2株煙草根際芽孢桿菌的分子鑒定及抗菌促生作用

曹毅 李娟 曾隕濤 陸寧 楊冬梅 商勝華

摘要：為探究分離自煙草根際的2株芽孢桿菌的種類及其抑菌促生特性，利用16S rDNA和gyrB基因序列分析法，將菌株YC2006和YC2008分別鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株對煙草赤星病病原（Alternaria alternata）、煙草黑脛病病原（Phytophthora parasitica）和煙草立枯?。≧hizoctonia solani） 病原均具有明顯的抑制作用，對煙草立枯病病原的抑制率分別達到60.35%和68.08%。菌液浸種處理可顯著提高煙草種子發(fā)芽勢，在育苗基質(zhì)中添加菌劑可顯著提高煙苗的株高、莖圍、最大葉面積、地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、總根長和總根表面積。2株芽孢桿菌對煙草主要真菌病原具有拮抗活性，同時兼具促進種子萌發(fā)和煙苗生長的作用，具有良好的研究開發(fā)應用前景。

關鍵詞：芽孢桿菌;煙草;gyrB基因;抑菌活性;促生作用

中圖分類號：S182;S572.01 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）21-0241-06

收稿日期：2021-03-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：31660544）;中國煙草總公司貴州省公司項目（編號：201603、2021XM12）。

作者簡介：曹 毅（1982—），男，云南會澤人，博士，副研究員，從事微生物和植物保護研究。E-mail：yicao1001@163.com。

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國廣泛種植的重要茄科經(jīng)濟作物，煙草病害嚴重影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量，常年造成的平均產(chǎn)量損失達10%左右[1]，一直是制約煙草生產(chǎn)的主要因素之一，而隨著氣候、耕作制度和栽培方式的變化，煙草病原種類及其危害程度呈增加和上升趨勢。長期以來，作物病害主要依賴化學藥劑，由此導致的藥害[2]、農(nóng)藥殘留、病原耐/抗藥性、生態(tài)環(huán)境影響等問題逐年凸顯，利用微生物制劑或其他環(huán)境友好措施控制作物病害受到各方廣泛關注。在各類生防微生物資源中，芽孢桿菌由于種類多樣、遺傳穩(wěn)定、環(huán)境抗逆性強[3]，可通過改善植物營養(yǎng)物質(zhì)吸收、產(chǎn)生激素、誘導抗性和抑制病原生長等方式直接或間接促進植物生長、防治病害[4]，國內(nèi)外研究者利用芽孢桿菌已開發(fā)出多種對植物病原具有防治效果的生物菌劑[5]，并在作物病害防治中不斷發(fā)展和應用[6]。

利用微生物防治作物病害雖已取得較大的進展，但在實際生產(chǎn)實踐中，由于外源生防菌在目標作物根系中定殖力低、土壤抑菌作用、施用成本等因素的影響，生防制劑往往防效低且不穩(wěn)定，篩選根際定殖能力強的菌株資源并研究適合作物生產(chǎn)特點的施用方法對提高生防菌劑施用效果具有重要意義。前人研究表明，利用有益微生物處理煙草種子，可明顯提高種子發(fā)芽勢、生長勢和種子活力，促進煙苗生長，增加其抗逆和抗病性[7];微生物添加進育苗基質(zhì)中，可改善其結構與理化性質(zhì)[8]，提高養(yǎng)分供應能力，進而促進植物生長[9];同時，菌劑可在植物幼苗根部優(yōu)先形成“生物屏障”[10]，維持根際微生物群落平衡并抵御病原攻擊[11-12]。煙草育苗集約化程度高，在種子萌發(fā)、育苗階段使用微生物菌劑具有經(jīng)濟和高效的特點，規(guī)模化推廣應用潛力大。目前，針對煙草和煙葉生產(chǎn)特點開發(fā)的微生物菌劑較少，以高效土著菌株為核心的煙用菌劑及配套使用技術仍較缺乏。

