宋小娟，趙藝方，吳映梅，李 會，周 艷*

（1.貴州醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

火棘（Pyracantha fortuneana）果實呈紅色或橙黃色，單果約0.17 g，果實成熟期系每年的8～12月[1]，其具有較強的消食健脾、降血脂、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、活血止血、增強免疫力以及美白等功效，火棘果類黃酮提取物能有效抑制小鼠B16黑色素細胞、人肝癌細胞Hep G2及人宮頸癌細胞Hela的增殖，且對抑制細胞增殖具有時間-劑量依賴性[2-6]。火棘果提取物可降低三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和丙二醛水平，升高谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性[7]。火棘果實中的水溶性聚合物原花青素及槲皮素與細胞抗氧化活性升高相關(guān)，抗氧化活性強弱為火棘果實總黃酮＋維生素C/檸檬酸＞火棘果實總黃酮＞維生素C＞檸檬酸[8-9]。鄧如福等[10]研究發(fā)現(xiàn)，火棘果中8種人體必需氨基酸及嬰兒必需氨基酸種類齊全，含量豐富。

時偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，野生火棘果保健果酒發(fā)酵的最佳條件為產(chǎn)酯酵母菌株T6-1和耐酸酵母菌株Y2-1的接種比例1∶4（V/V），接種量9%，初始pH值5.5，發(fā)酵溫度22 ℃，發(fā)酵時間8 d，此條件下野生火棘果保健果酒酒精度為11.5% vol～12.0% vol，感官評分達到94.61分。高磊[12]在火棘果漿中加入0.15%檸檬酸和0.12%硫酸鈉溶液，在溫度34 ℃、接種量10%、酒精度7% vol的條件下發(fā)酵，所制得的火棘果醋飲料的香味、口感良好。楊勝敖等[13]利用保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）對火棘果進行發(fā)酵，在接種量6%、溫度43 ℃條件下發(fā)酵24 h，乳酸飲料口感較好。周文斌等[14]研究發(fā)現(xiàn)，初始酒精度7% vol、初始pH7、溫度32 ℃、接種量12%是較好的發(fā)酵條件，火棘果醋醋酸含量可達6.026 g/100 mL。周文斌等[15]用酵母發(fā)酵火棘果酒，通過正交試驗得出，初始糖度為18%，初始pH值為6，發(fā)酵溫度為28 ℃，接種量為0.6%是最佳的組合，發(fā)酵時間約3 d，可得到酒精含量7.8% vol、糖含量2.6%的火棘果酒。

植物乳桿菌具備較好的耐酸性且無乙醇代謝，適用于果蔬飲品的發(fā)酵[16]。因此已有大量研究將模糊綜合評判法應(yīng)用到工藝優(yōu)化以及配方優(yōu)化中[17-19]，本研究以植物乳桿菌為菌種，綜合考慮各因素對發(fā)酵火棘果汁品質(zhì)的影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用模糊綜合評判法結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵工藝，探究火棘果汁發(fā)酵最佳工藝條件，以期為火棘果的深加工以及火棘果乳酸菌飲料的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火棘果：貴安新區(qū)采摘的野生火棘果；植物乳桿菌：山東中科嘉億生物工程有限公司；苯酚（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；福林酚試劑（生物試劑）：上海源葉生物科技有限公司；過硫酸鉀（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力試劑盒、羥自由基測試試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

1510酶標儀、ST-8R高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技有限公司；SHP-160智能生化培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火棘果汁發(fā)酵工藝流程及操作要點

