唐志敏, 李 彥, 王 璐
(東華大學(xué) a.紡織學(xué)院,b.紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201620)
細(xì)菌侵入破損皮膚繼而引發(fā)傷口感染的概率極高。由細(xì)菌引起的慢性感染傷口的微環(huán)境較為復(fù)雜,在持續(xù)炎性刺激下,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在傷口床分泌大量炎性細(xì)胞因子,促進(jìn)金屬蛋白酶生成,這將加劇感染并阻礙愈合進(jìn)程,因此用適宜的局部抗菌敷料降低傷口處的感染是十分必要的[1]。
相比傳統(tǒng)敷料,靜電紡絲膜具有較大的比表面積、連通的孔結(jié)構(gòu)以及可調(diào)的孔隙率,既有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和氧氣的滲透,又可加載藥物為抑制傷口感染提供可能,是一種極富前景的功能性敷料[2-4],尤其在抗菌方面?zhèn)涫荜P(guān)注[5]。Alavarse等[6]將鹽酸四環(huán)素負(fù)載于聚乙烯醇(PVA)/殼聚糖納米纖維中,可有效抵御金黃色葡萄球菌。Mutlu等[7]將具有抑炎和抗菌作用的姜黃素負(fù)載于聚羥基丁酸戊酯納米纖維中,這對(duì)抵御傷口感染產(chǎn)生了積極效應(yīng)。然而,納米纖維基敷料僅能應(yīng)對(duì)由常規(guī)細(xì)菌引發(fā)的感染問題,而對(duì)頑固耐藥菌束手無策。尤其是近年來,抗生素等藥物的無規(guī)濫用,致使耐藥性細(xì)菌大量涌現(xiàn)。因此,開發(fā)可應(yīng)對(duì)耐藥菌感染的敷料已成為醫(yī)用紡織領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一。
抗菌肽對(duì)細(xì)菌具有廣譜高效殺菌活性,且不易產(chǎn)生耐藥性,成為抗生素替代品的“希望之星”[8-10]。與抗生素不同,抗菌肽與細(xì)菌表面的脂多糖、磷脂等帶負(fù)電荷的分子之間發(fā)生靜電吸引[11],通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)外電勢(shì)差從而破壞細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)[12]。此外,小分子抗菌肽可快速進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞,干擾胞內(nèi)生理生化反應(yīng),引起胞內(nèi)的物質(zhì)、能量和信息傳遞中斷,致使細(xì)菌死亡[13]。鑒于裸露的抗菌肽活性易被傷口微環(huán)境破壞,研究者們通過共混紡絲、吸附、層層自組裝等方式將抗菌肽結(jié)合到納米纖維上得以實(shí)現(xiàn)抗菌肽的局部遞送。比如:Song等[14]通過硫醇-馬來酰亞胺偶聯(lián)法將抗菌肽LL-37固定在絲素纖維膜上,結(jié)果表明,LL-37對(duì)金黃色葡萄球菌等細(xì)菌有良好的抗菌活性,且能抑制細(xì)菌生物膜的生成;Su等[15]采用同軸靜電紡將抗菌肽17BIPHE2包封在核層,該膜在慢性傷口模型測(cè)試中降低了5個(gè)數(shù)量級(jí)的生物膜濃度,且無明顯細(xì)胞毒性??紤]到生物膜中的細(xì)菌群體具有極強(qiáng)的耐藥性[16],故推測(cè)以抗菌肽為抗菌劑應(yīng)對(duì)傷口耐藥菌感染具有一定的可行性。
選取具有高安全性的廣譜抗菌肽——聚賴氨酸(ε-polylysine,ε-PL)作為抗菌劑,并以PVA和海藻酸鈉(sodium alginate,SA)混紡納米纖維膜為載體,這是因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)PVA/SA纖維載體具有極佳的生物相容性。舒泉水等[17]將PVA、SA和甲基丙烯酸縮水甘油酯進(jìn)行混紡,隨后通過120 ℃熱處理獲得高吸液敷料,但高溫處理會(huì)使多數(shù)藥物失活。李沉紋等[18]預(yù)先在PVA/SA纖維膜中負(fù)載鹽酸莫西沙星,隨后通過氯化鈣處理達(dá)到緩釋藥物的目的。但上述處理步驟較為復(fù)雜,且抗菌劑易在處理中溶出,因此如何更好地發(fā)揮載體的作用尚待進(jìn)一步研究??紤]到SA是線性呈嵌段排列的天然陰離子多糖[19],可紡性較差,故對(duì)PVA/SA混紡纖維膜的結(jié)構(gòu)調(diào)控規(guī)律進(jìn)行探究,采用ε-PL溶液對(duì)PVA/SA混紡膜進(jìn)行涂覆改性,并對(duì)抗菌肽處理后的混紡膜的抗菌性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于ε-PL可與混紡膜中的SA形成靜電吸附等作用,可在實(shí)現(xiàn)有效負(fù)載的同時(shí)降低混紡膜的水溶性;另外,纖維主體中的ε-PL能夠利用混紡膜中PVA的水溶性從纖維膜中溶出從而發(fā)揮抗菌作用;再者,存在于交聯(lián)結(jié)構(gòu)中的ε-PL可產(chǎn)生緩釋效應(yīng),有望獲得緩釋型抗耐藥菌的納米纖維基敷料。