本研究以前期分離獲得的2株煙草根際芽孢桿菌YC2006和YC2008為材料，采用16S rDNA和gyrB基因（DNA促旋酶B亞單位基因）序列分析法對菌株進行鑒定，通過室內(nèi)和溫室試驗評估2株芽孢桿菌的抗菌和促生能力，以期為煙草抗病促生菌劑的開發(fā)應用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養(yǎng)基和煙草品種

試驗所用煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、煙草立枯病菌（Rhizoctonia solani）、芽孢桿菌YC2006和YC2008均由貴州省煙草科學研究院微生物實驗室分離并保存，LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基分別用于芽孢桿菌的活化和病原真菌培養(yǎng)，試驗用煙草品種為K326，對照為枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（云南星耀生物制品有限公司提供）。

1.2 主要真菌病原拮抗活性測定

用平板對峙培養(yǎng)法測定經(jīng)活化的YC2006和YC2008對煙草黑脛病、赤星病菌和立枯病等主要真菌病害病原菌的拮抗活性，挑取經(jīng)LB平板活化的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)（28 ℃、180 r/min）2 d得到培養(yǎng)液，吸取50 μL培養(yǎng)液緩慢滴入無菌空白濾紙片（索萊寶）中，于PDA平板中接入直徑6 mm 新鮮培養(yǎng)的病原菌菌餅，距菌餅約2.5 cm處等距放入含菌濾紙片，以未接菌的LB培養(yǎng)液為對照，3次重復，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5～7 d后，測量病原菌菌落直徑，計算抑制率：

抑制率=（1-接種處理病原菌菌落直徑/不接種處理病原菌菌落直徑）×100%。

1.3 菌株gyrB基因和16S rDNA序列分析

菌株基因組DNA采用試劑盒（DNeasy UltraClean Microbial Kit，Qiagen）并按說明書方法提取，引物由上海英駿生物技術有限公司合成：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）/1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），UP-1（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′）/UP-2r（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′），分別用于菌株16S rDNA 和gyrB基因[13]的擴增;PCR擴增體系為50 μL（GoTaqTM Green Master Mix 25 μL、27F/UP-1 1 μL、1492R/UP-2r 1 μL、模板 5 μL、無核酸酶去離子水18 μL）。16S rDNA基因擴增程序為：94 ℃預變性 4 min;94 ℃變性30 s，65 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸 10 min;gyrB擴增條件：94 ℃預變性 4 min;94 ℃ 變性 1 min，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，利用中間引物UP-1s（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′）和UP-2rs（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′）測通gyrB基因全長，測序拼接序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，下載同源性在99%以上的序列，利用Mega X軟件包進行多重序列比對，采用鄰接法（Neighbor-Joining，Bootstrap value=1 000）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 煙草種子萌發(fā)相關指標測定

取活化的菌株，接入種子培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h后，制得種子液;以5% 接種量將種子液接種到2 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃條件下發(fā)酵48 h，將菌株發(fā)酵液與適量CaCO3混合，噴霧干燥后獲得初制菌劑。利用平板稀釋法[14]測定含菌量，菌液YC2006和YC2008的濃度分別約為4.04×1010 CFU/mL和1.83×1011 CFU/mL。將菌液濃度與對照商品化菌劑濃度調(diào)至1×109 CFU/mL，備用。

選取煙草種子（K326）放于試驗設置的菌劑溶液中浸種2 h，分別以清水和商品化枯草芽孢桿菌可濕性粉劑為對照，共11個處理（表1）;浸種后，種子置于鋪有滅菌濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌清水保濕，每皿放置30粒種子，每個處理重復3次。25 ℃、光照16 h/d的人工氣候室培養(yǎng)，從種子置床之日起每天定時（早：09：00，晚：18：00）開蓋通氣2次，加入滅菌清水，保證發(fā)芽床濕潤。萌發(fā)指標以種子露白為準。種子萌發(fā)后逐日記錄發(fā)芽數(shù)量，共記錄10 d，測定并計算種子萌發(fā)指標。

