DNA甲基化與魚類年齡

張?jiān)汽悾?周傳江＊

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院； 河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心；水產(chǎn)動(dòng)物疾病控制河南省工程實(shí)驗(yàn)室， 河南新鄉(xiāng) 453007）

魚類年齡是研究魚類生物學(xué)和種群生態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)，準(zhǔn)確的年齡鑒定對(duì)于魚類的生長(zhǎng)、繁殖和死亡具有重要意義， 可以更好地為漁業(yè)資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供理論支持。 傳統(tǒng)的魚類年齡鑒定方法有一定局限性，無(wú)法在不致命情況下精準(zhǔn)確定魚類年齡。多年來(lái)，表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化與衰老之間存在著密切相關(guān)性， 為探索更佳的魚類年齡鑒定方法提供了新思路。

1 魚類年齡鑒定

1.1 魚類年齡鑒定意義

年齡是生態(tài)學(xué)中最重要的因素之一， 因?yàn)樗扔绊憘€(gè)體特征，也影響種群特征。各種生物學(xué)特性隨著年齡的增長(zhǎng)而變化， 包括那些影響動(dòng)物生物學(xué)狀態(tài)的特性，例如生殖特性、行為等。 而且因?yàn)閯?dòng)物種群內(nèi)的年齡分布會(huì)顯著影響種群的維持， 所以動(dòng)物年齡也是影響動(dòng)物種群特征的一個(gè)重要因素。

在漁業(yè)種群評(píng)估和魚類生態(tài)學(xué)方面， 年齡是最重要的生物變量之一。 魚類的年齡被用來(lái)計(jì)算重要的生活史特征，如生長(zhǎng)參數(shù)、自然死亡率等。 年齡和大小是評(píng)估魚類種群結(jié)構(gòu)的最具信息性的指標(biāo)。 然而，收集年齡數(shù)據(jù)對(duì)許多魚類來(lái)說(shuō)是昂貴且有限的，對(duì)部分魚類而言， 則無(wú)法收集到直接的年齡數(shù)據(jù)。

1.2 魚類年齡鑒定方法

傳統(tǒng)的魚類年齡鑒定方法主要為自然長(zhǎng)度分布曲線法、硬組織鑒定法、放射性碳定年法，這些方法各有優(yōu)點(diǎn)，但又有一定局限性，因此，探尋魚類年齡鑒定的替代方法是非常必要的。

1.2.1 自然長(zhǎng)度分布曲線法

自然長(zhǎng)度分布曲線法是較早使用的方法， 即通過(guò)大量漁獲物體長(zhǎng)頻率數(shù)據(jù)構(gòu)成長(zhǎng)度頻數(shù)曲線模型，通過(guò)曲線的峰值分析年齡，但是難以捕撈到所有年齡組個(gè)體，所以只能獲得種群年齡結(jié)構(gòu)，無(wú)法準(zhǔn)確鑒定個(gè)體年齡， 而且在魚類生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，水溫、餌料等都會(huì)影響魚類個(gè)體大小，因此該方法最好結(jié)合其他魚類年齡鑒定方法，作為其佐證。

1.2.2 硬組織鑒定法

鑒定魚類年齡的主流方法是硬組織鑒定法，魚類硬組織包括鈣化組織（鱗片、耳石、脊椎骨、鰭條、鰓蓋骨、匙骨等）和晶狀體。 魚類的鱗片是體表衍生的具有保護(hù)作用的硬薄片狀結(jié)構(gòu)， 其年齡標(biāo)志主要是基于鱗片環(huán)紋的生長(zhǎng)和排列： 通常在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的春夏季節(jié)，魚類生長(zhǎng)迅速，鱗片上的同心環(huán)紋排列疏松， 形成疏帶， 而在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較匱乏的秋冬季節(jié)，魚類生長(zhǎng)速度減緩或停滯，鱗片上的同心環(huán)紋排列緊密，形成密帶，一個(gè)疏帶和一個(gè)密帶構(gòu)成一個(gè)年輪，二者間的交界處即為年齡標(biāo)志。 因此可以通過(guò)讀取鱗片上環(huán)紋數(shù)量對(duì)魚類年齡進(jìn)行鑒定， 在用于鑒定魚類年齡的硬組織中， 鱗片數(shù)量最多， 取材最簡(jiǎn)便，但魚體生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)鱗片有重吸收現(xiàn)象，且鱗片會(huì)受到磨損，會(huì)產(chǎn)生副輪、幼輪、生殖輪等，不易辨認(rèn)， 而且高齡魚魚體鱗片處于負(fù)生長(zhǎng)甚至停止生長(zhǎng)狀態(tài)，會(huì)影響年齡鑒定。

