王冉冉， 孫政勤， 劉江月

（1山東大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院消化科，山東威海264200；2濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東濰坊261053）

隨著社會的發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)病率正在節(jié)節(jié)攀升。糖尿病患者多伴有多器官并發(fā)癥，這也是導(dǎo)致T2DM 患者死亡的主要原因。流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者中合并肝臟病變者高達50%以上，其中非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）最常見［1］，若不進行干預(yù)治療，可進一步發(fā)展成為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化，甚至肝癌［2］。研究顯示，糖尿病患者中終末期肝病的死亡率顯著高于心血管疾?。?］。目前認為，T2DM 糖脂代謝紊亂導(dǎo)致的氧化應(yīng)激過度及炎癥因子的異常分泌，是糖尿病肝損傷的主要發(fā)生機制［4］。NF-κB是多種炎癥信號通路的關(guān)鍵因子，NF-κB 激活后可促進多種炎癥因子釋放，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［5］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ）是配體活化型的核轉(zhuǎn)錄因子，可減少 NF-κB 活化，是 NF-κB 關(guān)鍵的負調(diào)控因子，具有抑制炎癥因子生成的重要作用［6］。梓醇（catalpol，CAT）屬于環(huán)烯醚萜類化合物，是地黃的有效活性成分，具有降低血糖、抗氧化應(yīng)激和抗炎［7-8］等多種藥理作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，梓醇能夠減輕糖尿病早期內(nèi)皮細胞損傷［9-10］，保護糖尿病大血管［11］，但梓醇對2 型糖尿病引起的肝臟損傷是否同樣具有保護作用呢？其作用是否與PPARγ/NF-κB信號通路有關(guān)？均未見報道。本研究通過觀察梓醇對 T2DM 大鼠肝臟的影響，并從 PPARγ/NF-κB 信號通路的角度探討其可能機制。

材料和方法

1 動物與飼料

清潔級 SD 大鼠，體重180～220 g，購自濟南金豐實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（魯）2014-0006。普通飼料及高脂飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

2 試劑與儀器

梓醇（純度≥98%）購于成都植標化純生物科技有限公司；二甲雙胍（metformin，MET）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；水飛薊素（silymarin，SIL）購自上海麥克林生化科技有限公司；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒、抗 NF-κB 和 PPARγ 抗體及 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction 試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)研究所。PCR 儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像分析儀購自Bio-Rad。

3 方法

3.1 動物模型的建立與分組 70只清潔級SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）后，選取血糖大于11.1 mmol/L 的60只大鼠，隨機分為糖尿病模型（model，MOD）組、二甲雙胍（MET；100 mg·kg-1·d-1）組、水飛薊素（SIL；100 mg·kg-1·d-1）組 、梓 醇 低 劑 量（low-dose CAT，CAT-L；10 mg·kg-1·d-1）組、梓醇中劑量（middle-dose CAT，CAT-M；50 mg·kg-1·d-1）和梓醇高劑量組（highdose CAT，CAT-H；100 mg·kg-1·d-1）組，高脂飼料喂養(yǎng)，另以10 只健康雄性SD 大鼠為對照（control，CON）組，普通飼料喂養(yǎng)，造模同時灌胃給藥，造模時間8 周。于8 周末麻醉大鼠，稱量體重，腹主動脈快速取血備用，隨后處死大鼠，收集肝臟標本。

3.2 肝臟指數(shù)的計算 肝臟指數(shù)（%）=肝重（g）/大鼠體重（g）×100%

3.3 血清指標的檢測 采用全自動生化分析儀檢測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、ALT 和 AST 水平；糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）試劑盒檢測糖化血紅蛋白水平，操作嚴格按照說明書進行。

