茅蒼術(shù)組培快繁技術(shù)研究

李亮杰 楚宗麗 李猛 孫曉偉 王鵬博

摘 要：茅蒼術(shù)是重要的道地藥材，但由于繁殖困難和采伐過度，導(dǎo)致野生資源瀕危，產(chǎn)量大幅度下降。為解決這一問題，利用植物組織培養(yǎng)的方法，以茅蒼術(shù)種子為外植體，對初代培養(yǎng)的建立及不定芽誘導(dǎo)、增殖和生根的適宜激素濃度進(jìn)行了篩選，以期為茅蒼術(shù)的組培快繁生產(chǎn)提供技術(shù)支持。結(jié)果表明：初代培養(yǎng)以種子去皮、0.1%升汞消毒10min效果最佳;不定芽誘導(dǎo)以MS+6-BA 3.0mg/L誘導(dǎo)率最高，配合NAA濃度0.4mg/L和0.8mg/L的不定芽誘導(dǎo)率分別為96.77%、95.78%。其次是MS+6-BA 2.0mg/L，添加NAA濃度0.2mg/L和0.4mg/L的誘導(dǎo)率分別為94.53%、95.22%。增殖培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基添加6-BA 3.0mg/L的增殖系數(shù)最高，為11.88;其次是2.0mg/L，增殖系數(shù)在9.5以上;但以MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.4mg/L增殖系數(shù)和長勢綜合效果最好。生根培養(yǎng)以培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA0.5mg/L生根效果最佳。

關(guān)鍵詞：茅蒼術(shù);組織培養(yǎng);不定芽;增殖;快繁

中圖分類號 Q949.783.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2021）21-0033-05

Absrtact： Atractylodes lancea is an important Chinese genuine medicine.However， due to the difficulty of reproduction and over exploitation， wild resources are endangered and the yield is greatly reduced in recent years.To solve this problem， the keys for the rapid propagation of tissue culture for Atractylodes lancea were studied here including the construction for primary culture， adventitious bud induction， proliferation and rooting culture using the mature seeds as material， provides a technical support for rapid propagation of Atractylodes lancea. The results showed that seeds without coat and mature seeds were disinfected with 0.1% HgCl for 10minutes had the best effection.For adventitious buds induction， MS+6-BA 3.0mg/L has the most induction rate， combined with the NAA concentration of 0.4mg/L and 0.8mg/L showed the induction rate of 96.77% and 95.78%， respectively.The second is Ms+6-BA 2.0mg/L， combined with the NAA concentration 0.2 and 0.4 showed the induction rate of 94.53% and 95.22%， respectively.For proliferation， MS+6-BA 3.0mg/L has the most propagation coefficient of 11.88，the second is 2.0mg/L， with the propagation coefficient more than 9.5.But with MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.4mg/L was the best for the comprehensive effect of proliferation coefficient and growth.1/2 MS+NAA0.5mg/L was the best medium for rooting.

Key words： Atractylodes lancea; Tissue culture; Adventitious bud; Proliferation; Rapid propagation

蒼術(shù)（Atractylodes）是菊科蒼術(shù)屬（Atractylodes）多年生植物，我國有朝鮮蒼術(shù)[Atractylodes.coreana （Nakai） Kitam.]、茅蒼術(shù)[Atractylodes lancea （Thunb） DC.]、北蒼術(shù)[Atractylodes chinensis （DC） Koidz.]、關(guān)蒼術(shù)（Atracylodes japonica Koidz.Ex Kitam.）及白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.）5類[1，2]。茅蒼術(shù)即為南蒼術(shù)，《中國植物志》將茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)歸為蒼術(shù)一個(gè)種[2]。茅蒼術(shù)主產(chǎn)于江蘇、安徽、河南等地，為著名的道地藥材[3]。

