范明娟 聶玉強(qiáng) 詹琪 李潔

廣州市第一人民醫(yī)院老年病科（廣州 510180）

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是世界范圍內(nèi)最常見的慢性肝病，與血脂異常密切相關(guān)［1-2］。然而目前仍缺乏有效的NAFLD 防治策略。鋅alpha2糖蛋白（ZAG）是一種新型脂肪細(xì)胞因子，參與脂質(zhì)分解、脂肪酸氧化等過程［3］。ZAG 通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)顯著改善NAFLD 小鼠肝臟脂肪變及炎癥反應(yīng)［4］。利拉魯肽是臨床糖尿病合并肥胖患者治療常用藥［5］。利拉魯肽通過抑制細(xì)胞凋亡對棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞HepG2 損傷具有保護(hù)作用［6］。本研究以棕櫚酸誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞（HepG2）建立肝脂毒性損傷模型，初步探討利拉魯肽聯(lián)合ZAG 對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝和炎癥因子表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源選擇2017 年2 月至2018 年6 月于我院就診的40 例NALFD 患者肝組織（穿刺活檢標(biāo)本）。其中男31 例，女9 例，平均年齡（45.7 ±8.3）歲。選擇年齡、性別相匹配的無肝臟疾病的40 例志愿者肝組織作為正常對照。NALFD 患者符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010 年修訂版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)，且排除可導(dǎo)致脂肪肝的其他特定疾病和2 周內(nèi)服用過利尿劑、皮質(zhì)激素等影響糖代謝、脂代謝以及服用過保肝藥物患者。本研究的開展獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料人肝癌細(xì)胞系HepG2 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；利拉魯肽（純度99%）、棕櫚酸（純度99%）購自上海源葉生物科技公司；穩(wěn)定敲減ZAG 的質(zhì)粒（ZAG shRNA）及其對照（NC shRNA）、ZAG 過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-ZAG）及其對照（pcDNA）購自上海生工公司；總RNA 提取試劑盒購于北京普洛麥格生物；HiScript 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、SYBR qPCR Master Mix 試劑盒購于南京諾唯贊生物公司；甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）含量測定試劑盒、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)吸附測定（ELISA）試劑盒購于北京索萊寶生物公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物公司；顯微分光光度計(jì)（型號(hào)K5500）購自北京凱奧科技公司；熒光定量PCR儀（7500 型）購于美國ABI 公司；流式細(xì)胞儀（Gallios 型）購于美國貝克曼公司；酶標(biāo)儀（ELX800 型）購自美國Bio-Tek 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在含5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中復(fù)蘇HepG2 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞90%匯合時(shí)加入胰蛋白酶消化，按照1∶3 比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。將對數(shù)期HepG2 細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔密度鋪6 孔板，利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 將ZAG shRNA、NC shRNA、pcDNA-ZAG、pcDNA 分別轉(zhuǎn)染60%匯合的細(xì)胞，收獲轉(zhuǎn)染48 h 細(xì)胞按照實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)印跡法分析轉(zhuǎn)染效果，隨后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。未處理的HepG2 細(xì)胞記為對照（Con）組；用含0.4 mmol/L 棕櫚酸的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h［5］記為棕櫚酸組；用含0.4 mmol/L 棕櫚酸、100 nmol/L 利拉魯肽培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h［5］記為棕櫚酸+利拉魯肽組；用含0.4 mmol/L 棕櫚酸的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染pcDNA-ZAG 細(xì)胞24 h 記為棕櫚酸+pcDNA-ZAG 組；采用含0.4 mmol/L 棕櫚酸、100 nmol/L 利拉魯肽培養(yǎng)液分別孵育轉(zhuǎn)染ZAG shRNA、pcDNA-ZAG 細(xì)胞24 h 記為棕櫚酸+利拉魯肽+ZAG shRNA 組、棕櫚酸+利拉魯肽+pcDNAZAG 組。

1.4 RT-qPCR 檢測ZAG mRNA 表達(dá)總RNA 提取試劑盒從HepG2 細(xì)胞提取總RNA，并采用K5500顯微分光光度計(jì)進(jìn)行定量；利用HiScript 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將500 ng RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)SYBR qPCR Master Mix 試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR。利用β-actin 作為內(nèi)部參照，2-ΔΔCt法確定ZAG mRNA表達(dá)量。β-actin 引物上游5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3′，下游5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3′；ZAG 引物上游5′-GCTTACCTGGAGGAGGAGTG-3′，下游5′-TTCCCTGGGTAGAAGTCGTAG-3′。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將上述細(xì)胞收集于離心管中，PBS 洗滌2 次，重懸于500 μL 結(jié)合緩沖液中使細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL。用5 μL FITCAnnexin V、5 μL PI 在黑暗中染色15 min。1 h 內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡百分比。