魚類的耳石是一種鈣化組織， 存在于魚類的內(nèi)耳中，隨著魚類年齡增長(zhǎng)而不斷生長(zhǎng)。其輪紋穩(wěn)定持久，可用于魚類年齡鑒定，且精確度較高，但耳石年輪鑒定的方法昂貴耗時(shí)且需要專業(yè)人員。 魚類年齡和耳石質(zhì)量之間也存在正相關(guān)關(guān)系[1]，耳石重量檢測(cè)的方法簡(jiǎn)便快速且成本低， 但耳石重量會(huì)受到環(huán)境因素影響，會(huì)影響高齡魚年齡鑒定精確度。

其他鈣化組織（脊椎骨、鰭條、鰓蓋骨、匙骨等）可通過(guò)讀取生長(zhǎng)輪紋作為其他年齡鑒定方法的佐證，在鱗片和耳石無(wú)法準(zhǔn)確鑒定年齡時(shí)，可起替代作用。

魚類眼睛晶狀體呈圓球體， 是一種高度特化的組織， 由于脊椎動(dòng)物晶狀體核的晶體蛋白具有代謝惰性[2]，因此可以通過(guò)測(cè)量其直徑與質(zhì)量進(jìn)行魚類年齡鑒定，但高齡魚會(huì)出現(xiàn)晶狀體直徑相同現(xiàn)象，影響高齡魚年齡鑒定精確度。

1.2.3 放射性碳定年法

放射性碳定年法是利用自然存在的碳14同位素的放射性進(jìn)行年齡鑒定， 目前所用生物材料主要是耳石和晶狀體，在海洋漁業(yè)生態(tài)研究中，基于魚類耳石的放射性碳定年法的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。 該方法操作簡(jiǎn)單，鑒定結(jié)果精確度高，但需要大型儀器設(shè)備，分析成本昂貴。

2 DNA甲基化

DNA甲基化（DNA methylation）是最早被發(fā)現(xiàn)、也是研究最深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一， 其變化受到內(nèi)在因素和外在環(huán)境以及隨機(jī)事件的影響。DNA甲基化是DNA化學(xué)修飾的一種形式， 它能夠在不改變DNA序列的前提下， 對(duì)DNA序列中的堿基進(jìn)行甲基基團(tuán)修飾，以此抑制或促進(jìn)基因的表達(dá)，與衰老、癌癥及多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是表觀遺傳學(xué)的熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。

2.1 DNA甲基化形成機(jī)理

所謂DNA甲基化是指甲基(CH3)在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的催化下與胞嘧啶核苷酸相連，這些酶將甲基(CH3) 基團(tuán)共價(jià)轉(zhuǎn)移到DNA胞嘧啶環(huán)的C-5位置，形成5甲基胞嘧啶(5mC)的化學(xué)修飾作用，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是主要的底物，它為胞嘧啶生成5甲基胞嘧啶(5mC)提供實(shí)際的甲基(CH3)基團(tuán)。 將甲基(CH3)基團(tuán)傳遞給胞嘧啶后，最終形成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs的抑制劑。DNA甲基化反應(yīng)分為從頭甲基化和保留甲基化兩種類型。 從頭甲基化（denovo methylation）是2條鏈均未甲基化的DNA被甲基化； 保留甲基化（maintenance methylation） 是雙鏈DNA的其中一條鏈已存在甲基化，另一條未甲基化的鏈被甲基化。

當(dāng)一個(gè)鳥(niǎo)嘌呤(G)核苷酸與胞嘧啶(C)在DNA序列中被一個(gè)磷酸基(p)分開(kāi)時(shí)，該區(qū)域被稱為CpG位點(diǎn)， 脊椎動(dòng)物中約有半數(shù)的基因在啟動(dòng)子上存在富含CpG的序列，即CpG島。在DNA甲基化過(guò)程中，甲基(CH3)會(huì)在CpG位點(diǎn)被附著在DNA上的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)催化。

2.2 DNA甲基化生物學(xué)意義

啟動(dòng)子CpG島上胞嘧啶的甲基化可通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)等， 起到抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用，且有研究表明，DNA甲基化可抑制印記基因的表達(dá)以及引起X染色體失活[3]。

多數(shù)基因本體缺乏CpG島, 但其甲基化普遍存在。 通過(guò)對(duì)擬南芥、人類、水稻和斑馬魚等多個(gè)物種的全基因組DNA甲基化分析[4-6]，發(fā)現(xiàn)基因本體的DNA甲基化與基因轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)。