聚乙烯醇(PVA 1788,聚合度1 700,醇解度88%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);海藻酸鈉(SA,純度≥90%,生工生物工程(上海)股份有限公司);ε-聚賴氨酸(ε-PL,AR,上海闊泉生物科技有限公司)。耐藥性金黃色葡萄球菌(ATCC 29213型,上海保藏生物技術(shù)中心);耐藥性銅綠假單胞菌(ATCC 15692型,中國(guó)微生物菌種保藏中心)。
靜電紡絲機(jī)(ET-2535 H型,北京永康樂科技發(fā)展有限公司);電子天平(FA2204C型,上海賽德利思精密儀器儀表有限公司);恒溫磁力攪拌器(524 G型,上海梅穎儀器儀表制造有限公司);掃描電子顯微鏡(DXS-10ACKT型);電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9145A型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);多功能強(qiáng)力儀(YG(B)026G-500型);臺(tái)式乳膠測(cè)厚儀(CH-12.7-BTSX型,上海添時(shí)科學(xué)儀器有限公司);傅里葉變換紅外光譜儀(Spectrum Two型,珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司)。
1.2.1 紡絲原液的配備
稱取不同質(zhì)量的PVA和SA溶解于去離子水(溶劑)中,并在90 ℃油浴鍋中恒溫持續(xù)加熱攪拌6 h,待混合物完全溶解并混合均勻后,置于磁力攪拌器上攪拌備用。PVA/SA混合溶液中各成分含量如表1所示。
表1 PVA/SA混合溶液中各成分的含量Table 1 Content of each component in the PVA/SA mixed solution
1.2.2 混紡膜的制備
將配制好的紡絲原液注入10 mL的注射器中進(jìn)行靜電紡絲,用鋁箔紙接收納米纖維。紡絲參數(shù):紡絲速率0.48 mL/h、紡絲電壓30 kV、接收距離15 cm、溫度35 ℃、相對(duì)濕度50%~65%、針頭型號(hào)21 G。紡絲結(jié)束后,取下接收板上的鋁箔紙,在電熱鼓風(fēng)干燥箱中于60 ℃烘干,保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.1 表面形貌
將混紡膜裁剪成適當(dāng)大小,并用導(dǎo)電膠將其粘貼到電鏡臺(tái)上,低溫多次噴金后用掃描電子顯微鏡觀察纖維形貌。使用圖像分析軟件ImageJ采集100根不同纖維并測(cè)量纖維直徑,用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以獲得纖維平均直徑及其分布。
1.3.2 力學(xué)性能
將混紡膜裁剪成20 mm×3 mm的條狀,在室溫下,用多功能強(qiáng)力儀測(cè)量各混紡膜的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率。薄膜的初始長(zhǎng)度為10 mm,拉伸速度為10 mm/min,預(yù)加張力為0.1 N,每個(gè)試樣測(cè)量5次;采用臺(tái)式乳膠測(cè)厚儀測(cè)量混紡膜的厚度,測(cè)量10次求取平均值,計(jì)算薄膜的應(yīng)力與應(yīng)變并繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線。
1.3.3 涂覆率與溶解性能
將混紡膜P9S1和P8S2裁剪成3 cm×3 cm的片狀,在ε-PL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的無水乙醇溶液中浸泡3 h,使混紡膜與ε-PL產(chǎn)生交聯(lián),分別得到ε-PL@P9S1和ε-PL@P8S2纖維膜。稱量涂覆處理前后混紡膜的干燥質(zhì)量,計(jì)算混紡膜上ε-PL的涂覆率Rcl。
(1)
式中:m0、m1分別為ε-PL處理前、后PVA/SA混紡膜的干燥質(zhì)量,g。
將混紡膜P9S1、P8S2、ε-PL@P9S1、ε-PL@P8S2浸泡于磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中,使其完全溶解,考察涂覆改性后混紡纖維膜的溶解性。
1.3.4 化學(xué)結(jié)構(gòu)
