劉松楊，程 楠，徐陳陳，董健健，高曼莉

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061)

Wilson病(Wilson’s disease，WD)是由ATP7B基因突變引起以銅代謝障礙為表現(xiàn)的神經(jīng)性遺傳病。部分WD患者，特別是腦型患者伴有較明顯的認(rèn)知功能障礙，臨床主要表現(xiàn)為記憶力減退、學(xué)習(xí)能力下降等。安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所自1970年代開(kāi)始使用具有清熱解毒、通腑利濕作用的肝豆湯治療WD患者獲得顯著臨床療效。肝豆湯改良方是在原肝豆湯組方基礎(chǔ)上加芍藥、山茱萸、三七等活血養(yǎng)髓藥物組成，該改良方可改善腦損傷與肝損傷WD患者的認(rèn)知功能。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，肝豆湯改良方可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞色素C(cytochrome-C, Cyt-C)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific protease, Caspase)信號(hào)通路達(dá)到減輕高銅誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷。雙鏈RNA依賴蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)作為一種泛素化蛋白激酶參與多種生理病理過(guò)程。銅沉積于腦中可引起氧化應(yīng)激，激活PKR，激活后的PKR會(huì)進(jìn)一步促使真核細(xì)胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致突觸功能障礙。而突觸功能障礙是多數(shù)神經(jīng)退行性疾病及認(rèn)知功能障礙性疾病的致病機(jī)制之一。研究證實(shí)，高銅可通過(guò)激活PKR/eIF2α通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,抑制突觸相關(guān)蛋白表達(dá)，損傷突觸功能，降低小鼠的認(rèn)知功能。高銅誘導(dǎo)的突觸功能障礙，可能是腦型WD患者出現(xiàn)認(rèn)知功能損傷的重要機(jī)制，而肝豆湯改良方通過(guò)抑制PKR/eIF2α通路減輕高銅誘導(dǎo)的突觸功能障礙，改善WD患者認(rèn)知功能。本實(shí)驗(yàn)以毒牛奶(toxic milk，TX)小鼠為研究對(duì)象，基于PKR/eIF2α通路探究肝豆湯改良方改善高銅誘導(dǎo)的突觸功能障礙的作用靶點(diǎn)，旨在為肝豆湯改良方治療腦型WD患者認(rèn)知功能障礙提供分子學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床中醫(yī)藥治療提供新的治療思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物 TX種鼠從美國(guó)Jackson動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中心引進(jìn)，在中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)研究院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)并傳代繁殖。動(dòng)物由專人負(fù)責(zé)，環(huán)境溫度保持22～26 ℃，12 h光照，常規(guī)鼠類飼料喂養(yǎng)，自由飲水。TX小鼠是淡化致死基因(dilute lethal,DL)小鼠的自然突變品系，是理想的WD動(dòng)物模型。本次實(shí)驗(yàn)選擇DL和TX小鼠各40只，每只小鼠體質(zhì)量為20～25 g。模型動(dòng)物在入組前均進(jìn)行基因檢測(cè)以確定種鼠及其子代的遺傳具有WD模型的特性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(皖)2018-005。

1.2 藥物及試劑 肝豆湯改良方：大黃、黃連、莪術(shù)、姜黃、芍藥各20 g，魚腥草、山茱萸各30 g，澤瀉24 g，三七3 g。藥物均購(gòu)自北京同仁堂藥店安徽合肥分店，均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。加入蒸餾水200 mL，浸泡30 min，大火煮沸后加入大黃，再以文火煎30 min，過(guò)濾至燒杯中，藥渣再加入蒸餾水200 mL，重復(fù)煎煮過(guò)濾。最后把2次藥液合并，文火濃縮至150 mL(含生藥2.2 g/mL)，冷卻后倒入棕色瓶?jī)?nèi)，并于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。Western及RIPA組織/細(xì)胞裂解液(R0020)：北京索萊寶科技有限公司；抗eIF2α抗體(ab5324)、抗p-eIF2α抗體(ab3398)、抗轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)抗體(ab3398)、抗促凋亡分子C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein，CHOP)抗體(ab5554)、抗突觸蛋白1(synapsin1)抗體(ab5297)、抗突觸素(synaptophysin)抗體(ab36406)、抗突觸后致密物-93(postsynaptic density-93，PSD-93)抗體(ab19046)、抗突觸后致密物-95(postsynaptic density-95，PSD-95)抗體(ab3450)：CST公司；抗PKR抗體(ab184257)：英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗(ZB-2301)：北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.3 儀器 Fine DO X6型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；TGL-16型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；PowerPac Basic型蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；Dura 12FV實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)：美國(guó)The-Lab Corporation-澤拉布儀器科技有限公司。