增強(qiáng)子、 沉默子和轉(zhuǎn)座子作為基因組中的作用元件，他們的甲基化變化會(huì)影響整個(gè)基因組。 其中增強(qiáng)子的DNA甲基化狀態(tài)與基因活性之間呈反比關(guān)系，沉默子與之相反，而轉(zhuǎn)座子在DNA甲基化程度高的情況下會(huì)抑制其轉(zhuǎn)座活性， 從而維持基因組的穩(wěn)定性。

3 DNA甲基化應(yīng)用于年齡預(yù)測(cè)研究進(jìn)展

越來(lái)越多的證據(jù)表明， 衰老的許多表現(xiàn)都是表觀遺傳的，衰老與DNA甲基化的變化有關(guān)，這是主要的表觀遺傳機(jī)制之一。 一般來(lái)說(shuō)，DNA甲基化的年齡依賴性變化可以概括為基因組整體的低甲基化。 這被認(rèn)為是由于維持DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNMT1)的酶活性[7]，同時(shí)伴有與基因表達(dá)變化無(wú)關(guān)的特定CpG位點(diǎn)的高甲基化所造成的結(jié)果。 除了這種“表觀遺傳漂變”之外，還有其他DNMT3b等DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）調(diào)控的DNA甲基化變化。在這種情況下，DNA甲基化變化遵循一定速度， 影響特定位點(diǎn)甲基化增加或減少，并可能導(dǎo)致功能后果。

衰老和DNA甲基化的關(guān)系很多年前就有人進(jìn)行研究，在魚類中，年齡和DNA甲基化之間的第一個(gè)聯(lián)系是Berdyshev 等在1967 年發(fā)現(xiàn)的駝背大麻哈魚(Oncorhynchus gorbuscha) 中甲基化水平隨著年齡的增長(zhǎng)而減少[8]；Vanyushin等在1973年指出大鼠腦和心臟中的胞嘧啶甲基化修飾隨著年齡的增加而減少[9]；Wilson等在1987年指出各年齡段人支氣管上皮細(xì)胞的基因組甲基化水平也隨著年齡的增加而減少，基因組5mdCyd（5-methyldeoxycytidine）水平也發(fā)生年齡依懶性降低，且DNA 5mdCyd的丟失率似乎也與潛在的最大壽命成反比[10]；Bocklandt等在2011年利用34對(duì)同卵雙胞胎男性的唾液樣本， 篩選出了88個(gè)與年齡相關(guān)的甲基化位點(diǎn)，并構(gòu)建了首個(gè)DNAm年齡預(yù)測(cè)模型，但該模型準(zhǔn)確度較低[11]；Heyn等在2012年利用CpG-poor啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度的差異， 將新生兒和百歲老人的生物檢材區(qū)分開(kāi)[7]；Horvath在2013年提出了能體現(xiàn)人類衰老的“表觀遺傳時(shí)鐘（Epigenetic clock）”概念，并開(kāi)發(fā)了353個(gè)年齡相關(guān)的CpG位點(diǎn)組成的多組織年齡推斷模型， 從而為使用DNA甲基化進(jìn)行年齡預(yù)測(cè)奠定了基礎(chǔ)[12]，該模型準(zhǔn)確性高且適用于廣泛的組織和細(xì)胞類型， 是目前應(yīng)用最廣泛、最經(jīng)典的DNAm年齡推斷模型，目前已被應(yīng)用于癌癥、衰老、阿爾茲海默病及生活方式與衰老的關(guān)聯(lián)研究；Levine等在2018年利用9926名美國(guó)成年人的全血作為樣本，通過(guò)Cox 懲罰回歸和彈性網(wǎng)絡(luò)回歸，開(kāi)發(fā)了新的衰老表觀遺傳生物標(biāo)記物DNAm PhenoAge，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)全因死亡率、癌癥、身體功能、行為生活方式等與衰老相關(guān)的各方面[13]；Xu等在2020年利用1280個(gè)非血液組織（包括骨髓、精子、唾液等17種）作為樣本，通過(guò)主成分分析、聚類分析、梯度增強(qiáng)回歸（GBR）算法，開(kāi)發(fā)了可研究人類非血液組織DNAm與年齡關(guān)聯(lián)的DNA甲基化年齡推斷模型[14]。

