陳麗君，闞紅星，丁 然，侯 俊，楊銀鳳

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)藥信息工程學(xué)院,安徽 合肥 230012)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)通常表現(xiàn)為氣道反應(yīng)過度，嗜酸性炎癥和咳嗽。CVA是哮喘的前兆。據(jù)統(tǒng)計(jì),有50%～80%的兒童和10%～33%的CVA成人會發(fā)展為典型的哮喘。CVA的發(fā)病機(jī)制及病理生理表現(xiàn)與典型哮喘相似，均為多種炎癥細(xì)胞和炎癥遞質(zhì)參與的慢性呼吸道炎癥性疾病。目前治療CVA的藥物有激素和支氣管擴(kuò)張劑，但此類藥物長期使用存在毒性和不良反應(yīng)，而且停藥后易復(fù)發(fā)。

止嗽散收載于清代程鐘齡《醫(yī)學(xué)心悟》中，對CVA具有顯著的療效。該方由桔梗、甘草、白前、紫菀、荊芥、陳皮、百部組成。方中紫菀、百部味苦,止咳化痰,共為君藥；桔梗開宣肺氣，白前降氣化痰，共為臣藥；荊芥疏風(fēng)解表,陳皮理氣化痰,共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥,配桔梗又有利咽止咳之功,共為佐使藥。

本研究旨在通過整合藥物代謝動力學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)行多重藥物靶點(diǎn)預(yù)測和分子對接分析，以探究止嗽散治療CVA的作用機(jī)制。

1 方法

1.1 活性成分的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)、中國中藥整合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine integrated database，TCMIP)和文獻(xiàn)檢索收集止嗽散中7味中藥的分子數(shù)據(jù)集。同時(shí)，將口服生物利用度(oral bioavailability,OB)、類藥性(drug likeness,DL)、藥物半衰期(half life,HL)的閾值分別設(shè)置為OB≥30%,DL≥0.2，HL≥4，以同時(shí)滿足這3個(gè)條件的化合物作為止嗽散方中潛在的活性成分。

1.2 靶點(diǎn)的預(yù)測 運(yùn)用TargetNet、Swiss Target Prediction和基于支持向量機(jī)(support vector medicine,SVM)、隨機(jī)森林法(random forest, RF)的SysDT(Systems drug targeting,SysDT)模型預(yù)測靶點(diǎn)。在SysDT方法中，將同時(shí)滿足RF≥0.7和SVM≥0.8的化合物-靶點(diǎn)相互作用視為有效靶點(diǎn)。此外，將化合物的簡化分子線性輸入規(guī)范(simplified molecular input line entry system，SMILES)值輸入Swiss Target Prediction和TargetNet數(shù)據(jù)庫，以補(bǔ)充獲取活性成分的靶基因信息。

1.3 CVA致病候選基因的獲取 結(jié)合GeneCards和OMIM兩大疾病數(shù)據(jù)庫，以“cough variant asthma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取CVA的致病基因。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將活性成分作用靶點(diǎn)與致病候選基因取交集后的靶點(diǎn)導(dǎo)入蛋白互作平臺數(shù)據(jù)庫(String)，以獲取蛋白與蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)關(guān)系，并利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)和“活性成分-靶點(diǎn)-疾病(C-T-D)”網(wǎng)絡(luò)。最后，運(yùn)用“Network Analyzer”功能計(jì)算PPI和C-T-D網(wǎng)絡(luò)的“度(degree)”和“介數(shù)(betweenness)”值。

1.5 生物學(xué)功能富集分析 為了進(jìn)一步探討止嗽散治療CVA的分子作用機(jī)制，將上述獲得的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入到DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(http://david.abcc.ncifcrf.gov),采用京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)進(jìn)行富集分析。

1.6 分子對接 為進(jìn)一步探索止嗽散的活性成分與其靶點(diǎn)的結(jié)合模式，從PPI網(wǎng)絡(luò)獲取的關(guān)鍵靶點(diǎn)中隨機(jī)選擇3個(gè)靶點(diǎn)與其相應(yīng)的關(guān)鍵活性分子進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。這些靶蛋白的X射線晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)(protein data bank,PDB)(http://www.rcsb.org)獲取。然后，采用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對接，得到結(jié)合能，并繪制活性分子和蛋白的結(jié)合模式圖。