發(fā)芽率=（萌發(fā)結束時已發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%;

發(fā)芽勢：從種子置于培養(yǎng)箱開始至第3天，統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)占供試種子總數(shù)的百分率。

1.5 煙草幼苗農(nóng)藝性狀測定

在前期試驗基礎上，設5個處理組，處理A：每100 g育苗基質(zhì)中拌入0.5 g枯草芽孢桿菌YC2006;處理B：每100 g育苗基質(zhì)中拌入2 g解淀粉芽孢桿菌YC2008;處理C：每100 g常規(guī)育苗基質(zhì)中拌入1 ∶1（質(zhì)量比）的1 g芽孢桿菌YC2006、YC2008;處理D：空白對照，育苗基質(zhì)中不拌入芽孢桿菌（CK1）;處理E：每100 g育苗基質(zhì)中拌入0.5 g商品化枯草芽孢桿菌（CK2）。將種子分別播于試驗設置的不同基質(zhì)中，放置于人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境設為溫度25 ℃/18 ℃（晝/夜），光照16 h/d，相對濕度75%。播種45 d后，參照標準YC/T 142—2010[15]，對煙苗株高、莖圍、地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部干質(zhì)量及最大葉面積等指標進行測定，根系指標采用根系掃描儀（型號：EPSON 1680）及其配套的WinRhizo Pro 5.0根系分析軟件測定[16]。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株對主要煙草病原真菌的室內(nèi)拮抗活性的影響

平板對峙試驗結果表明（表2），YC2006和YC2008菌株對病原菌菌絲的生長具有抑制作用，對2種病原菌的抑制率達45%以上，芽孢桿菌YC2006和YC2008對煙草立枯絲核菌的抑制率最為明顯，分別達60.35%和68.08%;其次為赤星病菌（鏈格孢菌）和黑脛病菌（煙草疫霉）（圖1）。

2.2 菌株16S rDNA和gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株YC2006和YC2008的16S rDNA基因測序結果經(jīng)序列拼接后，長度分別為1 420 bp和 1 410 bp，采用 NJ 法分別構建2株菌的16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2和圖3。從16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹看，菌株YC2006和YC2008與臨近的幾株芽孢桿菌親緣關系較為接近，初步將YC2006和YC2008歸為芽孢桿菌屬。

菌株YC2006的gyrB基因測序結果拼接后獲得1 160 bp長度的序列，與GenBank 中已報道的多株枯草芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性較高，序列相似性均達99.5%以上，采用 NJ 法構建基于gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），從gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析，菌株YC2006與枯草芽孢桿菌G2菌株聚為一支，有較近的親緣關系，可信度97%，結合16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，將YC2006鑒定為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）;同樣的方法，菌株YC2008的gyrB基因（1 170 bp）與多株解淀粉芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性較高，序列相似性均達99%以上，系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）表明菌株YC2008與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens，AB829604）聚為一簇，有較近的親緣關系，結合16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，將YC2008鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

2.3 菌株對煙草種子萌發(fā)的影響

室內(nèi)種子發(fā)芽試驗結果（表3）顯示，種子經(jīng)不同濃度的芽孢桿菌液浸泡處理后，YC2006 0.5%處理發(fā)芽率顯著高于對照制劑;各處理發(fā)芽勢顯著提高，表明本試驗菌劑處理可加快煙草種子的萌發(fā)進程，煙草出苗快而整齊。

2.4 菌株對煙草幼苗農(nóng)藝性狀的影響

由表4可知，處理A、B、C對煙草株高有促生作用，分別比清水對照提高了188%、103%、30%;各處理間莖圍無顯著差異，最大葉面積比對照提高了101.30%、36.46%、0.84%，處理A、B地上部鮮質(zhì)量分別比對照提高了85.14%、40.09%;各處理地下部鮮質(zhì)量分別比對照提高了136.36%、203.03%、69.70%。

