于云祥，龔泰芳，劉小濤，柯文，李彬彬

骨髓瘤是一種骨髓內(nèi)單克隆漿細胞異常增殖的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈增長趨勢，極大威脅人類生命健康。骨髓瘤的治療主要以藥物治療、造血干細胞移植術(shù)為主。目前，骨髓瘤的發(fā)病機制尚未明確，臨床治療療效不佳。探討骨髓瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制并尋找該疾病的治療靶點具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類非編碼RNA，參與調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等生命過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有報道稱，miR-335-3p在多發(fā)性骨髓瘤病人外周血中表達下調(diào)，外周血miR-335-3p 水平變化對骨髓瘤診斷具有重要意義。但是，miR-335-3p 對骨髓瘤發(fā)生發(fā)展的影響及其作用機制還未知。本研究于2018年5月至2019年1月主要探討了miR-335-3p 對骨髓瘤細胞增殖和凋亡的影響及其可能的調(diào)控機制，以期為骨髓瘤的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑

骨髓瘤細胞KM3和U266細胞系購自中科院上海細胞庫；胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑和Lipofectamine2000 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司；引物序列由上海生工生物技術(shù)公司提供；miR-335-3p 模擬物（miR-335-3p mimics）以及miRNA 陰性對照購自廣州銳博生物有限公司；噻唑藍（MTT）購自美國Sigma 公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液和BCA 蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠雙微體基因（MDM2）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（P21）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國Santa Cruz 公司；B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2 相關(guān)X（Bax）蛋白抗體購自美國CST 公司；辣根過氧化酶標記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1

細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇KM3 和U266 細胞，用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合至80% 左右時，進行傳代。正常骨髓細胞MNC 培養(yǎng)：參照文獻[8］方法，采集正常供髓者骨髓，肝素鈉抗凝。加入37 ℃溫浴的2.7% 甲基纖維素，終濃度為0.1%，置于37 ℃、5%二氧化碳、97% 濕度的培養(yǎng)箱中靜置30 min。吸取上層有核細胞層，加入Ficoll-Hypaque 淋巴分離液，2000 r/min 離心30 min，分離MNC 細胞。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2 次，加入含10% 胎牛血清的培養(yǎng)進行培養(yǎng)。

1.2.2

實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測細胞中miR-335-3p 表達水平 用Trizol試劑提取細胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA）后，行PCR 反應(yīng)。引物序列：miR-335-3p 正向5'-TTTTTCATTATTGCTCCTGACC-3'，反向5'-GGTCAG GAGCAATAATGAAAAA-3'；U6 正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AC GCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。用2法計算miR-335-3p 相對U6 的表達量。

1.2.3

細胞轉(zhuǎn)染 取6 孔板，加2.5 mL 對數(shù)期KM3細胞懸液（2.5×10/mL），培養(yǎng)12 h 后，用Lipofectamine2000 試劑盒進行轉(zhuǎn)染。 miR-335-3p 組：轉(zhuǎn)染miR-335-3p mimics；miR-NC 組：轉(zhuǎn)染模擬對照序列；pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 組：共轉(zhuǎn)染MDM2 過表達載體和miR-335-3p mimics；pcDNA3.1+miR-335-3p 組：共轉(zhuǎn)染空載體和miR-335-3p mimics。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換為完全培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4

MTT 法檢測細胞增殖 取96 孔板，加200μL上述轉(zhuǎn)染后的細胞懸液（2.5×10/mL），分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。然后加20 μL MTT（5 g/L）。孵育4 h后，棄培養(yǎng)基。加150 μL 二甲基亞砜溶液，振蕩均勻，于全自動酶標儀490 nm波長處測吸光度。

1.2.5

流式細胞儀檢測細胞凋亡取6 孔板，加2.5 mL 上述轉(zhuǎn)染后的細胞懸液（2.5×10/mL），培養(yǎng)48 h后，收集細胞。PBS 清洗細胞3 次，利用Annexin VFITC/碘化丙啶（PI）試劑盒，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax 和MDM2 蛋白表達 取6 孔板，加2.5 mL 上述轉(zhuǎn)染后的細胞懸液（2.5×10/mL），培養(yǎng)48 h 后，收集細胞，用RIPA 裂解液提取細胞中總蛋白，BCA 法測定蛋白含量。行10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，并用5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h。 于4 ℃冰箱中分別用cyclin D1（1∶800）、P21（1∶400）、Bcl-2（1∶600）、Bax（1∶600）、MDM2（1∶400）和GAPDH 一抗孵育過夜，洗膜后，再用辣根過氧化酶標記的二抗（1∶200）室溫孵育2 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。Image J 軟件分析目的蛋白相對GAPDH 的表達量。

