1R表達(dá)水平下降。

鈣化的形成是復(fù)雜而精密的細(xì)胞分子過(guò)程，Sox9的功能異常是導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣膜鈣化的主要原因[4,19-20]。為進(jìn)一步分析GLP-1R在鈣化過(guò)程中的作用，本研究使用GLP-1刺激小鼠原代瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示GLP-1能夠上調(diào)Sox9的表達(dá)，提示GLP-1可能通過(guò)Sox9調(diào)控細(xì)胞鈣化。GLP-1調(diào)控Sox9的機(jī)制目前尚不清楚，有研究表明，組織鈣化區(qū)域Notch1表達(dá)水平下降，可下調(diào)下游轉(zhuǎn)錄因子Sox9的表達(dá)[21-23]。Notch在水解后生成Notch活性片段NICD，NICD進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)控核內(nèi)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[24]。上游分子可通過(guò)改變NICD的水平和NICD入核，調(diào)控下游Sox9的表達(dá)[25]。本研究證明GLP-1可誘導(dǎo)鈣化瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中的NICD表達(dá)，使NICD入核增加，同時(shí)增加瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中Sox9表達(dá)水平。因此，GLP-1可能通過(guò)其受體GLP-1R調(diào)控Notch-1活性片段NICD及Sox9的升高，從而抑制主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化進(jìn)展。

綜上所述，在主動(dòng)脈瓣膜鈣化病變過(guò)程中，GLP-1R水平的下降使GLP-1的抗瓣膜鈣化作用減弱，而GLP-1則可通過(guò)其受體GLP-1R調(diào)控下游NICD表達(dá)及入核，進(jìn)而調(diào)控抗鈣化基因Sox9的表達(dá)，發(fā)揮抗瓣膜鈣化作用。GLP-1有望成為潛在的預(yù)防和治療主動(dòng)脈瓣膜鈣化的藥物。