采用紅外光譜儀對(duì)混紡纖維膜P9S1及ε-PL@P9S1表面的化學(xué)鍵類別與分布進(jìn)行測(cè)試分析,掃描范圍為4 000~400 cm-1,以檢驗(yàn)混紡膜P9S1是否成功涂覆了ε-PL。
1.3.5 抗菌活性
參照GB/T 20944.1—2007《紡織品抗菌性能的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(瓊脂平皿擴(kuò)散法)》定性測(cè)試表征纖維膜表面的抗菌活性。配制牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,并在上面涂布耐藥性金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus,S.A.)和耐藥性銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa,P.A.),然后將纖維膜裁剪成直徑為14 mm的小圓片,置于涂布菌液的培養(yǎng)基中,在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d,測(cè)量抑菌帶寬度H。H=(D-d)/2,D為抑菌帶外徑的平均值,d為試樣直徑,mm。當(dāng)H>0且試樣上細(xì)菌無繁殖時(shí),表示抗菌效果好;當(dāng)H=0時(shí),試樣上細(xì)菌輕微繁殖表示抗菌效果較好,試樣上細(xì)菌中等繁殖表示抗菌效果有限,試樣上細(xì)菌大量繁殖表示無抗菌效果。
參照GB/T 20944.3—2008《紡織品抗菌性能的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(振蕩法)》定量測(cè)試表征納米纖維膜表面的抗菌活性。將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋到3×105~4×105CFU/mL,然后取5 mL菌液與5 mm×5 mm的試樣在(24±1) ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)完成后,將共培養(yǎng)液體稀釋一定倍數(shù)并取(1.0±0.1) mL涂布于裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi),將此培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。上述過程記為完成第1次振蕩培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。將第1次振蕩培養(yǎng)后的試樣用去離子水充分沖洗并晾干后,重復(fù)上述操作步驟進(jìn)行第2次振蕩培養(yǎng)和計(jì)數(shù),同理進(jìn)行第3次振蕩培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。若最小稀釋倍數(shù)平板中的菌落數(shù)<30 CFU/mL,則按實(shí)際數(shù)量記錄;若無菌落生長(zhǎng),則菌落數(shù)記為“<1”。計(jì)算活菌濃度K(CFU/mL),K=Z×R,Z為平板菌落平均值(CFU/mL)、R為稀釋倍數(shù)。根據(jù)試樣和菌液振蕩接觸18 h后的活菌濃度Qt與陽性對(duì)照樣的活菌濃度Wt計(jì)算抑菌率Y,Y=(Wt-Qt)/Wt×100%。由抗菌性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可知,抑菌率≥70%且驗(yàn)證有效(F≥1.5)時(shí)材料具有抗菌效果。
PVA/SA混紡膜及其載藥膜的SEM圖和纖維直徑分布如圖1所示。由圖1可以看出,當(dāng)PVA與SA的質(zhì)量比為9∶1和8∶2時(shí),纖維粗細(xì)均勻、連續(xù)完整,呈無規(guī)律交叉分布,纖維平均直徑由180 nm增加到388 nm;當(dāng)PVA與SA的質(zhì)量比為7∶3和6∶4時(shí),纖維平均直徑分別為120、68 nm,出現(xiàn)了串珠結(jié)構(gòu),且隨著SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,串珠結(jié)構(gòu)明顯增多。該現(xiàn)象主要?dú)w因于SA分子間和分子內(nèi)的氫鍵作用,該作用使得紡絲液的成纖性能降低。用ε-PL涂覆處理混紡膜P9S1后,納米纖維膜中的三維堆積結(jié)構(gòu)仍然存在,只是纖維直徑有所增加,測(cè)得平均直徑為315 nm,同時(shí)還可觀察到纖維與纖維的交疊處發(fā)生了粘連。而采用ε-PL涂覆處理混紡膜P8S2后,因ε-PL與SA發(fā)生反應(yīng),隨著SA質(zhì)量占比的增大,纖維直徑進(jìn)一步增大,纖維膜中的三維堆積結(jié)構(gòu)遭到破壞,纖維間的粘連程度大幅提高,已難以測(cè)算纖維平均直徑及分布。
