UHPLC-MS/MS同時測定黃芩清熱除痹膠囊中6種活性成分

董心同，甘珮榮，柯江濤，陳芳園，吳 虹，陳 建，劉 健

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，安徽 合肥 230012；5.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕科，安徽 合肥 230031)

黃芩清熱除痹膠囊(Huangqin Qingre Chubi Capsule, HQC)作為安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院的院內制劑，由黃芩、梔子、威靈仙、薏苡仁、桃仁5味中藥組成。該方從脾論治痹證，發(fā)揮健脾化濕、清熱通絡功效，臨床廣泛用于因風寒濕熱引發(fā)的類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、強直性脊柱炎、痛風性關節(jié)炎等免疫系統(tǒng)疾病。雖然HQC的臨床療效確切，但目前其質量控制指標的研究尚屬空白。

多成分協同作用是中藥復方發(fā)揮藥效的方式。黃芩和梔子的有效成分黃芩苷和梔子苷在抗炎、抗氧化應激功效中具有重要作用，有報道稱黃芩苷在潰瘍性結腸炎大鼠模型中調節(jié)Th17/Treg平衡，抑制腸組織中活性氧、丙二醛水平。梔子苷介導RhoA/p38MAPK/NF-κB/F-actin信號傳導，減弱脂多糖誘導的成纖維滑膜細胞高通透性，調節(jié)促炎細胞因子白細胞介素-1β和抗炎細胞因子(白細胞介素-4,轉化生長因子β1)的相對平衡。研究表明，威靈仙的有效成分齊墩果酸具有抗炎、調節(jié)免疫、抗氧化的作用，其另一活性成分木犀草素通過抑制核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-кB)介導的炎癥反應以及激活核因子E2相關因子2參與的抗氧化反應保護糖尿病小鼠的心臟。薏苡仁提取的多酚薏苡素通過抑制NF-κB、NOD樣受體蛋白3炎癥小體激活發(fā)揮抗炎作用。桃仁的指標性成分苦杏仁苷可調節(jié)多種炎癥細胞因子介導的通路，減輕動脈粥樣硬化、糖尿病腎病模型大鼠癥狀。本研究依據HQC組成及藥理活性確定多種質量控制指標，建立超高效液相色譜-串聯質譜(ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS)/MS法，為HQC質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AB SCIEX ExionLC AD型超高效液相色譜儀：美國AB SCIEX公司；AB SCIEX QTRAP 5500三重四極桿質譜聯用儀：美國AB SCIEX公司；Analyst1.7.0軟件數據系統(tǒng)：美國AB SCIEX公司；Milli-Q Gradient A10超純水器：美國MILLIPORE公司；KQ-7-200 DTD超聲波清洗機(功率200 W，頻率80 kHz)：鞏義市予華儀器有限責任有限公司；ME204電子天平：瑞士METTLE TOEDO公司。

1.2 試藥 黃芩苷(批號DSTDH002301，純度98%)：成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；梔子苷(批號110749-200714，純度98%)：中國食品藥品檢定研究院；齊墩果酸(批號110709-200304，純度98%)：中國食品藥品檢定研究院；木犀草素(批號CHB180113，純度98%)：成都克洛瑪生物科技有限公司；薏苡素(批號CHB201103，純度98%)：成都克洛瑪生物科技有限公司；苦杏仁苷(批號DST200710-004，純度98%)：成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；樣品HQC均由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供；水為超純水；質譜分析用甲酸、甲醇和乙腈均為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷1.99 mg、梔子苷1.00 mg、齊墩果酸2.28 mg、木犀草素2.00 mg、薏苡素1.12 mg、苦杏仁苷2.01 mg對照品，分別置10 mL容量瓶，加甲醇溶解定容，制成濃度分別為0.199、0.100、0.228、0.200、0.112、0.201 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取適量的各對照品儲備液，加甲醇逐級稀釋，制成分別含黃芩苷4.98 μg/mL、梔子苷1.00 μg/mL、齊墩果酸1.14 μg/mL、木犀草素0.010 0 μg/mL、薏苡素0.011 2 μg/mL、苦杏仁苷0.101 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 供試品溶液Ⅰ 取本品內容物適量，研細，取細粉1.00 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇-水100 mL，稱定質量，超聲(功率200 W，頻率40 kHz)處理30 min，冷卻至室溫后稱質量，以50%甲醇水補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液Ⅰ，精密吸取供試品溶液Ⅰ適量，加50%甲醇逐級稀釋，分別用于定量檢測不同物質，稀釋100倍用于檢測黃芩苷、梔子苷，稀釋1 000倍用于檢測木犀草素、苦杏仁苷，稀釋10 000倍用于檢測薏苡素。