2 結(jié)果

2.1 止嗽散活性成分篩選 根據(jù)前面設(shè)置的閾值，盡管部分化合物的OB、DL和HL值很低，但這些化合物如柚皮素、β-谷甾醇等已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其藥理學(xué)活性，故入選有效化學(xué)成分庫，最終篩選出止嗽散的潛在活性成分有97個(gè)，止嗽散的部分活性成分見表1。

表1 止嗽散部分活性成分

2.2 交集靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過多重藥物靶點(diǎn)預(yù)測方法對這97個(gè)化合物進(jìn)行打靶，共獲取2 118個(gè)靶點(diǎn)，與CVA對應(yīng)的1 250個(gè)致病候選基因取交集后，最終獲得共有基因靶點(diǎn)144個(gè)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了探討止嗽散對CVA治療的分子機(jī)制，構(gòu)建PPI和C-T-D網(wǎng)絡(luò)。圖1展示由143個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 884個(gè)邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)。分析該網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，得到靶基因的平均度值為26.35，度值越大，節(jié)點(diǎn)大小越大，對應(yīng)的重要程度越高。取度值前10位的靶基因作為核心靶點(diǎn)(見表2)。

圖1 止嗽散治療CVA的核心基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 止嗽散靶基因中排名前10的潛在靶點(diǎn)

此外，通過分析C-T-D網(wǎng)絡(luò)，得到該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的平均度值為8.73。其中，排名前列的分別是白前苷元C、7,4′-二羥基黃酮、甘草酸、新對葉百部堿、β-谷甾醇等(見表3)。例如，甘草中甘草酸可以通過減輕哮喘小鼠模型的氣道炎癥緩解哮喘癥狀。此外，Chung等發(fā)現(xiàn),百部中新對葉百部堿對豚鼠咳嗽模型的鎮(zhèn)咳作用最強(qiáng)。因此，將這些化合物作為止嗽散治療CVA的關(guān)鍵成分。

表3 止嗽散治療CVA的關(guān)鍵化合物信息

2.4 生物學(xué)功能富集分析 對144個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)功能富集分析，圖2提示止嗽散治療CVA的主要通路是PI3K/Akt信號通路、核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路和缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)信號通路。為了進(jìn)一步闡明止嗽散治療CVA的分子機(jī)制，筆者將止嗽散的潛在靶點(diǎn)映射到這3條關(guān)鍵信號通路(見圖3)上。

圖2 生物學(xué)功能富集分析弦圖

注：“→”表示激活，“┥”表示抑制

2.5 分子對接 從止嗽散有效成分中選取度值和介數(shù)靠前的核心成分，篩選出與CVA相關(guān)的3個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接(見表4)。從表4發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)關(guān)鍵的靶點(diǎn)與其關(guān)鍵的化合物的結(jié)合能均為負(fù)值，表示兩者間具有一定的結(jié)合活性。而當(dāng)結(jié)合能小于-5 kJ/mol時(shí)，兩者具有較強(qiáng)的結(jié)合活性；當(dāng)結(jié)合能小于-7 kJ/mol時(shí)，兩者具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。對接結(jié)果說明止嗽散中關(guān)鍵化合物與核心靶點(diǎn)均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。

表4 關(guān)鍵化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能

選取結(jié)合力排名靠前的化合物β-谷甾醇與其關(guān)鍵靶點(diǎn)EGFR，作出兩者的空腔結(jié)合圖(見圖4)。從圖4可見，位于EGFR蛋白結(jié)合空腔中，分子β-谷甾醇與EGFR周圍的氨基酸殘基SER-720形成一個(gè)氫鍵作用，長度為0.29 nm。正是這些氫鍵形成的作用力使這些化合物牢牢地固定在活性位點(diǎn)處。

圖4 止嗽散關(guān)鍵化合物β-谷甾醇與其關(guān)鍵靶點(diǎn)EGFR的結(jié)合空腔圖

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，止嗽散治療CVA的關(guān)鍵活性成分有桔梗皂苷D、白前苷元C、新對葉百部堿、β-谷甾醇、甘草酸和7,4′-二羥基黃酮等。其中，桔梗皂苷D具有祛痰和抗炎活性。此外，白前中β-谷甾醇可以抑制Th2細(xì)胞因子的升高，防止氣道炎癥，具有治療過敏性哮喘的作用。而甘草中7,4′-二羥基黃酮顯著降低嗜酸性粒細(xì)胞性肺部炎癥患者血清IgE、IL-4、IL-13水平。因此，止嗽散治療CVA的機(jī)制與其活性成分減少氣道炎癥反應(yīng)，降低氣道高反應(yīng)，抑制氣道重塑有關(guān)。

