MC1R過(guò)表達(dá)重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建及對(duì)小鼠長(zhǎng)期記憶的影響

王曉兵　龔志婷　姜樂(lè)　馬文豪　賀爾姝　鄭曉燁　張本斯　張麗梅

摘要：目的：構(gòu)建攜帶MC1R基因的重組腺相關(guān)病毒并探究小鼠海馬齒狀回中過(guò)表達(dá)MC1R基因?qū)π∈箝L(zhǎng)期記憶的影響。方法：獲取小鼠目的基因MC1R。使用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和HindIII雙酶切AAV載體質(zhì)粒pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a及目的基因，使用T4DNAligase進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化stbl3感受態(tài)細(xì)胞并篩選陽(yáng)性克隆pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將構(gòu)建的pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R、PAAV-DJ/8、pHelper質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝及純化并利用Q-PCR檢測(cè)病毒滴度。純化后的病毒通過(guò)立體定位注射到小鼠海馬齒狀回中，表達(dá)14天以上后，驗(yàn)證該病毒是否能夠提高小鼠海馬區(qū)的MC1R基因表達(dá)，并檢測(cè)小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及條件性恐懼實(shí)驗(yàn)中的行為學(xué)改變。結(jié)果：rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R過(guò)表達(dá)病毒構(gòu)建成功，滴度約為1.1*1010，立體定位注射到小鼠海馬齒狀回中至少14天后小鼠海馬齒轉(zhuǎn)回中能表達(dá)綠色熒光蛋白，并能顯著提高小鼠海馬中MC1R基因的表達(dá)。進(jìn)一步的，過(guò)表達(dá)MC1R基因?qū)π∈髸鐖?chǎng)實(shí)驗(yàn)中的自發(fā)活動(dòng)、焦慮狀態(tài)均無(wú)影響，但顯著提高條件性恐懼實(shí)驗(yàn)中的僵立水平。結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了重組腺相關(guān)病毒rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R，通過(guò)立體定位注射，該病毒顯著提高小鼠海馬齒狀回中MC1R基因的表達(dá)，并增強(qiáng)小鼠的長(zhǎng)期記憶。我們的結(jié)果說(shuō)明MC1R基因可能是一個(gè)記憶損傷類(lèi)疾病如阿爾茲海默癥的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：MC1R;腺相關(guān)病毒;海馬齒狀回;

【中圖分類(lèi)號(hào)】G644.5???????????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A???????????? 【文章編號(hào)】2107-2306（2021）12--03

前言：黑素皮質(zhì)素1受體（MC1R）是一種環(huán)腺苷單磷酸刺激g蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）[1-4]，同時(shí)是MSH（α、β、γ）和ATCH的受體[1，2，5-7]，調(diào)節(jié)黑色素的形成，通過(guò)控制cAMP信號(hào)從而影響黑色素細(xì)胞，通過(guò)黑色素合成途徑調(diào)節(jié)皮膚生理。研究發(fā)現(xiàn)MC1R基因的改變與阿爾茲海默癥、帕金森病有密切的相關(guān)性，最新研究表明，激活MC1R在不同的通路中可以減輕IHC所致的神經(jīng)炎癥、在自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用、以及減弱蛛網(wǎng)膜下腔出血的癥狀。WeilinXu等人發(fā)現(xiàn)，在IHC后的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、表皮細(xì)胞中均有表達(dá)，并且通過(guò)激活MC1R可以減少小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。以上實(shí)驗(yàn)均表明，黑素皮質(zhì)素-1受體（MC1R）不僅與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，并且MC1R的激活在幾種神經(jīng)疾病中均有明顯的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)中表明MC1R在神經(jīng)系統(tǒng)中尤其是大腦中的表達(dá)水平較高，但是在大腦中明確的生理功能以及作用機(jī)制并不清楚。由于以上眾多的研究已經(jīng)證明MC1R在大腦、脊髓中都有發(fā)揮作用，本研究采用腺相關(guān)病毒PAAV，構(gòu)建含有小鼠MC1R基因的腺相關(guān)病毒載體（rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R），通過(guò)感染小鼠大腦海馬齒狀回區(qū)域，驗(yàn)證MC1R基因的表達(dá)效果，為MC1R相關(guān)疾病，可能是包括阿爾茲海默癥在內(nèi)的長(zhǎng)期記憶損傷等相關(guān)疾病提供治療靶點(diǎn)。

