彭軍輝 安 偉 張明輝

鯉皰疹病毒2型和3型三重PCR檢測方法的建立與應(yīng)用*

彭軍輝 安 偉 張明輝①

(上海市水產(chǎn)研究所 上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 上海 200433)

鯉皰疹病毒2型和3型主要感染鯽(金)魚()、鯉魚()和錦鯉()及其雜交種，具有高度的傳染性和致病性，對(duì)養(yǎng)殖鯉科魚類危害嚴(yán)重。為了建立快捷、高效且能同時(shí)檢測這2種類型鯉皰疹病毒的檢測技術(shù)，本研究根據(jù)鯉皰疹病毒的DNA聚合酶基因(2、3型)、解旋酶基因(2型)和胸苷激酶基因(3型)的保守序列，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，通過對(duì)三重PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立起鯉皰疹病毒2型和3型三重PCR檢測方法，并運(yùn)用該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的鯽魚和鯉魚組織樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，該三重PCR檢測方法僅在鯉皰疹病毒陽性樣品中擴(kuò)增出3條特異性條帶，表現(xiàn)出良好的特異性；以克隆的目的基因質(zhì)粒為模板，進(jìn)行10倍梯度稀釋，該檢測方法能檢出的極限值為2.85×102copies/μL，表現(xiàn)出較高的靈敏性；運(yùn)用該方法檢測122份鯽魚和60份鯉魚樣品，其結(jié)果與運(yùn)用國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 36194-2018)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 7212.1-2011)方法檢測的結(jié)果一致。本研究表明，構(gòu)建的三重PCR檢測方法不僅具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度，還能同時(shí)檢測2種類型的鯉皰疹病毒，有效提高檢測效率。

鯉皰疹病毒；三重PCR；鯽(金)魚；鯉魚

鯉皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)又稱金魚造血器官壞死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV)，主要引起鯽(金)魚()的造血器官壞死病。自1992年首次于日本報(bào)道后，該病毒迅速在全球范圍內(nèi)蔓延，1995年首次在我國臺(tái)灣的東北地區(qū)被報(bào)道(Jung, 1995; Chang, 1999)，2012年江蘇省養(yǎng)殖的異育銀鯽()大規(guī)模感染該病毒并大量死亡，之后其在全國其他鯽(金)魚主養(yǎng)區(qū)蔓延并廣泛存在，對(duì)鯽(金)魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(袁銳等, 2019)。鯉皰疹病毒3型(CyHV-3)又稱錦鯉皰疹病毒(koi herpesvirus, KHV)，其主要感染鯉魚()和錦鯉()，引發(fā)高傳染性和致死性的錦鯉皰疹病毒病(koi herpesvirus disease)，該病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)必須申報(bào)的疾病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。2002年以來，CyHV-3先后引起我國東北地區(qū)和海南、廣東、天津、江蘇等省市養(yǎng)殖的鯉魚和錦鯉發(fā)病死亡，對(duì)各地的鯉魚和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅(曲木等, 2020)。

目前，已有多種關(guān)于CyHV-2和CyHV-3的PCR檢測方法被研究報(bào)道。Waltzek等(2009)建立CyHV-2普通PCR檢測方法，以其目的基因構(gòu)建的質(zhì)粒為模板，最低能檢測到78 copies/μg DNA，且對(duì)鯉皰疹病毒1型(Cyprinid herpesvirus 1, CyHV-1)和CyHV-3等病毒基因無擴(kuò)增，具有較高的靈敏度和特異性。張旻等(2017)根據(jù)CyHV-2的衣殼蛋白基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立了CyHV-2的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，該方法最低能檢測到10 copies的目的基因，且對(duì)CyHV-3、流行性造血器官壞死病毒(epizootic haematopoietic necrosis, EHNV)等水生動(dòng)物病原無交叉反應(yīng)。趙欣等(2017)建立了CyHV-2的微滴式數(shù)字PCR檢測方法，可準(zhǔn)確定量CyHV-2，表現(xiàn)出高度的靈敏性和穩(wěn)定性。謝亞君等(2019)針對(duì)CyHV-2的普通PCR、雙重PCR和熒光定量PCR等不同檢測方法之間的優(yōu)劣進(jìn)行了比較。對(duì)于CyHV-3的研究報(bào)道則涵蓋了普通PCR、巢式PCR、雙重PCR和熒光定量PCR等各種PCR檢測方法(Gilad, 2002; 劉葒等, 2002; 鄭樹城等, 2016)。但是，同時(shí)對(duì)這2種類型鯉皰疹病毒進(jìn)行檢測的PCR方法尚未有報(bào)道。

本研究建立的鯉皰疹病毒2型和3型三重PCR檢測方法，能在1次反應(yīng)中同時(shí)檢測2種類型的鯉皰疹病毒，具有精準(zhǔn)、快捷和高效的特點(diǎn)，該方法不僅能豐富和完善鯉皰疹病毒2型和3型的檢測方法，還可為其預(yù)警監(jiān)測工作提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)毒株及樣品