4 DNA甲基化應(yīng)用于魚類年齡預(yù)測(cè)存在的問(wèn)題及前景展望

DNA甲基化的年齡預(yù)測(cè)是表觀遺傳學(xué)的一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，它有很大的潛力。 在魚類方面，除了上文提到的關(guān)于駝背大麻哈魚(Oncorhynchus gorbuscha)的研究外，最近一項(xiàng)以斑馬魚為模型的全基因組研究發(fā)現(xiàn)， 斑馬魚的基因組在體細(xì)胞中逐漸明顯地失去了甲基胞嘧啶， 而且年齡依賴性的低甲基化優(yōu)先發(fā)生在一個(gè)與脊椎動(dòng)物基因有關(guān)的特定區(qū)域，稱為CpG島岸（CpG island shore），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)斑馬魚卵母細(xì)胞中兩個(gè)低甲基化的CpG島海岸在受精卵中被從頭甲基化， 這表明斑馬魚的表觀基因組在受精后被重置，使新一代的基因組重甲基化[15]。 此外， 一項(xiàng)使用大鱗大麻哈魚(Oncorhynchus tshawytscha) 和候選基因的研究表明，DNA甲基化的變化與基因、 組織和年齡有關(guān)， 隨年齡的增加而降低，而且不同組織類型的甲基化模式不同[16]。 最近，在關(guān)于虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的研究中發(fā)現(xiàn)，低甲基化在較大年齡虹鱒中占優(yōu)勢(shì)[17]。 這些結(jié)果表明，魚類與鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物一樣有基于DNA甲基化隨年齡變化規(guī)律構(gòu)建表觀遺傳時(shí)鐘來(lái)預(yù)測(cè)年齡發(fā)展的潛力。

DNA甲基化是一個(gè)可遺傳的表觀遺傳標(biāo)記，涉及到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)將一個(gè)甲基基團(tuán)共價(jià)轉(zhuǎn)移到DNA胞嘧啶環(huán)的C-5位置， 形成5甲基胞嘧啶(5mC)，魚類是冷血?jiǎng)游?，它們?甲基胞嘧啶(5mC)含量比鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物等溫血?jiǎng)游锔撸?而且魚類等脊椎動(dòng)物5甲基胞嘧啶(5mC)含量與體溫成反比[18]。 因此，生活在極地地區(qū)的魚類5甲基胞嘧啶(5mC)含量高，而生活在熱帶地區(qū)的魚類5甲基胞嘧啶(5mC)含量低。 另一方面，與鳥(niǎo)類或哺乳動(dòng)物不同，魚類是冷血?jiǎng)游?，生長(zhǎng)易受環(huán)境因素的影響，具有不確定性，其中最重要的是溫度，在魚類中，高于正常溫度會(huì)加速生長(zhǎng)，由于魚類的生長(zhǎng)是不確定的，其繁殖力也隨年齡的增長(zhǎng)而增加。 這些不確定性，即不同的5mC含量和不確定的生長(zhǎng)， 增加了DNA甲基化應(yīng)用于魚類年齡預(yù)測(cè)并構(gòu)建表觀遺傳時(shí)鐘的難度和不確定性。

Anastasiadi等在2020年使用一種可以準(zhǔn)確知道年齡的歐洲鱸魚（Dicentrarchus labrax），通過(guò)靶向亞硫酸氫鈉序列從肌肉樣本中的4個(gè)基因中擴(kuò)增出48個(gè)CPGs，并應(yīng)用懲罰回歸預(yù)測(cè)年齡，構(gòu)建了一個(gè)魚類表觀遺傳時(shí)鐘[19]，這是冷血脊椎動(dòng)物中的第一個(gè)表觀遺傳時(shí)鐘。 這種魚的表觀遺傳時(shí)鐘涉及到年齡預(yù)測(cè)，其精度是通過(guò)平均絕對(duì)誤差來(lái)測(cè)量的，從而證明了時(shí)鐘具有良好的精度， 預(yù)測(cè)年齡與實(shí)際年齡高度相關(guān)，這也為其他物種的類似研究作了鋪墊。

但值得注意的是， 此次研究構(gòu)建的是肌肉中的表觀遺傳時(shí)鐘，其中從肌肉中取樣是致命的。雖然當(dāng)魚被解剖時(shí)，從肌肉樣本來(lái)估算魚的年齡是可以的，但通過(guò)非致死取樣來(lái)預(yù)測(cè)年齡會(huì)更好。因此，對(duì)魚類通過(guò)DNA甲基化預(yù)測(cè)年齡并構(gòu)建表觀遺傳時(shí)鐘的進(jìn)一步研究應(yīng)集中于可通過(guò)非致死手段獲取的組織，如鰭、鱗片等。 其中鰭是非致死取樣的理想組織，多年來(lái)一直用于各種研究， 因此構(gòu)建基于鰭的表觀遺傳時(shí)鐘應(yīng)該是未來(lái)研究的主要方向。