1.2.7

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?PCR 計數(shù)擴增含miR-335-3p 結(jié)合位點的MDM2 的3’非翻譯區(qū)（UTR），插入載體，構(gòu)建MDM2 的3’UTR 野生型熒光素酶報告載體（WT-MDM2）；突變結(jié)合位點，插入載體，構(gòu)建MDM2 的3’UTR 突變型熒光素酶報告載體（MUT-MDM2），該過程由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。用Lipofectamine2000 試劑盒分別將WT-MDM2與miR-335-3p mimics、WT-MDM2與miRNC、MUT-MDM2 與miR-335-3p mimics 及MUTMDM2 與miR-NC 共轉(zhuǎn)染至KM3 細胞。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換為完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h 后，收集各組細胞，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 骨髓瘤細胞系中miR-335-3p 表達水平

qRTPCR 檢測結(jié)果顯示，骨髓瘤細胞KM3 和U266 中miR-335-3p 表達水平分別為0.24±0.01、0.38±0.02，顯著低于正常骨髓細胞MNC 中的miR-335-3p 表達水平0.77±0.03（

t

=29.029、18.735，均

P

＜0.001），

F

=484.929，

P

＜0.001。 由于骨髓瘤細胞KM3 中miR-335-3p 表達水平相對低于U266 細胞（

t

=15.340，

P

＜0.001），因此，選擇KM3細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 過表達miR-335-3p 對骨髓瘤細胞KM3 增殖的影響

miR-335-3p 組KM3 細胞中miR-335-3p 表達水平為0.48±0.03，高于miR-NC 組的0.21±0.01（

t

=14.789，

P

＜0.001），說明miR-335-3p mimics 轉(zhuǎn)染成功，KM3 細胞中miR-335-3p 過表達。MTT 法與蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與miR-NC 組比較，miR-335-3p組KM3 細胞培養(yǎng)48 h、72 h 后吸光度降低（均

P

＜0.05），細胞中cyclin D1 蛋白表達降低（

P

＜0.001），P21 蛋白表達升高（

P

＜0.05），表明過表達miR-335-3p可抑制KM3細胞增殖。見表1。

表1 過表達miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3增殖的影響/±s

2.3 過表達miR-335-3p 對骨髓瘤細胞KM3 凋亡的影響

流式細胞儀與蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，miR-335-3p 組KM3 細胞凋亡率為（24.31±0.99）%，高于miR-NC 組的（8.13±0.83）%（

t

=37.573，

P

＜0.001）；細胞中Bax 蛋白表達水平為（0.71±0.07），高于miR-NC 組的（0.19±0.02）（

t

=106.066，

P

＜0.001）；Bcl-2 蛋白表達水平為（0.32±0.03），低于miR-NC 組的（0.81±0.08）（

t

=110.309，

P

＜0.001），表明過表達miR-335-3p能夠促進KM3細胞凋亡。

2.4 miR-335-3p 靶向調(diào)控MDM2

TargetScan 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示的MDM2 的3’UTR 與miR-335-3p 互補結(jié)合的核苷酸序列見圖1A。共轉(zhuǎn)染miR-335-3p與WT-MDM2的KM3細胞熒光素酶活性為0.47±0.03，顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-335-3p 與WTMDM2 的0.97±0.05（

t

=14.852，

P

＜0.001）；共轉(zhuǎn)染miR-335-3p 與MUT-MDM2 的KM3 細胞熒光素酶活性為0.96±0.08，與共轉(zhuǎn)染miR-NC 與MUT-MDM2 的1.01±0.09 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=0.719，

P

=0.512），說明miR-335-3p 可與MDM2 的3’UTR 序列結(jié)合。miR-335-3p 組MDM2 蛋白表達水平為0.14±0.02，顯著低于miR-NC 組的0.63±0.06（

t

=18.981，

P

＜0.001）；anti-miR-335-3p 組MDM2 蛋白表達水平為0.97±0.06，顯著高于anti-miR-NC 組的0.67±0.04（

t

=7.206，

P

＜0.001）。表明miR-335-3p在KM3細胞中靶向負調(diào)控MDM2表達，見圖1B。

圖1 miR-335-3p靶向調(diào)控MDM2表達：A為MDM2的3’非翻譯區(qū)（UTR）與miR-335-3p互補結(jié)合的核苷酸序列；B為miR-335-3p靶向調(diào)控MDM2蛋白表達

2.5 過表達MDM2能逆轉(zhuǎn)miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3 增殖的影響

與pcDNA3.1+miR-335-3p 組比較，pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 組KM3 細胞培養(yǎng)48 h、72 h后吸光度顯著升高（均

P

＜0.05），KM3細胞中cyclin D1 蛋白表達顯著升高（

P

＜0.05），P21 蛋白表達顯著降低（

P

＜0.05），表明過表達MDM2 部分逆轉(zhuǎn)過表達miR-335-3p 對KM3 細胞增殖的抑制作用。見圖2、表2。

表2 過表達MDM2逆轉(zhuǎn)miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3增殖的影響/±s