2 方法

2.1 分組及給藥方法 正常組、正常加肝豆湯改良方組(DL小鼠各20只)，模型組、模型加肝豆湯改良方組(TX小鼠各20只)。正常組與模型組每日分2次予生理鹽水各20 mL/kg灌胃，連續(xù)4周；正常加肝豆湯改良方組與模型加肝豆湯改良方組每日分2次予中藥肝豆湯改良方各20 mL/kg(相當(dāng)于60 kg成人臨床劑量的9倍)灌胃，連續(xù)4周。末次給藥結(jié)束后，取各組小鼠海馬組織進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 行為學(xué)檢測(cè)小鼠認(rèn)知功能 分別從正常組、正常加肝豆湯改良方組、模型組、模型加肝豆湯改良方組中隨機(jī)抽取6只進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 試驗(yàn)所需的裝置為長(zhǎng)、寬各50 cm，高40 cm區(qū)域，其底部分為3個(gè)區(qū)域，邊緣區(qū)(1區(qū))，中間區(qū)(2區(qū))，中心區(qū)(3區(qū))。1區(qū)距離曠場(chǎng)邊緣8 cm，3區(qū)占總區(qū)域面積的16%，剩下為2區(qū)。在曠場(chǎng)中的同一位置，將所有實(shí)驗(yàn)小鼠面壁放入曠場(chǎng)中，記錄小鼠在曠場(chǎng)中5 min內(nèi)的自由活動(dòng)情況。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)用荷蘭Noldus公司的Ethovision XT監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)并分析。

2.2.2 Barnes迷宮 Barnes迷宮所需裝置高99 cm，直徑122 cm，有20個(gè)均勻分布的孔，距邊緣2 cm。這些孔的直徑10 cm、外觀均勻，只有一個(gè)孔連接到黑色可移動(dòng)的逃生盒。訓(xùn)練時(shí)，先將小鼠放在逃生盒30 s讓其熟悉環(huán)境，30 s后將小鼠拿到平臺(tái)并計(jì)時(shí)3 min觀察小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡與能否找到逃生盒。共訓(xùn)練4 d，每天2次，每次間隔30 min。在第5天進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試方法與訓(xùn)練相同。記錄其找到目標(biāo)洞口的潛伏期。

2.3 TUNEL染色法檢測(cè)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷情況 取小鼠海馬組織進(jìn)行固定、石蠟包埋、組織切片。TUNEL染色：切片常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)、TUNEL反應(yīng)液室溫避光孵育、PBS漂洗、DAPI復(fù)染、PBS漂洗、封片。熒光顯微鏡下觀察采集圖像，TUNEL陽(yáng)性表達(dá)呈綠色。采用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。

2.4 免疫熒光檢測(cè)小鼠海馬8-羥化脫氧鳥苷(8-hydroxylated deoxyguanosine，8-OHdG)表達(dá)水平 取小鼠海馬組織進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片。切片用一抗孵育4 ℃過(guò)夜、二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗、DAPI細(xì)胞核染色。熒光顯微鏡下觀察采集圖像，8-OHdG陽(yáng)性表達(dá)呈紅色。Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。

2.5 Western blot檢測(cè)海馬PKR/eIF2α通路以及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取小鼠海馬組織，通過(guò)BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白濃度。之后，將4倍蛋白上樣緩沖液添加到蛋白質(zhì)溶液中，并加熱8 min以使蛋白質(zhì)變性。制膠電泳轉(zhuǎn)膜，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至NC膜上。膜用5%脫脂奶粉封閉4 h，TBST洗3次，每次10 min，一抗搖床4 ℃過(guò)夜。二抗搖床1.5 h，TBST洗3次，每次10 min。凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 肝豆湯改良方對(duì)WD模型TX小鼠認(rèn)知功能的影響 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組中央路程與中央時(shí)間顯著低于正常組(

P

<0

.

05)，邊上路程與邊上時(shí)間顯著高于正常組(

P

<0

.

05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組中央路程與中央時(shí)間顯著增加(

P

<0

.

05)，邊上路程與邊上時(shí)間顯著降低(

P

<0

.

05)。Barnes迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組找到目標(biāo)洞口的潛伏期顯著高于正常組(

P

<0

.

05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組小鼠找到目標(biāo)洞口的潛伏期顯著降低(

P

<0

.

05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

3.2 肝豆湯改良方對(duì)WD模型TX小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的改善作用 與正常組比較，模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加(

P

<0

.

05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著降低(

P

<0

.

05)。見(jiàn)圖1。

注：A.正常組；B.正常加肝豆湯改良方組；C.模型組；D.模型加肝豆湯改良方組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 肝豆湯改良方對(duì)WD模型TX小鼠海馬8-OHdG表達(dá)水平的影響 與正常組比較，模型組海馬8-OHdG表達(dá)水平顯著增加(

P

<0

.

05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組8-OHdG表達(dá)水平顯著降低(

P

<0

.

05)。見(jiàn)圖2。

注：A.正常組；B.正常加肝豆湯改良方組；C.模型組；D.模型加肝豆湯改良方組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.4 肝豆湯改良方對(duì)Wilson病模型TX小鼠海馬PKR/eIF2α通路及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與正常組比較，模型組海馬PSD-93、PSD-95、Synapsin-1、Synaptophysin蛋白表達(dá)水平均顯著降低(

P

<0

.

05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組海馬PSD-93、PSD-95、Synapsin-1、Synaptophysin蛋白表達(dá)水平均顯著增加(

P

<0

.