圖1 PVA與SA混紡膜及其載藥膜的SEM圖和纖維直徑分布Fig.1 SEM images and fiber diameter distribution of the PVA/SA and its drug-loaded blended membranes
作為敷料使用時(shí),纖維膜還需具備一定的力學(xué)性能,對(duì)不同配比條件下纖維膜的力學(xué)性能進(jìn)行研究?;旒從9S1、P8S2、P7S3、P6S4、ε-PL@P9S1、ε-PL@P8S2的應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖2所示。由圖2可知,隨著SA質(zhì)量占比的增加,混紡纖維膜的力學(xué)性能呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)椋琍VA是一種半結(jié)晶親水性聚合物,分子鏈段中富含—OH,SA是一種剛性天然聚合物[20],因SA大分子鏈中有大量環(huán)狀結(jié)構(gòu),當(dāng)兩者共混紡絲時(shí),SA環(huán)上的—OH、—COOH和PVA鏈段中的—OH會(huì)形成分子內(nèi)和分子間氫鍵,增加了聚合物鏈段的牽伸阻力。與此同時(shí),SA作為一種具有高導(dǎo)電率的聚電解質(zhì),其自身陰離子鏈之間的相互排斥力使得混紡溶液的可紡性降低,在電場(chǎng)牽伸力不變的條件下,成纖率和紡絲均勻性都會(huì)降低,多以疵點(diǎn)“串珠”結(jié)構(gòu)存在,因而纖維的伸長(zhǎng)率急劇下降。綜合比對(duì)不同混紡膜的力學(xué)性能后,摒棄斷裂伸長(zhǎng)率較小的P7S3和P6S4兩種混紡纖維。將力學(xué)性能最好的混紡膜P9S1和P8S2用陽離子多肽藥物ε-PL處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均展現(xiàn)出較未負(fù)載ε-PL時(shí)的纖維原膜更好的力學(xué)性能。這是因?yàn)棣?PL與陰離子多糖發(fā)生交聯(lián),增大了分子間作用力,從而增加了原膜強(qiáng)力。混紡膜及其載藥膜的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率如表2所示。
圖2 混紡膜和載藥膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.2 Stress-strain curves of blended membranes and drug-loaded membranes
表2 混紡膜及載藥膜的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率Table 2 Strength and elongation of blended membranes and drug-loaded membranes
因PVA和SA均不溶于無水乙醇,故混紡膜可在ε-PL與無水乙醇的混合溶液中穩(wěn)定存在。ε-PL進(jìn)入混紡膜內(nèi)部與SA組分發(fā)生物理交聯(lián)而充分吸附。交聯(lián)完成后測(cè)量ε-PL處理后的混紡膜的干燥質(zhì)量,結(jié)果如表3所示。混紡膜P9S1、P8S2經(jīng)ε-PL與無水乙醇的混合溶液浸泡后,計(jì)算得到纖維膜的涂覆率分別為83.35%、75.28%。
表3 PVA/SA混紡膜和載藥膜的干燥質(zhì)量與涂覆率Table 3 Dry weight and coating rate of PVA/SA blended membranes and drug-loaded membranes
因PVA與SA均為易溶于水的高分子聚合物,故其混紡膜的耐水性較差。經(jīng)ε-PL涂覆處理后,因PVA/SA混紡膜中的組分SA與ε-PL發(fā)生交聯(lián)從而提高混紡膜的耐水溶性。為驗(yàn)證ε-PL與SA發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng),對(duì)處理前后混紡纖維膜耐水溶性的變化規(guī)律進(jìn)行探究,對(duì)應(yīng)樣品在磷酸鹽緩沖液(pH為7.4)中的溶解時(shí)間如圖3所示。由圖3可知,P9S1、P8S2的溶解時(shí)間分別為0.3和0.4 h,經(jīng)ε-PL涂覆處理后載藥膜ε-PL@P9S1、ε-PL@P8S2的溶解時(shí)間分別為120和144 h。由此可見,ε-PL被成功負(fù)載于PVA/SA混紡膜,且ε-PL與SA的相互作用大幅提高了纖維膜的耐水溶性,為ε-PL的長(zhǎng)效釋放提供了可能。考慮到P9S1的ε-PL涂覆率較高且力學(xué)性能更優(yōu),后續(xù)試驗(yàn)中采用ε-PL@P9S1樣品進(jìn)行抗菌性能評(píng)估。