新鮮火棘果→挑選→清洗→打漿→殺菌→添加白砂糖、菌種→發(fā)酵→過濾→消毒灌裝→火棘果汁成品

操作要點：

挑選：選擇無霉爛、無機械損傷、無雜質(zhì)且成熟度在八成左右的火棘果。

清洗：用無菌蒸餾水中清洗火棘果表面灰塵和雜質(zhì)后自然晾干水分。

打漿：按原料∶水=1∶3（g∶mL）進行打漿。

殺菌：火棘果漿85 ℃保持30 min進行滅菌處理。

接種：火棘果漿冷卻后，將白砂糖和直投式植物乳桿菌菌粉按照不同比例加入到滅菌后的火棘果漿中，攪拌均勻后裝入無菌的錐形瓶中，透氣膜封口。

發(fā)酵：在一定溫度條件下進行發(fā)酵，當pH達到3.6左右結(jié)束發(fā)酵。

過濾：發(fā)酵結(jié)束的火棘果發(fā)酵液通過孔徑0.45 μm的濾膜，除去果渣。

消毒灌裝：過濾后的火棘果汁裝瓶，進行巴氏殺菌（瓶中心溫度達到65～68 ℃，保持30 min）后，即得火棘果汁成品。

1.3.2 火棘果汁發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

以感官評分、pH、總黃酮含量、總酚含量及模糊綜合評判值為考察指標，以發(fā)酵溫度30 ℃、白砂糖添加量9%、接種量3%為基準，分別研究發(fā)酵時間（24 h、48 h、72 h、96 h、120 h）、白砂糖添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵溫度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃）對發(fā)酵火棘果汁品質(zhì)的影響。

1.3.3 火棘果汁發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時間（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）為自變量，以模糊綜合評判值（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，利用Design-Expert13.0軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計和分析，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 火棘果汁發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation conditions optimization of Pyracantha fortuneana juice

1.3.4 感官評價

由10名經(jīng)過培訓的食品專業(yè)的學生組成評價小組，按照參考文獻[20]制定感官評分標準，分別從色澤、氣味、組織狀態(tài)、口感對發(fā)酵火棘果汁進行打分，滿分100分，最終結(jié)果以感官評分的平均值表示。發(fā)酵火棘果汁的感官評分標準見表2。

表2 發(fā)酵火棘果汁的感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented Pyracantha fortuneana juice

1.3.5 分析檢測

pH的測定：采用pH計；總黃酮含量的測定：參照參考文獻[21]的方法，結(jié)果以蘆丁當量（rutin equivalent，RE）表示；總酚的測定：參照參考文獻[22]的方法，結(jié)果以沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）表示。

DPPH自由基（DPPH·）清除能力、抑制羥自由基（·OH）能力：采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，具體步驟按試劑盒說明書的方法進行；ABTS自由基（ABTS+·）清除率測定：參照參考文獻[24]的方法。

1.3.6 模糊綜合評判模型的建立

參照參考文獻[23]的方法，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以感官評分、發(fā)酵液pH值、總黃酮以及總酚含量為評價指標，利用模糊綜合評判法對相應(yīng)指標進行多目標綜合評判，采用極值法對相應(yīng)的指標進行無量綱轉(zhuǎn)化。因此，因素集X=｛X1，X2，X3，X4｝={感官評價，pH值，總黃酮含量，總酚含量}；權(quán)重系數(shù)集W=｛W1，W2，W3，W4｝={感官評價，pH值，總黃酮含量，總酚含量}=｛0.35，0.15，0.25，0.25｝。在發(fā)酵過程中pH值越小，說明發(fā)酵效果越好，因此其無量綱轉(zhuǎn)化函數(shù)關(guān)系式：xi=ymin/yi；感官評分、總黃酮以及總酚含量越大，發(fā)酵力越好，發(fā)酵汁品質(zhì)越好，因此其無量綱轉(zhuǎn)化函數(shù)關(guān)系式：xi=yi/ymax；模糊綜合評判值Y=W1x1+W2x2+W3x3+W4x4

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

利用SPASS 13.0進行數(shù)據(jù)分析，采用Design-Expert 13.0進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，采用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 火棘果汁發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵火棘果汁品質(zhì)的影響