一、材料與方法

（一）材料

大腸桿菌DH5α、Stbl3感受態(tài)購(gòu)自康體生命公司;重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)（DJ/8包裝系統(tǒng)）購(gòu)自CELLBIOLABs公司（美國(guó)）、HEK293T細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院李紅昌課題組惠贈(zèng);EcoRI、HindIII酶，T4DNA連接酶，TaqDNA聚合酶、DMEM/HighGlucose培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青霉素、鏈霉素等購(gòu)自ThermoFisherScientific公司（美國(guó)）;RNA提取試劑盒購(gòu)自生工;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自promega公司（美國(guó)）;質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)、AAV純化試劑盒購(gòu)自biomiga公司（美國(guó)）;小鼠腦立體定位儀購(gòu)自瑞沃德公司;冰凍切片機(jī)購(gòu)自ThermoFisherScientific公司（美國(guó)）;曠場(chǎng)、條件恐懼、軟件及硬件均購(gòu)自上海欣軟公司。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.目的基因的獲取

腹腔注射水合氯醛麻醉C57小鼠后，灌注取腦，使用trizol提取的方法快速抽提總RNA，按照promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)使用所提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2.重組腺相關(guān)病毒（rAAV）表達(dá)載體pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R的構(gòu)建

PCR純化產(chǎn)物和pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a（自己構(gòu)建）使用EcoRI和HindIII在37℃水浴中進(jìn)行雙酶切，pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a所得酶切大片段，和PCR酶切所得目的基因在T4DNA連接酶的作用下連接22℃、2小時(shí)，所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化stbl3感受態(tài)（連接產(chǎn)物），冰浴后放入無(wú)抗LB培養(yǎng)基復(fù)蘇，復(fù)蘇完成后，取適量已轉(zhuǎn)化好的的感受態(tài)細(xì)胞涂抹于A(yíng)mp+藥液的LB平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜，24小時(shí)后挑選陽(yáng)性單克隆的單個(gè)菌落，接種于含Amp+藥液的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定大小正確的質(zhì)粒樣品送到華大基因進(jìn)行測(cè)序。

3.pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R腺相關(guān)病毒的包裝、純化和滴度測(cè)定

首先，將攜帶目的MC1R基因的重組質(zhì)粒pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R、pAAV-DJ/8、pHelper，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Stbl3，使用biomiga的質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取后用于病毒包裝，使用高效轉(zhuǎn)染試劑盒，將大提所得質(zhì)粒pAAV-DJ/8，pHelper，以及pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R按照1：1：1.5的比例轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，4-6小時(shí)后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，48小時(shí)后，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后收細(xì)胞，按照biomigaAAV純化試劑盒的方法純化出腺相關(guān)病毒rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R，采用熒光定量PCR（qPCR）的方法檢測(cè)所得病毒溶液中包含目的片段的拷貝數(shù)，進(jìn)而推知單位體積內(nèi)有效病毒顆粒數(shù)，得出滴度。

qPCR引物序列如下：

AAVtest-F：5’-CGCAGCGTCACACAGAAG-3’

AAVtest-R：5’-GCAGGGTTGACAATGGAGAG-3’

4.rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R功能鑒定

取C57/BL6小鼠放入麻醉箱用異氟烷麻醉，麻醉后，將小鼠放入腦立體定位儀的操作臺(tái)上，用耳桿固定，后進(jìn)行調(diào)平，用5微升量程33G針頭的微量注射器（漢密爾頓）注射病毒，采用微量注射泵（上海欣軟）控制注射速度。使用以下坐標(biāo)將病毒注射到海馬的dDG中，Bregma：AP=-2.1毫米;ML=±1.4毫米;DV=-1.9毫米。注射速度為150nl/min，rAAV-MC1R及AAV-GFP均為0.8～1.0μl，注射針保持在注射位置至少180秒，以允許病毒充分?jǐn)U散。病毒表達(dá)至少14天后，進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

5.條件恐懼實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，所有小鼠從飼養(yǎng)間移出至行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室，在實(shí)驗(yàn)室的適應(yīng)間內(nèi)至少放置1hr，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后小鼠沒(méi)有適應(yīng)時(shí)間直接電擊2s，間隔2min后再給與2s的電刺激，刺激結(jié)束1min后取出小鼠。一天后recall，放入同樣的環(huán)境記錄freezing值，實(shí)驗(yàn)最終將統(tǒng)計(jì)小鼠freezing時(shí)間占總時(shí)間的百分比。

二、結(jié)果

（一）目的基因的獲取

結(jié)合primerblast程序設(shè)計(jì)引物，

上游引物：5-gaattcatgtccactcaggagccccagaagagtc-3’，

下游引物：5’-aagctttcaccaggagcacagcagcacctcc-3’，通過(guò)上海生工生物公司合成后，使用所提取的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因，得到940bp左右的條帶（見(jiàn)圖1）

（二）線(xiàn)性化載體pAAV-CaMKIIα-eGFP-dnmt3a的雙酶切

pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a（自己構(gòu)建PMID29572461）使用EcoRI和HindIII在37℃水浴中進(jìn)行雙酶切，得到線(xiàn)性化質(zhì)粒pAAV-CaMKIIα-eGFP（如圖2）

