朱張求，石孟瑤，方 莉，朱 潔，李澤庚，3，童佳兵，3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)呼吸病防治研究所，安徽 合肥 230031)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種可預(yù)防和治療的慢性疾病，其主要特征為氣流受限并呈進(jìn)行性發(fā)展。COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中炎癥機(jī)制是其主要的發(fā)病機(jī)制。慢性炎癥導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞浸潤在氣道、肺實(shí)質(zhì)及肺血管，炎癥因子如白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8, IL-8)與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)大量釋放，引起肺組織的滲出、水腫及黏液高分泌，導(dǎo)致氣道狹窄、痙攣及肺泡的通氣功能障礙，最終引起肺功能下降。

芪白平肺膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研發(fā)的具有溫陽益氣、化痰散瘀作用的院內(nèi)制劑，多年臨床研究證實(shí)該方能夠顯著改善COPD痰瘀阻肺證患者的炎癥狀態(tài)及肺功能，促進(jìn)COPD的康復(fù)。為了進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，本研究觀察芪白平肺膠囊對COPD痰瘀阻肺證模型大鼠的相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平及肺功能的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 選用80只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量(230±20)g，由山東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號(hào):SCXK 20190003)提供。將其隨機(jī)分為正常組、模型組、脾氨肽組、芪白平肺膠囊組，每組20只。動(dòng)物飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，動(dòng)物飼養(yǎng)室為清潔級(jí),控制溫度在(22±2)℃。

1.2 藥物與試劑 芪白平肺膠囊(由黃芪、生曬參、川芎、薤白、葶藶子、五味子、地龍組成),由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，生產(chǎn)批號(hào) 20190805；脾氨肽口服凍干粉，每瓶2 mg，由大連百利天華制藥公司生產(chǎn)；IL-1β ELISA試劑盒(批號(hào) JYM0419Ra)、IL-6 ELISA試劑盒(批號(hào) JYM0646Ra)、IL-8 ELISA試劑盒(批號(hào) JYM0583Ra)、TNF-α ELISA試劑盒(批號(hào) JYM0635Ra)均購自武漢基因美科技有限公司。

1.3 儀器 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)低氧裝置：上海塔望科技有限公司；2 m熏煙箱、大鼠強(qiáng)迫游泳槽：自制；紅梅牌香煙(焦油含量：13 mg；煙堿含量：1.1 mg)：紅塔卷煙集團(tuán)；RT-6000酶標(biāo)儀：深圳雷杜生命科學(xué)股份公司；JW3021HR離心機(jī)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；GL-88B漩渦混合器：海門其林貝爾儀器制造公司；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；RES3020小動(dòng)物肺功能儀：北京貝蘭博科技有限公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制及給藥 參照相關(guān)模型復(fù)制方法,每天將模型組、脾氨肽組及芪白平肺膠囊組大鼠放入恒溫(43±1)℃水槽中強(qiáng)迫游泳30 min,使其勞累而耗傷肺氣；然后將大鼠置于2 m熏煙箱內(nèi)被動(dòng)吸煙,每天用20支去過濾嘴紅梅牌香煙煙熏一次，每次0.4 h。最后將大鼠置于常壓低氧并通入氮?dú)獾牡脱跸鋬?nèi)，每天低氧7 h，用自動(dòng)測氧儀控制氧濃度為10.0%±0.5%，通過傳感器將CO濃度維持在0.03%，溫度傳感器控制低氧箱內(nèi)溫度始終恒定在22～24 ℃。蒸氣由變色硅膠(烘干后可反復(fù)使用)吸收。箱體由透明有機(jī)玻璃制造,可觀察大鼠活動(dòng)、進(jìn)食、飲水等情況。每日模型復(fù)制結(jié)束后，正常組及模型組大鼠予以0.9%氯化鈉溶液(10 mL/kg)灌胃，脾氨肽組每日將2瓶脾氨肽凍干粉(共4 mg)溶于100 mL 0.9%氯化鈉溶液中，然后按10 mL/kg對大鼠進(jìn)行灌胃，芪白平肺膠囊組每日將10粒芪白平肺膠囊(共4 g)溶于80 mL 0.9%氯化鈉溶液中，煮沸冷卻至室溫后，然后按10 mL/kg對大鼠進(jìn)行灌胃。連續(xù)復(fù)制模型1個(gè)月，每周一至周六復(fù)制模型，每周日喂食前將稱量大鼠體質(zhì)量。當(dāng)大鼠肺功能數(shù)據(jù)明顯降低，肺泡間隔明顯增厚或融合，大量炎癥細(xì)胞聚集在肺組織，即表明模型復(fù)制成功。