3.4 ELISA法檢測血清IL-6和TNF-α的水平 分離血清，分別采用試劑盒檢測IL-6 及TNF-α 的水平，嚴格按照試劑盒說明進行實驗操作，測定450 nm 處吸光度（A）值。

3.5 HE 染色觀察肝臟的病理變化 取10%福爾馬林固定的肝臟組織，石蠟包埋后，4 μm連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟損傷情況，并由2 名病理科醫(yī)生同時閱片根據(jù)肝臟病理半定量評分標準進行評分［12］。正常肝臟組織為 0 分，肝細胞水腫為 1 分，肝細胞空泡樣變?yōu)? 分，肝組織點狀壞死并門靜脈內(nèi)炎癥細胞浸潤為3分，肝組織片狀壞死為4分。

3.6 油紅O 染色觀察肝臟的變化 取冰凍肝臟組織，于冰凍切片機中，10 μm 連續(xù)切片，4%中性甲醛固定10 min后，蒸餾水沖洗，60%異丙醇分化30 s，油紅O 染色，60%異丙醇分化后，蘇木精復(fù)染，光鏡下觀察肝臟的變化。

3.7 RT-qPCR 檢測肝臟組織中 IκB 的 mRNA 表達取部分肝臟組織研磨后，Trizol 法提取總RNA，合成cDNA，進行PCR 擴增，嚴格按說明書操作，以GAPDH為內(nèi)參照，引物序列見表1。

3.8 Western blot 檢測肝臟組織中PPARγ 的蛋白表達及NF-κB p65 蛋白核轉(zhuǎn)位 取部分肝臟組織研磨后，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，采用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction 試劑盒分別提取胞漿和胞核蛋白，所有蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h 后分別加Ⅰ抗（1∶500），4 ℃過夜，TBST 漂洗3次，加入Ⅱ抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，圖像分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 18.0進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間采用單因素方差分析，組間采用 SNK-q進行比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 梓醇對T2DM 大鼠肝臟指數(shù)、FBG、HbA1c、TC、TG、ALT和AST的影響

與 CON 組比較，MOD 組的肝臟指數(shù)、FBG、HbA1c、TC、TG、ALT 和 AST 等指標均明顯升高（P＜0.05）；與MOD 組比較，CAT-L 組上述指標的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著顯著性（P＞0.05），MET組、SIL組、CAT-M組和CAT-H 組的各指標均顯著降低（P＜0.05）；其中CAT-H 組的肝臟指數(shù)、TC、TG、ALT 和 AST 較 MET 組和SIL 組降低更加明顯（P＜0.05），提示梓醇能夠降低T2DM 大鼠血糖和血脂，減輕肝臟損傷，高劑量組效果優(yōu)于二甲雙胍和水飛薊素，見表2、3。

表2 梓醇對各組大鼠肝臟指數(shù)、FBG和HbA1c的影響Table 2. Effects of catalpol on liver weight index，F(xiàn)BG and HbA1c in rats of different groups（Mean±SD. n=10）

表3 梓醇對各組大鼠TC、TG、ALT和AST的影響Table 3. Effects of catalpol on TC，TG，ALT and AST in rats of different groups（Mean±SD. n=10）

2 梓醇對T2DM大鼠IL-6和TNF-α的水平的影響

與 CON 組比較，MOD 組的 IL-6 和 TNF-α 的水平均明顯升高（P＜0.05）；與MOD 組比較，CAT-L 組上述指標的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），MET 組、SIL組、CAT-M組和CAT-H組的IL-6和TNF-α的水平均明顯降低（P＜0.05）；其中 CAT-H 組較 MET 組和SIL組各指標變化更加明顯（P＜0.05），提示梓醇能夠降低T2DM 大鼠炎癥因子水平，改善肝臟功能，見圖1、2。

3 梓醇對T2DM大鼠肝臟形態(tài)的影響

Figure 1. Effects of catalpol（CAT）on the serum levels of IL-6 in the rats of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖1 梓醇對各組大鼠血清IL-6水平的影響

Figure 2. Effects of catalpol（CAT）on the serum levels of TNF-α in the rats of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖2 梓醇對各組大鼠血清TNF-α水平的影響