05)。見(jiàn)圖3。

注：A.正常組；B.正常加肝豆湯改良方組；C.模型組；D.模型加肝豆湯改良方組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

與正常組比較，模型組海馬PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平均顯著增加(

P

<0

.

05)；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組海馬PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平均顯著降低(

P

<0

.

05)。見(jiàn)圖4。

注：A.正常組；B.正常加肝豆湯改良方組；C.模型組；D.模型加肝豆湯改良方組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

銅是人體必需的一種金屬微量元素，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持具有必不可少的作用。而環(huán)境或遺傳因素所致的體內(nèi)銅缺乏或沉積均會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。近年來(lái)，人們逐步認(rèn)識(shí)到部分神經(jīng)退行性疾病與中樞神經(jīng)系統(tǒng)銅穩(wěn)態(tài)的失調(diào)控相關(guān)，如WD。

銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)與認(rèn)知功能的關(guān)系已吸引更多研究者的注意。阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者腦中銅含量顯著升高，其銅穩(wěn)態(tài)的失衡可能導(dǎo)致AD患者認(rèn)知缺陷和其病理的加重。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，普通小鼠海馬注射Cu-Aβ1-42，可出現(xiàn)認(rèn)知障礙，經(jīng)過(guò)銅螯合劑治療之后，實(shí)驗(yàn)小鼠的認(rèn)知功能顯著改善；長(zhǎng)期銅暴露不僅會(huì)加速AD小鼠認(rèn)知功能下降，而且會(huì)使正常小鼠出現(xiàn)認(rèn)知損傷。為了研究WD患者高銅水平對(duì)認(rèn)知功能的影響，本實(shí)驗(yàn)選用TX小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)行為學(xué)結(jié)果顯示，模型組小鼠的認(rèn)知功能顯著低于正常組；模型加肝豆湯改良方組小鼠的認(rèn)知功能顯著優(yōu)于模型組。由此可見(jiàn)，中藥肝豆湯改良方可改善TX小鼠的認(rèn)知功能。

突觸是神經(jīng)細(xì)胞相接觸部分的功能特化區(qū)，也是多種學(xué)習(xí)形式的基礎(chǔ)，其功能紊亂可導(dǎo)致認(rèn)知損害。Synaptophysin是一種特異性存在突觸囊泡膜上的糖蛋白，反映突觸分布與密度；Synapsin1是一種神經(jīng)細(xì)胞特異的磷酸化蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)突觸前囊泡釋放和突觸傳遞來(lái)影響其突觸功能。作為興奮性突觸后密度的支架蛋白，PSD-93通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，對(duì)突觸可塑性尤其是在短時(shí)程突觸可塑性的發(fā)生過(guò)程中起到關(guān)鍵作用；PSD-95在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中涉及谷氨酸能傳遞，是突觸可塑性和樹(shù)突棘形態(tài)發(fā)生的重要組成部分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組海馬區(qū)Synapsin1、Synaptophysin、PSD-93、PSD-95的蛋白表達(dá)量顯著降低；與模型組比較，模型加肝豆湯改良方組海馬區(qū)Synapsin1、Synaptophysin、PSD-93、PSD-95的蛋白表達(dá)水平顯著增加。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TX小鼠存在突觸功能障礙，中藥肝豆湯改良方可改善TX小鼠突觸功能。

8-OHdG是氧化應(yīng)激或者含氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的羥基自由基，是氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組海馬8-OHdG表達(dá)水平顯著高于正常組；模型加肝豆湯改良方組8-OHdG表達(dá)水平顯著低于模型組。這表明中藥肝豆湯改良方可降低銅沉積所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

腦內(nèi)銅沉積可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，激活PKR/eIF2α通路?；罨蟮腜KR可誘導(dǎo)真核eIF2α發(fā)生磷酸化，減少蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，p-eIF2α通過(guò)調(diào)控突觸可塑性，進(jìn)而損傷患者的記憶功能。增加的P-eIF2α可以選擇性刺激ATF4的翻譯，促進(jìn)凋亡分子CHOP的表達(dá)增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制突觸相關(guān)蛋白Synapsin1、 Synaptophysin、PSD-93、PSD-95表達(dá)，損傷突觸功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平較正常組顯著增加；模型加肝豆湯改良方組PKR、P-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平較模型組顯著下調(diào)。TUNEL染色結(jié)果顯示，肝豆湯改良方可顯著降低TX小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，高銅環(huán)境可激活PKR/eIF2α通路誘導(dǎo)突觸功能，而肝豆湯改良方可通過(guò)抑制PKR/eIF2α通路減輕高銅誘導(dǎo)突觸功能障礙，改善TX小鼠認(rèn)知功能損傷。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為，TX小鼠海馬內(nèi)PKR/eIF2α通路被激活，誘導(dǎo)突觸功能障礙，損傷TX小鼠認(rèn)知功能；中藥肝豆湯改良方可通過(guò)調(diào)控PKR/eIF2α通路，促進(jìn)突觸相關(guān)蛋白表達(dá)，減輕高銅誘導(dǎo)的突觸功能障礙，改善TX小鼠認(rèn)知功能損傷癥狀。