由表5可知，處理A的平均根系直徑、總根體積與對照相比差異顯著，總根長和總根表面積均顯著高于對照，與無菌清水對照相比，分別提高了41.75%和38.95%。經(jīng)0.5% YC2006處理過的煙苗根長和根系表面積均高于對照，根系更為發(fā)達。

3 結論與討論

16S rDNA基因序列因其高度的保守性而被廣泛用于細菌分子鑒定，但對近緣種常常難以區(qū)分鑒別。gyrB基因存在于所有細菌中，其分子進化速率大于16S rDNA基因，且不同種細菌的gyrB基因存在較大差異，常作為用芽孢桿菌種水平鑒定的靶標基因[17]，本研究同時根據(jù)16S rDNA和gyrB序列和系統(tǒng)發(fā)育分析結果，將菌株YC2006和YC2008初步鑒定為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。煙草立枯病、黑脛病和赤星病是當前煙草育苗和大田生長期的主要真菌性病害，本研究對菌株抑菌活性測試發(fā)現(xiàn)，菌株YC2006和YC2008對供試的3種病原菌均有不同程度的抑制活性，抑制活性強度以立枯病病原最為明顯，煙草大田期靶斑病病原與立枯病病原屬同種不同融合群，推測本試驗菌株也可抑制煙草靶斑病病原，菌株抑菌譜等相關試驗有待進一步開展，以明確其抗病應用范圍。室內(nèi)種子萌發(fā)試驗和溫室幼苗盆栽試驗結果顯示，高濃度的菌株對煙草種子萌發(fā)和幼苗生長有抑制現(xiàn)象，與楊曉云等發(fā)現(xiàn)高濃度解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵液對番茄種子萌發(fā)和幼苗植株生長有抑制作用結果相似，表明在實際應用中明確生防菌株濃度施用范圍十分重要，同時還需對加工工藝、劑型等下游技術開展研究，以便更好地發(fā)揮出生防菌的生防作用[18]。

微生物促進植物生長一般可歸納為：一是通過其生長繁殖及代謝活動產(chǎn)物，促進土壤養(yǎng)分合成、分解與轉(zhuǎn)化，供植物生長利用，如芽孢桿菌代謝產(chǎn)生生長激素等促進植物吸收水分和養(yǎng)分物質(zhì)，直接促進植物生長[19];二是通過營養(yǎng)競爭、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制有害微生物的生長，維持根系微生態(tài)平衡，減少病原菌的侵染而間接促進植物生長。吳亞勝等研究發(fā)現(xiàn)，在育苗基質(zhì)中添加叢枝菌根真菌，菌根侵染率明顯提高，對辣椒幼苗的生長表現(xiàn)出顯著的促進作用[20];多黏類芽孢桿菌CF05發(fā)酵液對番茄幼苗有明顯的促生效果，鮮質(zhì)量增加272.0%，干質(zhì)量增加266.7%[21]。本研究在育苗基質(zhì)中添加枯草芽孢桿菌YC2006、解淀粉芽孢桿菌YC2008表現(xiàn)出了顯著的煙苗促生活性，添加0.5% YC2006，煙苗株高、最大葉面積、地上/地下部鮮質(zhì)量、總根長和總根表面積較商品化的枯草芽孢桿菌菌劑分別提高了149.44%、62.1%、60.55%、39.29%、71.60% 和 70.15%，菌株促生機理值得進一步研究。生防菌施用后，穩(wěn)定的定殖能力是其發(fā)揮生防、促生作用的關鍵因素[22]，本試驗菌株為煙草根際分離所得，可能更適合在根際定殖并發(fā)揮作用，菌株YC2006和YC2008可通過拌種、基質(zhì)添加等使用方式促進煙草生長，同時，菌株對煙草主要真菌病原具有明顯的抑制作用，可作為優(yōu)良的菌種材料用于煙草專用微生物種衣劑、微生物菌劑和菌肥的開發(fā)。

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