HE 染色結(jié)果顯示，CON 組的肝細胞排列規(guī)則，組織結(jié)構(gòu)清晰；MOD組的肝細胞排列松散，見大量脂肪空泡，肝小葉肝索結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細胞浸潤，偶見點狀壞死；與MOD 組比較，CAT-L 組無明顯改善，MET 組、SIL 組、CAT-M 組和 CAT-H 組的肝細胞排列規(guī)則，脂肪空泡、炎癥細胞均明顯減少，形態(tài)得到明顯改善。肝臟病理半定量評分統(tǒng)計結(jié)果顯示，與MOD 組比較，MET 組、SIL 組、CAT-M 組和 CAT-H 組病理學(xué)評分顯著降低（P＜0.05），其中CAT-H 組的病理學(xué)評分低于MET組和SIL組（P＜0.05），見圖3、4。

油紅O 染色結(jié)果顯示，CON 組的肝細胞形態(tài)正常，僅有很少量脂肪細胞被染成紅色，無脂肪變性；MOD 組的肝細胞排列不規(guī)則，組織大面積被染成紅色，明顯脂肪變性，有大量脂質(zhì)沉積；與MOD 組比較，CAT-L 組未見顯著改變，MET 組、SIL 組、CAT-M組和CAT-H 組的肝細胞排列比較規(guī)則，脂肪變性程度明顯減輕，提示梓醇能夠改善T2DM 大鼠肝臟的脂肪變性，見圖5。

4 梓醇對T2DM 大鼠肝臟組織中IκB mRNA 表達的影響

與 CON 組比較，MOD 組 IκB 的 mRNA 表達明顯減少（P＜0.05）；與MOD 組比較，CAT-L 組未見明顯增多（P＞0.05），MET 組、SIL 組、CAH-T-M 組和CATH 組 IκB 的 mRNA 表達均明顯增多（P＜0.05）；其中CAT-H 組較 MET 組和 SIL 組 IκB 的 mRNA 表達增多更加顯著（P＜0.05），提示梓醇促進 IκB 的 mRNA 表達且效果優(yōu)于二甲雙胍和水飛薊素，見圖6。

5 梓醇對T2DM 大鼠肝臟組織中PPARγ蛋白表達的影響

Figure 3. Effects of catalpol（CAT）on the morphological changes of rat liver tissues in different groups（HE staining，×400）.圖3 HE染色觀察梓醇對各組大鼠肝臟形態(tài)的影響

Figure 4. Effects of catalpol（CAT）on liver histopathological scores in different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖4 梓醇對各組大鼠肝臟組織病理評分的影響

與CON組比較，MOD組的PPARγ蛋白明顯減少（P＜0.05）；與 MOD 組比較，CAT-L 組未見顯著增多（P＞0.05），MET 組、SIL 組、CAT-M 組和 CAT-H 組的PPARγ 蛋白表達均明顯增多（P＜0.05）；CAT-H 組較MET 組和SIL 組增多更加明顯（P＜0.05），提示梓醇能夠促進PPARγ 蛋白表達且效果優(yōu)于二甲雙胍和水飛薊素，見圖7。

6 梓醇對T2DM 大鼠肝臟細胞核內(nèi)NF-κB 表達的影響

與 CON 組比較，MOD 組核內(nèi) NF-κB p65 蛋白的表達明顯增多（P＜0.05）；與MOD 組比較，CAT-L 組未見顯著減少（P＞0.05），MET 組、SIL 組、CAT-M 組和CAT-H 組核內(nèi)NF-κB p65 蛋白的表達均顯著減少；CAT-H 組較 MET 組和 SIL 組減少更加明顯（P＜0.05），提示梓醇能夠抑制NF-κB 活化且效果優(yōu)于二甲雙胍和水飛薊素，見圖8。

討 論

Figure 5. Effects of catalpol（CAT）on rat liver morphological changes in different groups observed by oil red O staining（×400）.圖5 油紅O染色觀察梓醇對各組大鼠肝臟形態(tài)的影響

Figure 6. Effects of catalpol（CAT）on the mRNA expression of IκB in the rat liver of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖6 梓醇對各組大鼠肝臟組織中IκB mRNA表達的影響