茅蒼術(shù)根莖入藥，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等作用[4]，主要藥效組分為揮發(fā)油類物質(zhì)[5-7]，南方氣候是茅蒼術(shù)產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)組分的必要條件[8]。目前對蒼術(shù)需求逐年增加，而生長土地減少和人們對野生蒼術(shù)的采挖，導(dǎo)致茅蒼術(shù)產(chǎn)量銳減[9-12]。同時(shí)茅蒼術(shù)生長緩慢，花為雌雄同株或異株，不易受精，種子發(fā)芽率低[13]，依靠有性繁殖遠(yuǎn)不能滿足對茅蒼術(shù)的需求，植物組織培養(yǎng)技術(shù)為茅蒼術(shù)的快速繁殖提供了有效途徑，同時(shí)能夠除去由于多年無性繁殖攜帶的病菌[14，15]。研究發(fā)現(xiàn)，組織培養(yǎng)途徑不影響藥材化學(xué)成分的積累[16，17]。

國內(nèi)學(xué)者對茅蒼術(shù)的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了探索，研究了影響茅蒼術(shù)組培快繁效率因素，如不同滅菌方式和處理時(shí)間對初代培養(yǎng)的影響[18-21]，增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基對茅蒼術(shù)增殖和生根的影響[18-25];研究了不同初代培養(yǎng)材料的培養(yǎng)效果，常用的材料有蒼術(shù)種子[18-20]、根莖側(cè)芽[21]、帶腋芽莖段[22]等;研究了主要的增殖方式，主要通過愈傷誘導(dǎo)和不定芽增殖，愈傷誘導(dǎo)的外植體有葉片、葉柄[23-24]、根、胚軸[19，25]、子葉[19]等。

茅蒼術(shù)在河南信陽有野生分布，并有較大面積的仿野生種植。近年來，隨著市場對茅蒼術(shù)的需求量逐年增加，茅蒼術(shù)的種苗繁殖慢是急需解決的問題。近十幾年來，國內(nèi)學(xué)者雖然針對茅蒼術(shù)組織培養(yǎng)已展開了一定的研究，但真正將組培快繁技術(shù)應(yīng)用到茅蒼術(shù)的組培工廠化生產(chǎn)，仍有很多問題需要進(jìn)一步研究。為此，本研究利用成熟種子為外植體，探究去種皮后的啟動(dòng)培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)和快繁及生根培養(yǎng)等生產(chǎn)程序中適宜的繁殖方式和適宜的培養(yǎng)基，研究不同世代組培苗對植物激素的反應(yīng)，為茅蒼術(shù)種苗的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 2019年和2020年的9—11月，于信陽大別山道地藥材示范園采集成熟種子。

1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基以MS或1/2MS（大量元素減半，其他不變）為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的激素組合（mg/L），添加蔗糖3%，瓊脂0.7%，pH值調(diào)為5.8，設(shè)置不同組合。培養(yǎng)基滅菌壓力0.1MPa，溫度121℃，滅菌時(shí)間25min。

1.2.1 初代培養(yǎng)基 2種配方，M1：MS基本培養(yǎng)基;M2：MS+6-BA1.0+NAA0.5+GA1.0（單位mg/L，下同）。

1.2.2 叢生芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基; 6種濃度組合，配方如下：

Z1a：MS+6-BA1.0+NAA0.1， Z1b：MS+6-BA1.0+NAA0.2;

Z2a：MS+6-BA2.0+NAA0.2， Z2b：MS+6-BA2.0+NAA0.4;

Z3a：MS+6-BA3.0+NAA0.4， Z3b：MS+6-BA3.0+NAA0.8。

1.2.3 生根培養(yǎng)基 3個(gè)激素濃度，配方如下：

1/2MS+NAA0.2;1/2MS+NAA0.5;1/2MS+NAA1.5

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 外植體處理 選健壯的種子加洗潔精清洗干凈，流水沖洗30min，無菌水浸泡3～6h，超凈工作臺(tái)上75%酒精浸泡30s，0.1%升汞消毒6～15min，無菌水沖洗3～5次。滅菌后種子分為剝?nèi)シN皮（去皮并切去部分子葉，胚根接種）和保留種皮2種方式接種。

1.3.2 初代培養(yǎng) 消毒后的種子接種在初代培養(yǎng)基，每瓶接種2～3粒，針對不同種皮處理方式、不同滅菌時(shí)間，每處理接種20～30瓶，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。置（23±1）℃條件下，5～10d統(tǒng)計(jì)污染情況，20d統(tǒng)計(jì)出苗情況。