圖3 PVA/SA混紡膜及ε-PL處理后膜的水溶解時(shí)間Fig.3 Dissolution time of PVA/SA blended membranes and ε-PL treated membranes
通過對(duì)P9S1和ε-PL@P9S1進(jìn)行紅外光譜分析進(jìn)一步驗(yàn)證ε-PL是否被成功涂覆于纖維膜,測(cè)試結(jié)果如圖4所示。
圖4 混紡膜P9S1和載藥膜ε-PL@P9S1的FTIR光譜Fig.4 FTIR spectra of blended membranes P9S1 and its drug-loaded membranes ε-PL@P9S1
為定性評(píng)價(jià)ε-PL@P9S1的抗耐藥菌性能,分別對(duì)比了P9S1混紡膜在涂覆ε-PL前后對(duì)耐藥菌S.A.和P.A.的抑制作用,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,P9S1混紡膜上無法觀察到抑菌圈,而ε-PL@P9S1載藥膜對(duì)細(xì)菌S.A.和P.A.形成的抑菌帶寬度分別為1.5和2.0 mm。由此可見,ε-PL@P9S1載藥膜對(duì)革蘭氏陰性菌P.A.的抑菌效果比革蘭氏陽性菌S.A.好,初步推斷這可能與兩種細(xì)菌的外膜結(jié)構(gòu)差異及ε-PL的抑菌機(jī)理有關(guān)。纖維膜中釋放的ε-PL主要通過靜電吸附作用影響細(xì)菌的生理功能,進(jìn)而發(fā)揮抑菌作用;此外,P.A.外膜的電負(fù)性比S.A.更強(qiáng)[21],因此前者可與ε-PL產(chǎn)生更強(qiáng)的相互作用。
注:分圖中左、右側(cè)分別為混紡膜P9S1與載藥膜ε-PL@P9S1對(duì)細(xì)菌的抑菌圈。圖5 混紡膜P9S1與載藥膜ε-PL@P9S1分別對(duì)細(xì)菌S.A.和P.A.的抗菌效果Fig.5 Antibacterial effect of blended membrane P9S1 and drug-loaded membrane ε-PL@P9S1 on S.A. and P.A.
載藥膜ε-PL@P9S1的定量抗菌評(píng)價(jià)結(jié)果如圖6所示。
注:(a)~(d)或(e)~(h)依次為載藥膜與S.A.或P.A.共培養(yǎng)的空白樣及振蕩培養(yǎng)1、2、3次試樣的菌落。圖6 載藥膜ε-PL@P9S1對(duì)細(xì)菌S.A.和P.A.的抗菌效果Fig.6 Antibacterial effect of drug-loaded membrane ε-PL@P9S1 on bacteria S.A. and P.A.
由圖6可以看出,相比空白對(duì)照樣,與兩種細(xì)菌S.A.和P.A.振蕩培養(yǎng)18 h的載藥膜均具有明顯的抑菌效果。第1、2、3次與S.A.振蕩培養(yǎng)18 h的載藥膜的抑菌率分別為82.20%、99.48%、96.86%;第1、2、3次與P.A.振蕩培養(yǎng)18 h的載藥膜的抑菌率分別為88.97%、97.93%、94.48%。隨著抑菌率先增加后稍降低,藥物釋放速率先增加后減緩,但抑菌率均大于70%,表明抗菌效果顯著。這可能是由于在固定溫度和振蕩速率的條件下,經(jīng)過一段時(shí)間的振蕩接觸,纖維膜中的藥物ε-PL緩慢釋放,從而有效發(fā)揮其抗菌作用。與瓊脂平皿擴(kuò)散法所得結(jié)果一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了ε-PL抑菌作用的發(fā)揮是通過與細(xì)菌膜表面發(fā)生靜電吸附產(chǎn)生的,故該電紡膜抗菌效果較為優(yōu)異。
(1)PVA與SA共混后通過靜電紡絲成功制得纖維形貌優(yōu)良的復(fù)合納米纖維,隨著SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,纖維出現(xiàn)串珠結(jié)構(gòu)且力學(xué)性能下降。
(2)通過對(duì)PVA/SA進(jìn)行ε-PL涂覆處理,提高了混紡纖維膜的耐水溶性,水溶時(shí)間延長(zhǎng)至144 h。
(3)PVA/SA混紡膜的紅外光譜顯示,PVA、SA、ε-PL的特征吸收峰在紅外光譜圖中均有體現(xiàn),說明纖維膜中同時(shí)存在PVA及SA兩種組分,表明涂覆過程可實(shí)現(xiàn)ε-PL的成功加載。
(4)由ε-PL@P9S1載藥膜的抗菌試驗(yàn)可知,制備的納米纖維基敷料對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均可產(chǎn)生較好的抗菌效果。