T2DM 可引起多臟器并發(fā)癥的發(fā)生，肝損傷就是其常見并發(fā)癥之一，非酒精性脂肪肝是T2DM 肝損傷的早期表現(xiàn)，長期NAFLD 又可引發(fā)嚴重的葡萄糖與脂質(zhì)代謝紊亂，加重糖尿病及其他并發(fā)癥的發(fā)生。因此，尋找治療糖尿病并預(yù)防肝損傷的藥物尤為重要。中草藥本身及其提取物因其具有多靶點、不良反應(yīng)小等特點已被廣泛用于治療各種疾病，包括糖尿病及其肝損傷的治療，并顯示了較好的療效［13］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，梓醇能夠防治T2DM大鼠大血管病變［10-11］，而梓醇是否能夠防治糖尿病引起的肝損傷未見報道。本研究采用高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ 注射制備2 型糖尿病大鼠模型，8 周后模型組大鼠肝臟出現(xiàn)明顯的脂肪變性，肝功能明顯受損，而梓醇干預(yù)的大鼠肝臟脂肪變性損傷明顯減輕，肝功能也得到明顯改善，說明梓醇能夠減輕T2DM 引起的肝臟損傷。

NF-κB 通路是對氧化應(yīng)激最敏感的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑之一，從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控炎癥因子的表達，是調(diào)控轉(zhuǎn)錄多種炎性因子的共同通路。IκB（inhibitor of NF-κB）是NF-κB的抑制蛋白。在靜息狀態(tài)下，IκB與NF-κB 結(jié)合以失活狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，當受到氧化應(yīng)激等因素刺激時，IκB 磷酸化并降解，使得NF-κB 活化，并從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，與相應(yīng)的炎癥相關(guān)基因結(jié)合，啟動炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達。近年來的研究證實，活化的PPARγ 可以通過抑制NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的活性來負向發(fā)揮間接轉(zhuǎn)錄調(diào)控的效應(yīng)，明顯抑制炎癥反應(yīng)，PPARγ/NF-κB信號途徑為調(diào)控炎癥的一個重要靶點［14-15］。Jiménez-Flores 等［16］發(fā)現(xiàn)姜黃素能減輕DM 所致肝損傷，并且肝組織PPARγ蛋白表達顯著増加，而NF-κB表達降低，其機制可能與 PPARγ/NF-κB 信號通路有關(guān)。Motteleb等［17］發(fā)現(xiàn)通過激活PPARγ介導(dǎo)NF-κB信號通路從而抑制炎癥和氧化反應(yīng)。Belfort 等［18］發(fā)現(xiàn)PPARγ 能通過抑制NF-κB 信號通路的活化來抑制炎癥因子IL-6和TNF-α 的分泌。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)梓醇能夠抑制NF-κB活化，有效減輕ox-LDL誘導(dǎo)EA.hy926細胞炎癥因子TNF-α 的表達［9］。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病模型組肝臟的PPARγ 表達明顯降低，細胞核內(nèi)NF-κB p65的蛋白含量明顯增多，同時也發(fā)現(xiàn)血清中IL-6和TNF-α的水平顯著升高，說明糖尿病大鼠肝臟NF-κB信號通路活化，炎癥反應(yīng)明顯；經(jīng)梓醇干預(yù)后，PPARγ 蛋白表達顯著增加，細胞核內(nèi) NF-κB 蛋白含量明顯減少，血清中IL-6 和TNF-α 的水平顯著下降，表明梓醇可能通過PPARγ/NF-κB 信號通路抑制了炎癥反應(yīng)，減輕了T2DM大鼠肝臟損傷。

Figure 7. Effects of catalpol（CAT）on the protein expression of PPARγ in the rat liver of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖7 梓醇對各組大鼠肝臟PPARγ蛋白表達的影響

Figure 8. Effects of catalpol（CAT）on nuclear protein expression of NF-κB in the rat liver of different groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group；△P＜0.05 vs MET group；▲P＜0.05 vs SIL group.圖8 梓醇對各組大鼠肝臟細胞核內(nèi)NF-κB表達的影響