1.3.3 誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)得到的無菌苗，切去根和葉片，胚軸保留葉腋生長點(diǎn)，轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種3塊組織，每處理接種24瓶。35d統(tǒng)計(jì)出苗的組織塊數(shù)。將上述叢生芽分離，接種到6種不同激素濃度的增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種3個(gè)芽，每處理接種15瓶，35d后統(tǒng)計(jì)增殖芽數(shù)。

1.3.4 生根培養(yǎng) 將增殖所得的不定芽，3～4個(gè)葉后接種到生根培養(yǎng)基，每瓶接種2～4苗，30d統(tǒng)計(jì)生根率。以上處理分別3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)方法 相關(guān)計(jì)算公式如下：

污染率（%）=污染種子數(shù)/接種種子數(shù)×100;

發(fā)芽率（%）=發(fā)芽種子數(shù)/接種種子數(shù)×100;

誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出不定芽的芽數(shù)/接種芽數(shù)×100;

增殖系數(shù)（%）=增殖后不定芽個(gè)數(shù)/接種芽數(shù)×100

利用Excel 2010和SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多重比較采用Duncan′s法。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)的建立

2.1.1 培養(yǎng)基和種皮處理方式對種子萌發(fā)和生長的影響 接種后的種子培養(yǎng)20d統(tǒng)計(jì)出苗率，未剝種皮處理在M1、M22種培養(yǎng)基上出苗率為分別為34.68%、39.19%，剝皮處理后出苗率分別為64.75%、79.79%，相同培養(yǎng)基不同處理方式之間差異達(dá)極顯著，對于相同處理不同培養(yǎng)基之間，剝皮處理出苗率差異顯著，未剝皮處理差異不顯著（見表1）。

未剝種皮和剝皮幼苗長勢不同，剝皮的種子發(fā)芽后幼苗葉片淡綠，莖伸長，有1～2條初生根長成正常植株。未剝皮幼苗莖伸長發(fā)芽速率慢（圖1）。在初代培養(yǎng)中，兩類培養(yǎng)基幼苗長勢不同，不添加6-BA的培養(yǎng)基M1中，幼苗伸長（圖2A），添加有細(xì)胞分裂素6-BA的培養(yǎng)基M2中，根和伸長生長不明顯，初代苗有增殖現(xiàn)象（圖2B、C）。

2.1.2 滅菌時(shí)間對初代培養(yǎng)影響 5個(gè)滅菌時(shí)間，隨著消毒時(shí)間的延長污染率逐漸降低（表2），6min、8min、10min3個(gè)時(shí)間污染率差異顯著，10min以后，隨滅菌時(shí)間的延長污染率降低差異不顯著。隨著消毒時(shí)間的延長出苗率升高，6min、8min、10min3個(gè)時(shí)間出苗率差異顯著，但消毒10min以后隨著消毒時(shí)間延長成苗率范圍降低，綜合污染率和成苗率，表明10min消毒效果最好。

2.2 不同激素濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響 胚軸誘導(dǎo)培養(yǎng)3d，葉腋處嫩葉長出;7d傷口變大，有顆粒狀凸起出現(xiàn);15d外植體傷口可見愈傷組織，葉腋處出現(xiàn)叢生嫩芽;28d底部傷口長成堅(jiān)硬、形狀不規(guī)則的愈傷組織，葉片展開，生成叢生芽（圖3 D、E、F）。不同激素濃度的培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)率不同，在6-BA3.0、NAA0.4（mg/L）的Z3a號培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)率最高，為96.77%，其次是6-BA 3.0，NAA 0.8（mg/L）的Z3b號培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為95.78%，兩者差異不顯著，與含6-BA 1.0（mg/L）的Z1a、Z1b培養(yǎng)基誘導(dǎo)率差異顯著，與含6-BA 2.0的Z2a、Z2b號培養(yǎng)基差異不顯著（表3），表明含6-BA 3.0，NAA 0.4（mg/L）時(shí)培養(yǎng)基誘導(dǎo)能力最強(qiáng)。