由表3可知，發(fā)酵火棘果汁的感官評分隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，其中發(fā)酵時間為96 h，感官評分最高為79.5分，與24 h、48 h、72 h均有顯著性差異（P＜0.05），但與發(fā)酵120 h無顯著差異（P＞0.05）；隨著發(fā)酵時間延長，pH值逐漸降低，當發(fā)酵96 h后趨于穩(wěn)定；總酚在發(fā)酵時間為72 h時含量較高，達0.61 mg GAE/mL，與其他組別存在顯著性差異（P＜0.05）；而總黃酮含量在發(fā)酵24 h時最高，為0.21 mg RE/mL。研究表明，乳酸菌發(fā)酵會降低總酚和類黃酮的含量，因為乳酸菌會降解部分酚類[25]。通過模糊綜合評判法可知，發(fā)酵時間為72 h，此時模糊評判值最高為0.91。因此，選擇發(fā)酵時間為72 h。

表3 發(fā)酵時間對發(fā)酵火棘果汁品質(zhì)的影響Table 3 Effect of fermentation time on the quality of fermented Pyracantha fortuneana juice

2.1.2 白砂糖添加量對發(fā)酵火棘果汁品質(zhì)的影響

由圖1a可知，發(fā)酵火棘果汁的感官評分隨著白砂糖添加量的增加呈先升高后下降趨勢，白砂糖添加量為7%時，感官評分最高為77.5分，此條件下pH值為3.37，且與白砂糖添加量9%組無顯著性差異（P＞0.05）。由圖1b可知，不同白砂糖添加量對火棘果中總酚以及總黃酮含量的影響無顯著性差異（P＞0.05），其中白砂糖添加量為9%時，火棘果汁總黃酮含量為0.66 mg RE/mL。由圖1c可知，通過模糊綜合評判法得出白砂糖添加量為7%，此時模糊綜合評判值最高為0.96。因此，選擇白砂糖添加量為7%。

圖1 白砂糖添加量對發(fā)酵火棘果汁品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of sugar addition on the quality of fermented Pyracantha fortuneana juice

2.1.3 植物乳桿菌接種量對發(fā)酵火棘果汁品質(zhì)的影響

由圖2a可知，發(fā)酵火棘果汁的感官評分隨著接種量的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當接種量為3%時，感官評分最高為81分，與其他組存在顯著性差異（P＜0.05）；接種量≥2%時，各組間的pH值無顯著性差異（P＞0.05）。由圖2b可知，接種量為3%時，發(fā)酵火棘果的總黃酮含量最高，達到0.57 mg RE/mL；接種量為4%時，總酚含量高達0.28 mg GAE/mL，與組別5%有顯著性差異（P＜0.05）。由圖2c可知，通過模糊綜合評判法得出，植物乳桿菌的接種量為3%時，此時模糊評判值最大為0.952。因此，接種量選擇3%。

圖2 接種量對發(fā)酵火棘果汁品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of inoculum on the quality of fermented Pyracantha fortuneana juice

2.1.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵火棘果汁品質(zhì)的影響

由圖3a可知，發(fā)酵火棘果汁感官評分隨著發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當發(fā)酵溫度為32 ℃時，感官評分最高為83.5分，此條件下pH最低，達到3.14。由圖3b可知，總酚隨發(fā)酵溫度的增加先升高后下降，在發(fā)酵溫度為32 ℃時達最高為0.36 mg GAE/mL，與其他組別無顯著性差異（P＞0.05）；總黃酮在發(fā)酵溫度為30 ℃時含量為最高，為0.65 mg RE/mL，與組別32 ℃無顯著性差異（P＞0.05），與其余組別均有顯著性差異（P＜0.05）。由圖3c可知，通過模糊綜合評判法得出，發(fā)酵溫度為32 ℃時，評判值最高達0.992。因此，選擇發(fā)酵溫度為32 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵火棘果汁品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of fermented Pyracantha fortuneana juice

2.2 火棘果汁發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時間（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）為自變量因素，Design-Expert 13.0軟件對影響因素進行編碼組合，利用Box-Behnken組合設(shè)計，以模糊綜合評判值（Y）為響應(yīng)值，優(yōu)化火棘果汁的發(fā)酵工藝，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

根據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，以模糊綜合評判值為響應(yīng)值，利用Design-Expert.13.0軟件對表4數(shù)據(jù)進行分析，最終得到模糊綜合評判值與發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度之間的二次多項回歸方程：

表4 火棘果汁發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization of Pyracantha fortuneana juice