2.2 觀測指標(biāo)及方法

2.2.1 一般情況 觀察大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)、活動(dòng)、爪甲及唇舌顏色、有無異常呼吸音、體質(zhì)量、進(jìn)食量、大小便等。

2.2.2 肺功能檢測 按2 mL/kg劑量腹腔注射1%戊巴比妥麻醉大鼠，于頸部正中切開皮膚，鈍性剝離肌肉組織，暴露氣管并切開，插入連接有三通開關(guān)的氣管插管并結(jié)扎，仰臥位放置于密閉體積描計(jì)器內(nèi)，通過肺功能儀記錄第0.3秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 0.3 seconds,FEV0.3)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、FEV0.3占FVC比值(FEV0.3/FVC)的數(shù)值。

2.2.3 血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平檢測 末次給藥后禁食12 h，從腹主動(dòng)脈取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平。

2.2.4 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的采集 從腹主動(dòng)脈采血后，繼續(xù)剪開大鼠頸部皮膚，并打開胸腔，剝離覆蓋肺組織的胸腺和心包，找到氣管分支，先結(jié)扎右主支氣管，然后將9號(hào)小鼠灌胃針經(jīng)左主支氣管插入1 cm，并在灌胃針末端結(jié)扎，將4 ℃生理鹽水5 mL經(jīng)氣管注入左主支氣管及左肺，等待約30 s后，反復(fù)回抽3次，回抽液3～4 mL，回收率為65%～85%，將回收液置于5 mL離心管中，于4 ℃ 3 000 r/min離心20 min，吸取上清液，放置于2 mL冷凍管中，-80 ℃超低溫冰箱保存。BALF離心后所得的細(xì)胞沉淀用1 mL滅菌的PBS重懸后，保存于2 mL冷凍管中，4 ℃冰箱中保存，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類計(jì)數(shù)。

2.2.5 肺組織病理檢查 采集BALF后，分離右肺上葉，經(jīng)生理鹽水沖洗干凈后，用濾紙吸干表面水分，然后置于4%甲醛固定48 h后進(jìn)行石蠟包埋，切片，制片，最后進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察肺組織病理形態(tài)。

3 結(jié)果

3.1 4組大鼠一般情況比較 模型復(fù)制結(jié)束后，正常組大鼠精神狀態(tài)佳，呼吸平穩(wěn)，毛發(fā)光澤，食量正常，體質(zhì)量逐漸增加；模型組大鼠精神狀態(tài)較差，喜靜惡動(dòng)，毛發(fā)發(fā)黃欠光澤，呼吸音明顯較重，呼吸急促，部分大鼠肺部可聞及痰鳴音，唇舌部及爪甲發(fā)紺，進(jìn)食量減少，體質(zhì)量明顯減輕；脾氨肽組及芪白平肺膠囊組大鼠精神狀態(tài)佳，呼吸較平穩(wěn)，無明顯異常呼吸音，毛發(fā)光澤，體質(zhì)量逐漸增加，其中芪白平肺膠囊組大鼠一般狀態(tài)改善更為明顯。