2.2.2 供試品溶液Ⅱ 參考2020年版《中華人民共和國藥典》威靈仙的質量標準含量測定方法制備供試品溶液Ⅱ。取本品內容物研細，取約1.00 g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙酸乙酯適量，加熱回流3 h，棄去乙酸乙酯液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒轉移至錐形瓶，精密量取稀乙醇50 mL加入，稱質量，加熱回流1 h，放冷后再稱質量，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，置水浴上蒸干，殘渣加2 mol/L鹽酸溶液30 mL使之溶解，加熱回流2 h，冷卻后移入分液漏斗中，用10 mL水分次洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取3次，每次15 mL，合并提取液，70 ℃以下濃縮至近干，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液Ⅱ，精密吸取供試品溶液Ⅱ適量，加甲醇稀釋1 000倍用于檢測齊墩果酸。

2.3 色譜-質譜條件

2.3.1 色譜條件 采用Phenomenex Luna Omega C色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.6 μm)，以含10 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸的乙腈(B)為流動相，洗脫梯度:0～0.5 min，5% B；0.5～1.5 min，5%～40% B；1.5～3.0 min，40% B；3.0～4.5 min，40%～100% B；4.5～6.5 min，100% B；6.5～8.5 min，100%～5% B；8.5～10 min，5% B。每次進樣前預平衡3 min，再進行洗脫程序，流速0.25 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。

2.3.2 質譜條件 采用多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)的掃描方式，離子源為電噴霧離子源，負離子模式。離子化電壓為-4 500 V，離子源溫度為450 ℃，噴霧氣為379 kPa，輔助氣為448 kPa，氣簾氣為172 kPa，碰撞氣壓力為中等。黃芩苷、梔子苷、齊墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷6種待測化合物的質譜條件見表1。

表1 UHPLC-MS/MS同時測定6種活性成分質譜參數

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 精密吸取混合對照品溶液和稀釋后的供試品溶液Ⅰ、Ⅱ，按“2.3”項下條件進行測定，MRM色譜圖見圖1。上述色譜-質譜條件下，稀釋后的供試品溶液Ⅰ、Ⅱ中各待測成分與6個對照品保留時間一致。各測定成分分離效果良好，無其他雜質干擾，表明本法專屬性良好。

圖1 混合對照品溶液(A)、供試品溶液(B)的MRM色譜圖

2.4.2 線性關系考察 取“2.1”項下混合對照品溶液適量，依次向下稀釋2、8、16、32、64倍，按“2.3”項下條件進樣分析，以對照品濃度(

x

)為橫坐標、峰面積(

y

)為縱坐標，進行加權(1/

x

)線性回歸，計算得到各成分回歸方程。將混合對照品溶液逐步稀釋并進行測定，并以信噪比S/N=3和S/N=10時各對照品的量作為檢測限(levels of detection,LOD)和定量限(limit of quantity,LOQ)。結果顯示，6種活性成分在各自線性范圍內具有良好線性關系，見表2。

表2 6種活性成分的線性關系考察

2.4.3 精密度試驗 取“2.1”項下混合對照品溶液，加甲醇稀釋8倍，精密吸取稀釋后的混合對照品溶液適量，按“2.3”項下條件連續(xù)進樣6次，記錄各成分峰面積，結果黃芩苷、梔子苷、齊墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷峰面積的RSD分別為1.07%、2.06%、0.940%、2.62%、3.14%、1.17%，表示儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液Ⅰ、Ⅱ，按“2.3”項下條件分別于0、3、6、10、15、24 h進樣分析，記錄黃芩苷、梔子苷、齊墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷色譜峰面積，結果各成分峰面積的RSD(

n

=6)分別為0.600%、3.07%、1.11%、1.15%、3.36%、1.39%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。2.4.5 重復性試驗 取同一批次的樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液Ⅰ、Ⅱ各6份，按“2.3”項下條件進樣分析，記錄峰面積，計算含量。結果黃芩苷、梔子苷、齊墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷峰面積的RSD(

n

=6)分別為2.45%、3.61%、1.48%、3.74%、3.35%、1.45%，表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的HQC樣品9份，每份取約1.00 g，精密稱定，按每3份為一組，每組精密加入對照品黃芩苷、梔子苷、齊墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷的量相當于HQC樣品中各對照品含量的50%、100%、150%，按“2.2”項下方法制備供試品溶液Ⅰ、Ⅱ，精密吸取各供試品溶液5 μL，按“2.3”項下條件進樣分析，測定峰面積，分別計算6種成分加樣回收率和RSD。結果顯示，黃芩苷、梔子苷、齊墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷平均加樣回收率分別為98.62%、100.2%、102.9%、103.7%、100.7%、100.5%，RSD分別為2.53%、1.85%、2.70%、2.15%、1.96%、2.18%。結果表明該方法準確度良好。