在核心靶點(diǎn)中，甘草酸和7,4′-二羥基黃酮作用于前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)，而PTGS2與哮喘的炎癥反應(yīng)有密切的聯(lián)系。此外，7,4′-二羥基黃酮可作用于基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)。MMP-9屬于蛋白酶超家族，可降解構(gòu)成肺泡壁和基底膜的蛋白成分。研究表明，氣道炎癥部位的MMP-9活性較高，是氣道重塑的重要標(biāo)志物。哮喘患者支氣管上皮中EGFR高表達(dá)，EGFR信號通路的過度激活通常參與氣道黏液過度分泌，并在慢性氣道炎癥中引發(fā)ERK1/2、PI3K、Akt激酶的激活。因此，可以推測7,4′-二羥基黃酮對PTGS2、MMP-9、EGFR的靶向作用可能是止嗽散治療CVA的作用機(jī)制。

生物學(xué)功能富集結(jié)果顯示，止嗽散治療CVA的主要信號通路有PI3K-Akt、NF-κB和HIF-1信號通路等。首先，PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和炎癥遞質(zhì)的形成過程中產(chǎn)生重要的作用。經(jīng)PI3K激活的Akt利用磷酸化作用抑制或激活其下游Caspase9、Bad等靶基因，對細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等起調(diào)控作用。例如，在PI3K/Akt信號通路中， Bad的磷酸化減少Bad與Bcl-2或Bcl-xl的結(jié)合，使Bad的促凋亡作用減輕，而Akt磷酸化可以繼續(xù)磷酸化Caspase 9，使其活性消失，同樣可以減輕促凋亡作用。這些表明活化后的Akt能維持氣道平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡的平衡狀態(tài)。另有文獻(xiàn)報(bào)道，PI3K/Akt通路與哮喘病程有關(guān)聯(lián)，PI3K可影響氣道平滑肌的增殖以及嗜酸性粒細(xì)胞的招募，并影響肺部炎癥和感染的有害反應(yīng)和保護(hù)性反應(yīng)之間的平衡，調(diào)節(jié)粒細(xì)胞的募集、活化、凋亡。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路中基因的表達(dá),可有效減輕哮喘老鼠的氣道重塑，從而達(dá)到治療哮喘的目的。

其次，NF-κB是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。NF-κB在哮喘發(fā)病機(jī)制和急慢性炎癥反應(yīng)機(jī)制中起到重要作用，與樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的生長、分化、炎癥因子的釋放、基因的表達(dá)有關(guān)。例如，在哮喘大鼠肺組織中NF-κB p65、NF-κB p50表達(dá)水平較高，IκBα表達(dá)水平較低，而止嗽散中柚皮素能下調(diào)NF-κB p65、NF-κB p50的表達(dá)水平，上調(diào)IκBα的表達(dá)水平，從而減輕哮喘大鼠的氣道炎癥及細(xì)胞損傷。

此外，HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成，在低氧狀態(tài)下可激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，并且對于細(xì)胞生長發(fā)育和生理應(yīng)激及在某些病理過程中起著重要作用。當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)在過敏性氣道炎癥發(fā)展中HIF-1α存在過表達(dá)。王莉等通過藥物進(jìn)行干預(yù),使HIF-1α表達(dá)水平下調(diào),結(jié)果哮喘小鼠氣道炎癥的癥狀得到明顯緩解。這與本研究結(jié)果一致。所有這些結(jié)果都表明，止嗽散可能通過抑制HIF-1信號通路治療CVA。最后，分子對接結(jié)果顯示，止嗽散中潛在活性成分與其關(guān)鍵靶點(diǎn)的良好結(jié)合力是由其結(jié)合位點(diǎn)處穩(wěn)定的氫鍵導(dǎo)致的，進(jìn)而驗(yàn)證了本研究靶點(diǎn)預(yù)測方法的可靠性。

綜上，本研究通過整合藥物代謝動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重藥物靶點(diǎn)預(yù)測和分子對接分析，對止嗽散治療CVA的分子作用機(jī)制進(jìn)行多途徑、多靶點(diǎn)研究，今后仍需要對止嗽散中關(guān)鍵成分抗CVA的作用進(jìn)行驗(yàn)證。