3.2 4組大鼠肺組織形態(tài)比較 正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡充氣狀態(tài)良好,肺泡間隔無明顯增厚，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。與正常組比較，模型組大鼠肺泡普遍局限性增大，肺泡間隔明顯增厚或損壞，支氣管壁可見明顯黏液腺增生，大量炎癥細(xì)胞聚集在肺實(shí)質(zhì)和間質(zhì)，同時(shí)可見部分肺泡萎縮塌陷，管腔變窄，符合COPD的病理改變。與模型組比較，脾氨肽組及芪白平肺膠囊組大鼠肺泡間隔大多正常，可見少量萎縮肺泡和融合肺泡，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，氣管壁黏液腺增生明顯改善，其中芪白平肺膠囊組大鼠肺組織病理變化改善更為明顯。見圖1。

注：A.正常組；B.模型組；C.脾氨肽組；D.芪白平肺膠囊組

3.3 4組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著升高(

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05)；與模型組比較，脾氨肽組和芪白平肺膠囊組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著降低(

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05)；芪白平肺膠囊組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著低于脾氨肽組(

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05)。見表1。

表1 4組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平比較

3.4 4組大鼠肺功能比較 與正常組比較，模型組大鼠的FEV0.3、FEV0.3/FVC、FVC顯著下降(

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05)；與模型組比較，脾氨肽組和芪白平肺膠囊組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、FVC顯著升高(

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05)；芪白平肺膠囊組大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、FVC顯著高于脾氨肽組(

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05)。見表2。

表2 4組大鼠肺功能比較

3.5 4組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及炎癥細(xì)胞比例比較 與正常組比較，模型組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)和單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例均明顯升高(

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05)；與模型組比較，脾氨肽組和芪白平肺膠囊組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)和單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例顯著降低(

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05)；芪白平肺膠囊組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)和單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例顯著低于脾氨肽組(

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<0

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05)。見表3。

表3 4組大鼠支氣管BALF中白細(xì)胞總數(shù)和炎癥細(xì)胞比例比較

4 討論

COPD是一種高發(fā)病率及高致死率的慢性炎癥性疾病。COPD患者炎癥反應(yīng)不僅影響到整個(gè)肺臟而且涉及全身，但是局部炎癥較重，直接或間接引起相關(guān)炎癥因子水平升高。IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子過度釋放，導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)和功能的破壞，影響肺通氣和換氣，從而引起肺功能的下降，疾病進(jìn)行性加重。如果不積極治療，則會(huì)引起高碳酸血癥、低氧血癥、肺動(dòng)脈高壓等多種并發(fā)癥，危及患者生命安全。TNF-α是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的一種重要的促炎因子，不僅可以誘導(dǎo)氣道內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子1及其mRNA表達(dá)，促進(jìn)黏液分泌，引起肺組織的增生，同時(shí)可以介導(dǎo)IL-6、IL-8的合成及釋放，從而引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步加劇。白細(xì)胞介素在炎癥反應(yīng)中也有重要作用，如IL-6、IL-8、IL-1β可以通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集、淋巴細(xì)胞粘附，從而釋放溶酶體酶、蛋白水解酶和脂類介質(zhì)等炎癥介質(zhì)，激化氧化應(yīng)激反應(yīng),從而產(chǎn)生對肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性損傷,參與或加重COPD氣道炎癥反應(yīng)過程。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠FEV0.3/FVC較正常組顯著降低，提示其氣道阻力增加，存在氣流受限和肺通氣功能障礙，即肺功能降低，符合COPD模型的基本特征，表明模型復(fù)制成功。經(jīng)脾氨肽及芪白平肺膠囊藥物干預(yù)后，大鼠血清炎癥指標(biāo)、BALF中炎癥細(xì)胞浸潤明顯降低，肺組織病理及肺功能明顯改善，提示脾氨肽及芪白平肺膠囊均具有改善COPD痰瘀阻肺證大鼠炎癥水平和改善肺功能的作用，但芪白平肺膠囊的治療效果明顯優(yōu)于脾氨肽。