1.6 細(xì)胞內(nèi)TG、TC 含量測定參照TG、TC 測定試劑盒分析細(xì)胞內(nèi)TG、TC 水平。

1.7 IL-6 和TNF-α 釋放量檢測采用ELISA 試劑盒測定細(xì)胞上清液中IL-6 和TNF-α 水平。將細(xì)胞上清液、標(biāo)準(zhǔn)品分貝添加至包被孔（預(yù)先涂有特異性抗體），37 ℃下孵育1.5 h，向每個(gè)孔中添加酶聯(lián)抗體37 ℃下孵育1 h，向每個(gè)孔中添加生物素抗體37 ℃下孵育30 min；加入終止溶液結(jié)束顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀測量樣品在450 nm 處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算IL-6 和TNF-α 釋放量。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法分析ZAG、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)量RIPA 裂解緩沖液孵育細(xì)胞10 min，超聲處理細(xì)胞三次破碎細(xì)胞，4 ℃下12 000 r/min 離心10 min 收集上清液。使用BCA 試劑盒確定蛋白濃度，取等量蛋白樣品上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，用5%脫脂牛奶緩沖液封閉膜1 h，然后將膜與特定的一抗在4 ℃下孵育過夜。再用對應(yīng)的二抗孵育膜1 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)。Image Lab 6.0 軟件分析各條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 軟件（20.0 版本）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZAG 在棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)及NALFD 患者肝組織中的表達(dá)與對照組比較，棕櫚酸組HepG2 細(xì)胞ZAG 在mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），見圖1A-C、表1。與正常肝組織比較，NALFD 患者肝組織ZAG mRNA和ZAG 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖1D。

圖1 ZAG 在棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)及NALFD 患者肝組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of ZAG in HepG2 cells induced by palmitic acid and in liver tissues of NALFD patients

表1 ZAG 在棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)Tab.1 Expression of ZAG in HepG2 cells induced by palmitic acid

表1 ZAG 在棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)Tab.1 Expression of ZAG in HepG2 cells induced by palmitic acid

注：與對照組相比，*P ＜0.05

2.2 利拉魯肽對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞ZAG表達(dá)的影響與對照組比較，利拉魯肽組HepG2細(xì)胞ZAG mRNA 和ZAG 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，棕櫚酸+利拉魯肽組HepG2 細(xì)胞ZAG mRNA 和ZAG 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。見圖2、表2。

表2 利拉魯肽對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞ZAG 表達(dá)的影響Tab.2 Effect of liraglutide on ZAG expression in HepG2 cells induced by palmitic acid

表2 利拉魯肽對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞ZAG 表達(dá)的影響Tab.2 Effect of liraglutide on ZAG expression in HepG2 cells induced by palmitic acid

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與棕櫚酸組相比，#P ＜0.05

圖2 利拉魯肽對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞ZAG 表達(dá)的影響Fig.2 Effect of liraglutide on ZAG expression in HepG2 cells induced by palmitic acid

2.3 ZAG shRNA、pcDNA-ZAG 轉(zhuǎn)染效果檢測與NC shRNA 組比 較，ZAG shRNA 組HepG2 細(xì) 胞ZAG 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與pcDNA 組比較，pcDNA-ZAG 組HepG2 細(xì)胞ZAG 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。見圖3、表3。

表3 Westernblot 檢測ZAG shRNA 和pcDNA-ZAG 的轉(zhuǎn)染效果Tab.3 The transfection effect of ZAG shRNA and pcDNA-ZAG was detected by Westernblot

表3 Westernblot 檢測ZAG shRNA 和pcDNA-ZAG 的轉(zhuǎn)染效果Tab.3 The transfection effect of ZAG shRNA and pcDNA-ZAG was detected by Westernblot

注：與NC shRNA 組相比，*P ＜0.05；與pcDNA 組相比：#P ＜0.05

圖3 Western blot 檢測ZAG shRNA 和pcDNA-ZAG 的轉(zhuǎn)染效果Fig.3 Transfection effect of ZAG shRNA and pcDNA-ZAG detected by Western blot

2.4 利拉魯肽通過ZAG調(diào)控棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的凋亡、脂質(zhì)代謝和炎癥因子表達(dá)與對照組比較，棕櫚酸組HepG2 細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，棕櫚酸+利拉魯肽組HepG2 細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與棕櫚酸+利拉魯肽組比較，棕櫚酸+利拉魯肽+ZAG shRNA 組HepG2 細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。見圖4、表4。

圖4 利拉魯肽通過ZAG 調(diào)控棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞的凋亡Fig.4 Liraglutide regulates palmitic acid-induced apoptosis in HepG2 cells via ZAG

表4 利拉魯肽通過ZAG 調(diào)控棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞的凋亡、脂質(zhì)代謝和炎癥因子表達(dá)Tab.4 Liraglutide regulates palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and inflamMolatory factor expression of HepG2 cells by ZAG

表4 利拉魯肽通過ZAG 調(diào)控棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞的凋亡、脂質(zhì)代謝和炎癥因子表達(dá)Tab.4 Liraglutide regulates palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and inflamMolatory factor expression of HepG2 cells by ZAG

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與棕櫚酸組相比，#P ＜0.05；與棕櫚酸組+利拉魯肽組相比，&P ＜0.05