續(xù)表

由表5可知，在模糊綜合評判值與發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度之間的二次多項回歸方程模型中：P=0.004 2，結(jié)果為極顯著（P＜0.01），決定系數(shù)R2=0.920 9，校正決定系數(shù)為R2Adj=0.819 1，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為4.29%。綜上說明，模糊綜合評判值的二次回歸方程擬合度比較好。在本模型中，一次項B對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），二次項B2、C2對結(jié)果的影響極顯著（P＜0.01），其余項均為不顯著（P＞0.05），根據(jù)表中的F值對火棘果汁的模糊綜合評判值影響程度依次為B＞A＞C，即菌種接種量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度。

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

以模糊綜合評判值為響應(yīng)值，響應(yīng)曲面越陡峭表明響應(yīng)值對發(fā)酵條件的改變越敏感，反之則發(fā)酵條件的改變對火棘果的品質(zhì)影響較小。由圖4可知，發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度、發(fā)酵溫度與接種量、發(fā)酵時間與接種量交互作用較明顯。

圖4 各因素交互作用對火棘果汁模糊綜合評判值影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of the interaction of various factors on the fuzzy comprehensive evaluation value of Pyracantha fortuneana juice

利用響應(yīng)面設(shè)計軟件進行發(fā)酵條件優(yōu)化組合，得到最佳工藝條件為：發(fā)酵時間90.73 h、接種量3.23%、發(fā)酵溫度31.73 ℃，在此條件下，模糊綜合評判預測值為0.91。模糊綜合評判預測值結(jié)合實際情況，將最佳工藝條件調(diào)整為：發(fā)酵時間90 h、接種量3%、發(fā)酵溫度32 ℃。在此條件下進行驗證試驗，模糊綜合評判實際值為0.94，得到的發(fā)酵火棘果汁感官評分為83分，總黃酮含量為0.43 mg RE/mL，總酚含量為0.38 mg GAE/mL，發(fā)酵后pH為3.14，與預測值偏差較小，說明回歸模型可以很好的反映發(fā)酵的工藝條件。

2.3 發(fā)酵前后火棘果汁的抗氧化能力比較

發(fā)酵前后火棘果汁的抗氧化能力見表6。由表6可知，發(fā)酵后火棘果汁抑制羥自由基能力較發(fā)酵前提高了58.59%，DPPH自由基清除能力提高了36.69%，ABTS自由基清除率提高了0.15%，由此可知，植物乳桿菌發(fā)酵火棘果有利于提高其抗氧化能力。研究表明總黃酮的羥自由基清除能力與總黃酮的濃度成正比，隨著濃度的增加其清除能力也增加[26]。

表6 發(fā)酵前后火棘果汁的抗氧化能力Table 6 Antioxidant ability of Pyracantha fortuneana juice before and after the fermentation

3 結(jié)論

以植物乳桿菌為發(fā)酵菌株，將火棘果與純水按1∶3（g∶mL）料水比進行打漿后，制備發(fā)酵火棘果汁。以發(fā)酵后火棘果汁總黃酮含量、總酚含量、感官評分、pH為評價指標，采用模糊綜合評判法結(jié)合響應(yīng)面試驗設(shè)計，優(yōu)化得到火棘果的最佳發(fā)酵工藝為：白砂糖添加量7%，發(fā)酵時間為90 h、接種量為3%、發(fā)酵溫度為32 ℃。其模糊綜合評判值為0.94，發(fā)酵火棘果汁感官評分為83分，總黃酮含量為0.43 mg RE/mL，總酚含量為0.38 mg GAE/mL，pH為3.14，發(fā)酵后火棘果汁抑制羥自由基能力較發(fā)酵前提高了58.59%，DPPH自由基清除能力提高了36.69%，ABTS自由基清除率提高了0.15%。在此工藝條件下，發(fā)酵后的火棘果汁感官品質(zhì)良好，改善了苦澀味，同時提高了火棘果的抗氧化能力，豐富了火棘果深加工技術(shù)及其乳酸菌飲料的種類，對野生火棘果資源利用提供一定依據(jù)。