中醫(yī)學(xué)將COPD歸屬“肺脹”范疇?！端貑枴ご笃嬲摗罚骸胺沃眨鴥擅{滿?！逼洳±硪蛩刂饕恰疤怠薄梆觥?，患者初期多僅表現(xiàn)為咳嗽癥狀，隨著病情的發(fā)展，患者可出現(xiàn)咳痰、胸悶、喘息等癥狀，與COPD有許多相似之處。肺脹之初以氣虛為本，病本失治則漸累肺腎之氣。《素問·評熱病論》曰：“邪之所湊，其氣必虛?！薄蹲C治準(zhǔn)繩·喘》亦云：“肺虛則少氣而喘?！狈螝馓摀p，子盜母氣，則肺脾兩虛，水飲運(yùn)化失調(diào)，聚為痰飲，壅塞肺道。此外，氣為血之帥，氣虛日久，血液運(yùn)行受阻，則生瘀血。肺久病及腎，腎陽受損，蒸化失調(diào)，加劇痰飲的形成及壅塞肺道，且腎失納氣，則日久喘促。因此，益氣溫陽、化痰散瘀可為本病之治療大法。芪白平肺膠囊方中黃芪、生曬參合而為君，兩藥性溫而補(bǔ)元?dú)狻⒁嫫⒎?，共奏益氣溫陽之功。川芎辛散溫通，為“血中之氣藥”，活血行氣，使瘀去血行；薤白溫通辛散，理氣通陽，散陰寒邪氣；葶藶子辛散，善瀉肺中痰飲而平喘，且具行水消腫之功，上三者共為臣藥。五味子味酸性溫，能上斂肺氣止咳，下滋腎陰固腎平喘；地龍性散走竄，清肺定喘、通行經(jīng)絡(luò)，合為佐藥。諸藥合用，共奏益氣溫陽、化痰散瘀之功。

脾氨肽是一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑，是從健康動(dòng)物脾臟中提取的肽及核苷酸類復(fù)合物，可單獨(dú)或協(xié)助用于感染性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤性疾病的治療。脾氨肽進(jìn)入人體后，作用于免疫信息傳遞、淋巴細(xì)胞活化和受體調(diào)節(jié)3個(gè)環(huán)節(jié)，通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡，提高機(jī)體的免疫功能，有效抑制炎癥反應(yīng)。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：黃芪中黃芪多糖可調(diào)控Toll樣受體4/核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低相關(guān)炎癥遞質(zhì)的含量，從而發(fā)揮抗炎作用；川芎可以阻礙相關(guān)炎癥信號(hào)傳遞,影響下游蛋白的表達(dá),發(fā)揮抗炎作用；五味子總木脂素能夠調(diào)控NF-κB、過氧化物酶體增殖物激活受體等信號(hào)通路，抑制促炎因子的表達(dá)；地龍醇提物通過抑制毛細(xì)血管通透性，從而減輕肺部的炎癥滲出，改善肺功能；薤白可以通過6-酮前列腺素F1α下調(diào)IL-6、血栓素B的水平,從而抑制炎癥反應(yīng),緩解支氣管平滑肌的痙攣；葶藶子的化合物山柰酚可通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路，抑制下游炎癥因子分泌，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化的重要作用；人參麥芽酚通過清除自由基抑制脂質(zhì)過氧化物的形成。同時(shí)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，芪白平肺膠囊中揮發(fā)性成分乙酸乙酯、4-松油醇等成分具有明顯的平喘作用。因此，芪白平肺膠囊具有較好的抗炎和耐低氧作用。

綜上所述，芪白平肺膠囊可明顯改善COPD痰瘀阻肺證模型大鼠的肺組織病理損傷，改善其肺功能，這種作用可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。然而，COPD的發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，芪白平肺膠囊下調(diào)相關(guān)炎癥指標(biāo)的作用通路尚未闡明，有待后續(xù)深入探究。