2.5 利拉魯肽聯(lián)合ZAG對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝和炎癥因子表達(dá)的影響與對照組比較，棕櫚酸組HepG2 細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，棕櫚酸+利拉魯肽組HepG2 細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，棕櫚酸+pcDNA-ZAG 組HepG2 細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與棕櫚酸+利拉魯肽組、棕櫚酸+pcDNA-ZAG 組比較，棕櫚酸+利拉魯肽+pcDNA-ZAG 組HepG2 細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。見圖5、表5。

表5 利拉魯肽聯(lián)合ZAG 對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝和炎癥因子表達(dá)的影響Tab.5 Effects of liraglutide combined with ZAG on palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and expression of inflamMolatory factors in HepG2 cells

表5 利拉魯肽聯(lián)合ZAG 對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝和炎癥因子表達(dá)的影響Tab.5 Effects of liraglutide combined with ZAG on palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and expression of inflamMolatory factors in HepG2 cells

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與棕櫚酸組相比，#P ＜0.05；與棕櫚酸組+利拉魯肽組相比，&P ＜0.05；與棕櫚酸+pcDNA-ZAG組相比，▽P ＜0.05

圖5 利拉魯肽聯(lián)合ZAG 對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effects of liraglutide combined with ZAG on palmitic acid-induced apoptosis in HepG2 cells

3 討論

NAFLD 以其發(fā)病率、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)沉重而受到廣泛關(guān)注［7］。研究表明，脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)參與了NAFLD 進(jìn)展［8-9］。利拉魯肽干預(yù)可降低HepG2 細(xì)胞中脂肪酸合成酶水平，增加甘油三酯脂肪酶水平，改善HepG2 細(xì)胞脂代謝［10］。細(xì)胞中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平是判斷脂質(zhì)沉積的重要指標(biāo)［11］。本研究中棕櫚酸處理顯著提高HepG2 細(xì)胞中TC 和TG 水平，而利拉魯肽干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)這一改變，說明利拉魯肽可逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)沉積。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽干預(yù)還可減弱棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡。Bcl-2 和Bax 蛋白是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要因子［12］，Bax 移位至線粒體并促進(jìn)其膜通透性改變進(jìn)而導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)因子釋放進(jìn)而發(fā)揮促凋亡作用，而Bcl-2 則通過與Bax 結(jié)合抑制Bax 活性進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用［13］。本研究中利拉魯肽干預(yù)顯著下調(diào)棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，與利拉魯肽的抗凋亡作用吻合。IL-6、TNF-α 是最常用的炎性細(xì)胞因子［14-15］，研究指出TNF-α 和IL-6 表達(dá)增加與肝細(xì)胞脂肪酸攝取增加，脂質(zhì)積聚以及肝細(xì)胞脂毒性相關(guān)［16］。本研究中利拉魯肽干預(yù)顯著降低棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞中TNF-α 和IL-6 水平，說明利拉魯肽可減輕棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

ZAG 是一種主要的組織相容性復(fù)合物Ⅰ分子和脂質(zhì)動(dòng)員因子，可促進(jìn)脂質(zhì)代謝和葡萄糖利用，并調(diào)節(jié)胰島素敏感性。ZAG 除存在于脂肪組織外，其在骨骼肌、腦組織、腎臟以及肝臟亦存在廣泛表達(dá)［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)NALFD 患者肝組織、棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞中ZAG 表達(dá)降低，而利拉魯肽干預(yù)顯著增加HepG2 細(xì)胞、棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中ZAG 表達(dá)量，提示利拉魯肽對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂毒性損傷保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)ZAG 表達(dá)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ZAG 顯著抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡，并降低TC、TG 水平，說明ZAG 可減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)積累和炎癥反應(yīng)。XIAO 等［19］研究證實(shí)ZAG 過表達(dá)可顯著抑制脂肪生成、促進(jìn)脂肪分解、脂肪酸氧化，進(jìn)而減弱棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂肪積累，與本研究發(fā)現(xiàn)基本吻合。NF-κB 是機(jī)體重要的炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)調(diào)節(jié)因子，其通過激活下游炎癥因子IL-6 和TNF-α 轉(zhuǎn)錄，參與啟動(dòng)和擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，過表達(dá)ZAG 通過抑制NF-κB 途徑顯著抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞炎癥反應(yīng)［20-21］。本研究中過表達(dá)ZAG 顯著降低棕櫚酸誘導(dǎo)后HepG2細(xì)胞中IL-6 和TNF-α 水平，說明ZAG 可能通過調(diào)控NF-κB 途證發(fā)揮抗炎作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默ZAG 表達(dá)顯著減弱利拉魯肽對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)沉積以及炎癥反應(yīng)的影響，過表達(dá)ZAG 則增強(qiáng)利拉魯肽對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)積累和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。

綜上所述，利拉魯肽可減輕棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)積累和炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與利拉魯肽上調(diào)ZAG 表達(dá)有關(guān)，本研究為利拉魯肽防治非酒精性脂肪性肝病提供了理論依據(jù)。