2.3 不同激素濃度對不定芽增殖的影響 將誘導(dǎo)出不定芽切成單芽接種在增殖培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)增殖芽數(shù)并計(jì)算增殖系數(shù)，結(jié)果表明，培養(yǎng)基中6-BA為3.0（mg/L）時(shí)增殖系數(shù)最高，為11.88，為2.0（mg/L）時(shí)增殖系數(shù)在9.5以上，為1.0時(shí)增殖系數(shù)為5.0，差異顯著（表4）。不同激素濃度對苗的長勢有影響，6-BA為3.0mg/L時(shí)葉片不易伸長（圖3A、B），6-BA為2.0時(shí)，低濃度NAA（0.2mg/L）不定芽伸長不明顯（C：Z2a、F），NAA為0.4mg/L時(shí)，苗伸長，出現(xiàn)莖稈和節(jié)間（D：Z2b、G）。6-BA為1.0（mg/L）、NAA為0.1（mg/L）時(shí)葉片伸展（E、H）。表明適宜的細(xì)胞分裂素濃度需對應(yīng)的生長素濃度才能利于苗的健壯生長。綜合增殖系數(shù)和苗長勢，培養(yǎng)基中6-BA為2.0、NAA為0.4（mg/L）時(shí)適合初代苗的增殖。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著增殖世代的增加，組培苗對細(xì)胞分裂素反應(yīng)敏感，增殖能力強(qiáng)，苗嫩，呈黃綠色（圖4A），后面世代培養(yǎng)中，培養(yǎng)基不添加細(xì)胞分裂素可實(shí)現(xiàn)壯苗（圖4B）。

2.4 生長素濃度對不定芽生根的影響 由表5和圖5可知，3種生根培養(yǎng)基中，以NAA濃度0.5mg/L的生根率最高，為97.78%，生長速度最快，根長勢最好，3種培養(yǎng)基對生根率的影響差異不顯著，且生根率都在90%以上。表明3種培養(yǎng)基都可以進(jìn)行生根培養(yǎng)，其中以配方1/2MS+NAA0.5mg/L效果最好。

3 討論與結(jié)論

3.1 初代培養(yǎng)的建立 外植體表面滅菌是建立無菌培養(yǎng)的第一步，不同外植體滅菌難易程度不同，根據(jù)外植體的來源和老嫩程度的不同，利用升汞進(jìn)行表面滅菌的時(shí)間一般在5～10min，時(shí)間越長滅菌越徹底，但對外植體損傷越大。在茅蒼術(shù)的不同的外植體研究中，李西騰等利用根莖側(cè)芽、李鴻盛等利用在光照培養(yǎng)箱種植塊根獲得的帶腋芽莖段，利用次氯酸鈉和升汞溶液結(jié)的方式進(jìn)行消毒處理[21，22]建立無菌培養(yǎng)。而蒼術(shù)種皮有絨毛，藥液不易進(jìn)入，成熟種子由于生長時(shí)間長，滅菌困難，巢建國等[19]采用的0.1%升汞消毒種子15min。本試驗(yàn)在成熟種子完成預(yù)處理后，去掉種皮后再消毒，0.1%升汞消毒10min達(dá)到理想的消毒效果。以種子為外植體的快繁中，種子萌發(fā)是快繁的基礎(chǔ)，路成[26]等研究美女櫻種子的組培表明，蒸餾水浸泡種子，并且切除兩端0.01cm處以破壞種皮才可誘導(dǎo)成苗，不破壞種皮不可生苗。本試驗(yàn)對種子進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，將種皮剝?nèi)ィ瑩p傷部分子葉有利于茅蒼術(shù)種子萌發(fā)。