圖2 過表達MDM2逆轉(zhuǎn)miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3增殖的影響

2.6 過表達MDM2逆轉(zhuǎn)miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3 凋亡的影響

與pcDNA3.1+miR-335-3p 組比較，pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 組KM3 細胞的凋亡率顯著降低（

P

＜0.05），Bcl-2蛋白表達顯著升高（

P

＜0.05），Bax蛋白表達顯著降低（

P

＜0.05）。見表3。

表3 過表達MDM2逆轉(zhuǎn)miR-335-3p對KM3細胞凋亡的影響/±s

3 討論

miRNA 是一類小分子非編碼RNA，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有調(diào)控作用。研究已顯示，多種miRNA 在骨髓瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。miR-19a 在多發(fā)性骨髓瘤細胞株LP-1 和U266 中表達水平顯著升高，miR-19a 能夠促進骨髓瘤細胞的增殖和侵襲能力，并抑制骨髓瘤細胞的凋亡。多發(fā)性骨髓瘤病人血清中miRNA-181a 呈高表達，抑制miRNA-181a表達可降低骨髓瘤RPM18226 細胞的存活、集落形成和遷移能力。miRNA-20a在多發(fā)性骨髓瘤病人血漿中表達升高，其可促進骨髓瘤細胞的增殖，抑制骨髓瘤細胞凋亡，促進移植瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長，是治療多發(fā)性骨髓瘤的潛在靶點。研究骨髓瘤病人機體內(nèi)異常表達的miRNA 及其對骨髓瘤細胞生物學(xué)行為的影響，對了解骨髓瘤疾病發(fā)生的機制以及臨床基因治療有重要意義。

miR-335-3p 基因定位于7q32.2，參與多種腫瘤的發(fā)展進程。Luo 等研究顯示，miR-335-3p 靶向下調(diào)聚（ADP-核糖）聚合酶1 表達抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和體內(nèi)腫瘤生長。Wang 等研究顯示，miR-335-3p 過表達對乳腺癌細胞的細胞周期進程、遷移和侵襲具有明顯抑制作用。Gao 等研究顯示，miR-335-3p 在胃癌細胞中表達降低，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前，miR-335-3p 對骨髓瘤細胞增殖和凋亡的研究還未見報道。骨髓瘤的發(fā)生與發(fā)展是瘤細胞異常增殖和凋亡抑制的結(jié)果，通過調(diào)控骨髓瘤細胞的增殖和凋亡，可以延緩骨髓瘤的發(fā)展進程。本研究結(jié)果顯示，miR-335-3p 在骨髓瘤細胞KM3 和U266 中呈低表達，過表達miR-335-3p 對KM3 細胞增殖活性具有明顯抑制作用，而對KM3 細胞凋亡具有明顯促進作用，其可能通過間接調(diào)控增殖和凋亡相關(guān)蛋白cyclin D1、P21、Bax 和Bcl-2蛋白表達發(fā)揮作用，提示miR-335-3p可能成為骨髓瘤基因治療的分子靶標。

miRNA 通常通過調(diào)控其靶基因的表達發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用，為了進一步探討miR-335-3p 影響骨髓瘤細胞增殖和凋亡的分子機制，本研究證實了miR-335-3p 在KM3 細胞中靶向負調(diào)控MDM2 表達。MDM2 是一種原癌基因，在膀胱癌、乳腺癌、甲狀腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，下調(diào)MDM2 表達可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移。MDM2蛋白在骨髓瘤組織中表達升高，與病人臨床分期正相關(guān)，可能與cmyc 蛋白協(xié)同促進骨髓瘤的發(fā)展。抑制MDM2 表達可誘導(dǎo)骨髓瘤細胞凋亡，過表達MDM2 可通過激活E2F-1和下調(diào)細胞周期抑制蛋白（wtp53和p21）來加速骨髓瘤細胞的細胞周期進程，促進細胞增殖。本研究顯示，過表達MDM2 部分逆轉(zhuǎn)了過表達miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響，提示miR-335-3p 通過下調(diào)MDM2表達抑制骨髓瘤細胞的增殖，并促進其凋亡。

綜上所述，miR-335-3p 在骨髓瘤細胞中呈低表達，其可能通過下調(diào)MDM2 表達抑制骨髓瘤細胞的增殖，并促進骨髓瘤細胞凋亡，miR-335-3p/MDM2軸可能為骨髓瘤的治療提供了新靶點，但尚需動物模型實驗在體內(nèi)驗證miR-335-3p/MDM2 軸對骨髓瘤發(fā)生發(fā)展的影響。