2.5 樣品含量測定 取供試品3批，每批取3份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液Ⅰ、Ⅱ，按“2.3”項下條件測定，分別計算每粒膠囊中黃芩苷、梔子苷、齊墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷的含量。3個批次含量測定中，每粒膠囊中黃芩苷、梔子苷、齊墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷的含量分別為(2.860±0.046)mg、(0.164±0.010)mg、(0.159±0.010)mg、(0.104±0.010)mg、(0.126±0.011)mg、(0.318±0.018)mg。其中黃芩苷含量最高，梔子苷、齊墩果酸、苦杏仁苷、薏苡素含量次之，木犀草素含量較低。不同批次樣品中6種成分含量差異較小，質量較穩(wěn)定。見表3。

表3 3批次樣品6種成分含量測定結果

3 討論

3.1 含量測定方法的建立 中藥復方質量控制是保障復方制劑安全有效的基礎。HQC具有明顯抗炎、抗氧化應激的藥理活性，但目前尚未有關于HQC有效成分鑒別及含量測定的研究。查閱相關含量測定方法的文獻發(fā)現，Liu等將龍膽瀉肝丸中黃芩苷和梔子苷作為黃芩和梔子的質量控制指標，采用高效液相色譜-二極管陣列及電噴霧串聯質譜聯用對其鑒定與測定。高曉潔等采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測定威靈仙類藥材中齊墩果酸的含量，為威靈仙藥源提供了參考。有研究采用HPLC建立桃仁及其炮制品的指紋圖譜，測定苦杏仁苷的含量。楊陽等應用HPLC測定不同產地薏苡中薏苡素含量，辨識藥材品質。但以上研究多以單指標成分作為質量控制檢測指標，難以全面反映中藥質量。本研究采用UHPLC-MS/MS技術同時定量分析HQC中6種活性成分，為HQC質量控制提供穩(wěn)定分析方法。

3.2 樣品處理方法的選擇 本研究考察了提取方法、提取溶劑、提取時間對6種待測成分提取的影響。首先采用超聲處理并分別以甲醇、50%甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜為提取溶劑，結果50%甲醇超聲處理作為提取溶劑時黃芩苷、梔子苷、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷峰面積較大，雜質相對較少，提取效率最高，操作簡單，而齊墩果酸未檢出，原因可能是齊墩果酸在藥材中含量較少，且多以苷和游離態(tài)形式存在。因此，本實驗參考2020年版《中華人民共和國藥典》威靈仙中齊墩果酸含量測定的方法，采用索氏提取法，酸水解后用乙酸乙酯提取，結果齊墩果酸被檢出，余下待測成分雖部分被檢出，但均低于超聲提取時色譜峰響應值。此外，分別考察了20、30、60 min超聲提取時間對HQC活性成分提取的影響，結果發(fā)現與超聲20 min時比較，超聲30 min時供試品溶液Ⅰ待測成分含量高，超聲30、60 min時，供試品溶液Ⅰ待測成分含量無明顯變化。因此，最終確定最佳提取條件為50%甲醇為提取溶劑，超聲處理30 min，供試品溶液Ⅱ最佳提取條件參考2020年版《中華人民共和國藥典》威靈仙質量標準中含量測定的方法。

3.3 色譜條件的選擇 為獲得最佳分離效果，實驗優(yōu)化了流動相組成、梯度洗脫條件、流速。分別對0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、含10 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液-乙腈、含10 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸的乙腈進行考察，發(fā)現乙腈作為洗脫液時，HQC中目標成分響應相對較強，峰形尖銳，基線噪音顯著降低。此外，調整流動相pH值，加入0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨使色譜峰響應增強、拖尾減少。最終采用含10 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸的乙腈(B)進行梯度洗脫。

3.4 質譜條件的選擇 為滿足多成分同時定量的需求，選用MRM掃描模式下正負離子同時檢測，發(fā)現負離子模式使6種目標化合物在檢測條件下更穩(wěn)定，響應值更佳。此外，分別優(yōu)化了各待測成分的去簇電壓和碰撞能量以獲得響應強度較高的色譜峰。

本研究建立了HQC中黃芩苷、梔子苷、齊墩果酸、木犀草素、薏苡素、苦杏仁苷6種活性成分的含量測定方法，其分析時間短、專屬性好、重復性好、穩(wěn)定性高，可為HQC的質量控制提供可靠的分析方法。