3.2 植株再生 組織培養(yǎng)中主要通過器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生2種途徑獲得再生植株，器官發(fā)生途徑分為直接器官發(fā)生途徑（外植體不需要脫分化形成愈傷組織而直接成苗）和間接器官發(fā)生途徑（外植體經(jīng)脫分化形成愈傷再分化形成苗）[27]，茅蒼術(shù)主要是通過器官發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)再生。巢建國等利用無菌苗分割成的胚根、胚軸、子葉和真葉多種材料直接誘導(dǎo)叢生芽，以胚軸誘導(dǎo)率最高[19]，宋剛等[25]在茅蒼術(shù)規(guī)?；M培快繁研究中利用胚軸直接增殖再生。劉海萍等[23]、宋剛等[24]利用無菌苗的葉片、葉柄在添加2，4-D的培養(yǎng)基，通過誘導(dǎo)愈傷組織實(shí)現(xiàn)間接再生。本研究利用胚軸直接實(shí)現(xiàn)不定芽再生，雖然試驗(yàn)過程中也有愈傷組織產(chǎn)生，但未進(jìn)行愈傷組織再分化，簡化了再生程序，便于在生產(chǎn)中應(yīng)用。

3.3 增殖培養(yǎng) 在增殖培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素濃度是影響增殖系數(shù)的關(guān)鍵，生長素影響種苗的生長和質(zhì)量，劉海萍等[23]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA在2.0～3.0mg/L、IBA為0.4mg/L時(shí)，芽的增殖率較高，苗長勢好;當(dāng)6-BA濃度大于3.0mg/L時(shí)，茅蒼術(shù)的生長受到抑制;李西騰等[21]研究發(fā)現(xiàn)，MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L葉片叢芽誘導(dǎo)最高，但在繼代的前期（2～3代）所用激素的濃度相對高些，6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L較好，隨著繼代代數(shù)的增加，要求激素的濃度降低，到8～10代時(shí)，6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L較好，認(rèn)為可能是激素積累的原因。宋剛等[24]發(fā)現(xiàn)，6-BA10.mg/L+NAA0.15mg/L叢生芽增殖系數(shù)最高為15，但該報(bào)道未提供計(jì)算該增殖系數(shù)的基本苗數(shù)。本研究結(jié)果表明，6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L中增殖系數(shù)為7.4，雖不及6-BA 3.0mg/L高，但芽苗生長健壯，在后續(xù)繼代增殖培養(yǎng)中，增殖芽數(shù)較高，但苗弱小，認(rèn)為該濃度不宜長期在增殖培養(yǎng)中使用，與李西騰等[21]研究結(jié)果叢生芽增殖前期需要高濃度激素，但長期使用會(huì)對叢芽誘導(dǎo)產(chǎn)生影響的結(jié)果一致。筆者認(rèn)為，在工廠化生產(chǎn)中，可以降低細(xì)胞分裂素濃度，采用6-BA濃度為1.0～1.5mg/L范圍內(nèi)進(jìn)行快繁，以降低高濃度細(xì)胞分裂素對苗的影響，提高種苗質(zhì)量。

關(guān)于生長素的濃度對苗生長的影響，劉海萍等[23]等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IBA質(zhì)量濃度小于0.4mg/L時(shí)，芽苗顏色淺，比較纖弱;當(dāng)IBA質(zhì)量濃度大于0.4mg/L時(shí)，芽的分化率低。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA為2.0時(shí)，NAA為0.2mg/L不定芽伸長不明顯（C：Z2a），為0.4mg/L時(shí)苗伸長，出現(xiàn)莖稈（D：Z2b）。6-BA為1.0mg/L時(shí)，NAA濃度為0.1mg/L葉片伸展，株型正常，表明適宜的細(xì)胞分裂素濃度需對應(yīng)的生長素濃度才能利于苗的健壯生長。而6-BA為3.0mg/L，NAA為1.0mg/L比為0.6mg/L增殖率低，可能與生長素具有兩重性、低濃度促進(jìn)植物生長，過高濃度時(shí)抑制植物生長有關(guān)[28，29]。

本研究以剝皮種子為外植體進(jìn)行培養(yǎng)有利于出苗和降低污染，初代培養(yǎng)增殖培養(yǎng)基以6-BA2.0+NAA0.4增殖效果理想。在后續(xù)增殖培養(yǎng)中，降低細(xì)胞分裂素濃度，有利于壯苗，生根培養(yǎng)基以配方為1/2MS+NAA0.5mg/L最適宜。

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（責(zé)編：張宏民）