（三）質(zhì)粒酶切后鑒定結(jié)果

我們預(yù)選了5個(gè)候選質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，其中只有3號(hào)質(zhì)?？梢郧谐瞿康臈l帶，進(jìn)一步對(duì)3號(hào)質(zhì)粒酶切結(jié)果進(jìn)行電泳，確定條帶大小正確后送華大基因測(cè)序（如圖3、4）

（四）pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R載體的構(gòu)建

DNAMAN分析pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R質(zhì)粒中的MC1R基因序列與NCBI中提供的MC1R序列一致，（見(jiàn)圖5），表明pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R載體構(gòu)建成功。

（五）pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定

將制備的重組質(zhì)粒pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，換液48小時(shí)后進(jìn)行收病毒，取病毒濃縮液提取病毒DNA，進(jìn)行Qpcr檢測(cè)病毒滴度。

pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R滴度為1.1*1010（見(jiàn)圖6、7）

（六）rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R功能鑒定

將構(gòu)建成功的rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R感染小鼠大腦海馬齒狀回，表達(dá)至少14天后，提取總RNA，Qpcr驗(yàn)證MC1R過(guò)表達(dá)成功，結(jié)果見(jiàn)圖9、10（UnpairedttestPvalue<0.0001t，dft=7.831df=18）

小鼠大腦海馬齒狀回小鼠海馬齒狀回內(nèi)的過(guò)表達(dá)結(jié)果

（七）條件恐懼結(jié)果

在條件恐懼實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)測(cè)試小鼠freezing值發(fā)現(xiàn)rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R小鼠與對(duì)照組小鼠相比，如圖8所示freezing值（n=6，6;Unpairedt-test，p=0.05）如圖8所示（n=6，6;），說(shuō)明rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R小鼠記憶增強(qiáng)。

討論：MC1R基因此前是作為控制動(dòng)物毛色的基因存在，主要通過(guò)cAMP信號(hào)影響黑色素細(xì)胞的功能。自2001年來(lái)，MC1R在黑色素瘤、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡、P53信號(hào)通路、DNA復(fù)制方面均有影響和作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，腦出血后，通過(guò)NDP-MSH激活MC1RCREB/Nr4a1/NF-κB通路，可以減輕腦出血所致的神經(jīng)炎癥，以及血腦屏障的損傷。黑皮質(zhì)素1受體的激活通過(guò)大鼠AMPK/TBK1/NF-κB通路抑制神經(jīng)炎癥，減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血等早期腦損傷，。黑皮質(zhì)素1受體通過(guò)AMPK/SIRT1/PGC-1α通路控制線(xiàn)粒體代謝減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷。用BMS-470539激活MC1R通過(guò)cAMP/PKA/Nurr1通路減輕大鼠新生兒缺氧缺血性腦損傷后的神經(jīng)炎癥。因此，在此基礎(chǔ)上，我們提出MC1R可能會(huì)成為神經(jīng)退行性變疾病領(lǐng)域新的治療靶點(diǎn)。

近年來(lái)，MC1R基因被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用越來(lái)越廣泛，并且分子醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，相對(duì)而言，重組腺相關(guān)病毒（rAAV）載體具有非致病性、廣泛的組織嗜性和長(zhǎng)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的基因治療載體。本文借助重組腺相關(guān)病毒為介導(dǎo)，成功構(gòu)建了rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R、以及rAAV-CaMKIIα-eGFP對(duì)照病毒，并在小鼠海馬齒狀回特異性表達(dá)MC1R基因，不僅能應(yīng)用于科學(xué)研究，在將來(lái)的基因治療中也有潛力。

在rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R構(gòu)建過(guò)程中，我們首先將小鼠MC1R基因定向克隆至pAAV-CaMKIIα-eGFP載體形成pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序后轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增收毒、純化及濃縮后測(cè)定病毒滴度，感染小鼠大腦海馬齒狀回進(jìn)行rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R功能鑒定，Qpcr驗(yàn)證MC1R過(guò)表達(dá)成功，說(shuō)明rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R構(gòu)建成功。后期我們通過(guò)曠場(chǎng)進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)注射腺相關(guān)病毒的小鼠并沒(méi)有表現(xiàn)出活動(dòng)能力及探索能力的障礙以及出現(xiàn)焦慮樣行為，我們認(rèn)為病毒的注射并不會(huì)影響小鼠的探索、運(yùn)動(dòng)能力以及小鼠焦慮樣行為;小鼠進(jìn)行contextualfear條件恐懼實(shí)驗(yàn)時(shí)，表現(xiàn)出了明顯的記憶提高，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，MC1R通過(guò)rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R病毒載體，在大腦海馬齒狀回的高表達(dá)可能會(huì)成為阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病的治療靶點(diǎn)。

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作者簡(jiǎn)介：王曉兵（1994—），女，漢族，山東濟(jì)南市人，研究生，無(wú)職稱(chēng)，單位：大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)專(zhuān)業(yè)，研究方向：神經(jīng)生物學(xué)