CyHV-2、CyHV-3、草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)、鯉春病毒血癥病毒(spring viraemia of carp virus, SVCV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV)、白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)和蝦虹彩病毒(shrimp hemocyte iridescent virus, SHIV)等水生動(dòng)物病毒病料及檢測所用鯽魚和鯉魚樣品均由實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存(其中，CyHV-3陽性樣本由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所饋贈(zèng))。CyHV-2的鑒定方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 36194-2018)《金魚造血器官壞死病毒檢測方法》，CyHV-3的鑒定方法參照水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 7212.1-2011)《鯉皰疹病毒檢測方法第1部分：錦鯉皰疹病毒》。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中鯉皰疹病毒的基因序列，選取DNA聚合酶基因(CyHV-2、CyHV-3型,)、解旋酶基因(CyHV-2型,)和胸苷激酶基因(CyHV-3型,)的保守序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物(表1)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 DNA模板和標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.3.1 DNA模板的制備 研究所用CyHV-2、CyHV-3和其他水生動(dòng)物病毒DNA及檢測樣品DNA均按照DNA提取試劑盒(TaKaRa, 大連)說明書進(jìn)行提取，并于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 分別以CyHV-2和CyHV-3的DNA為模板，按照DNA擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa, 大連)的方法進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系和條件見表2，然后，將反應(yīng)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并按照DNA凝膠回收試劑盒(Axy Prep)的方法對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收，之后將其分別連接到pMD19-T載體上，從而構(gòu)建、和的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，并根據(jù)以下公式計(jì)算其拷貝數(shù)：

拷貝數(shù)(copies/μL)=6.02×1023(copies/mol)×質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10?9/質(zhì)粒分子量(g/mol)。

1.4 三重PCR檢測方法的建立與優(yōu)化

將、和的質(zhì)?？截悢?shù)換算到同一數(shù)量級(jí)后按比例混合，以混合后的質(zhì)粒為DNA模板，在單重PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增。3對(duì)引物(10 μmol/L)的添加量均設(shè)為0.2～0.6 μL 5個(gè)梯度，退火溫度為55℃～60℃ 6個(gè)梯度，其他反應(yīng)條件不變，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果選擇最佳引物量和退火溫度，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 引物序列和擴(kuò)增基因

表2 單重PCR反應(yīng)體系和條件

1.5 敏感性實(shí)驗(yàn)

將、和的混合質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，濃度范圍為2.85×108～2.85×10 copies/μL，以各梯度濃度的混合質(zhì)粒為DNA模板，采用優(yōu)化后的三重PCR檢測方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測試該方法的靈敏性。

1.6 特異性實(shí)驗(yàn)

分別以CyHV-2、CyHV-3、GCRV、SVCV、IHHNV、WSSV和SHIV等水生動(dòng)物病毒的DNA或cDNA為模板，采用優(yōu)化后的三重PCR檢測方法進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)還以CyHV-2和CyHV-3的混合DNA為模板，分別進(jìn)行只添加單對(duì)引物的單重PCR反應(yīng)，以檢測該方法的特異性。

1.7 養(yǎng)殖生產(chǎn)中樣品檢測的應(yīng)用

根據(jù)1.1的方法分別對(duì)實(shí)驗(yàn)室自2018—2020年鑒定保存的122份鯽魚和60份鯉魚樣品進(jìn)行鯉皰疹病毒檢測。其中，鯽魚樣品進(jìn)行CyHV-2檢測，鯉魚樣品進(jìn)行CyHV-3檢測，并從鯽魚樣品中選取15份CyHV-2陽性樣品和15份陰性樣品進(jìn)行CyHV-3檢測；另外，再選取15份CyHV-2和CyHV-3的DNA混合樣(其中，陽性DNA混合樣為8份)進(jìn)行CyHV-2和CyHV-3檢測。同時(shí)，采用本研究建立的三重PCR方法對(duì)以上樣品進(jìn)行檢測，以評(píng)估該方法的穩(wěn)定性和可靠性。

1.8 三重PCR檢測方法評(píng)價(jià)

根據(jù)OIE《水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)》(2019)所規(guī)定的原則，在95%以上的置信區(qū)間、允許誤差5%的范圍內(nèi)對(duì)122份鯽魚和60份鯉魚樣品進(jìn)行鯉皰疹病毒檢測，以1.1推薦的檢測方法為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算該三重PCR檢測方法的診斷敏感性(Dse)和診斷特異性(Dsp)，計(jì)算公式如下：

診斷敏感性Dse=TP/(TP+FN)×100%

診斷特異性Dsp=TN/(TN+FP)×100%

2 結(jié)果

2.1 三重PCR檢測方法的建立與優(yōu)化

構(gòu)建的三重PCR檢測方法的最佳退火溫度為57℃，在此溫度下，添加不同引物量的各PCR反應(yīng)均擴(kuò)增出3條目的條帶，其中，當(dāng)各引物(10 μmol/L)添加量為0.2 μL時(shí)，3條目的條帶最清晰且均一 (圖1)，將送檢測序的結(jié)果與GenBank中的CyHV-2和CyHV-3基因序列進(jìn)行比對(duì)，匹配度均達(dá)到99%以上。優(yōu)化后的三重PCR最佳反應(yīng)體系和條件見表3。

圖1 最佳退火溫度下的三重PCR擴(kuò)增結(jié)果

表3 三重PCR反應(yīng)體系和條件

2.2 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別以2.85×108～2.85×10 copies/μL的混合質(zhì)粒為模板進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，隨著模板濃度的降低，3條目的條帶的亮度也逐漸降低，該方法能檢測到的質(zhì)粒最低極限為2.85×102copies/μL (圖2)。

圖2 三重PCR敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以CyHV-2和CyHV-3為模板的三重PCR反應(yīng)和分別添加單對(duì)引物進(jìn)行的單重PCR反應(yīng)均只擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，無交叉反應(yīng)；以GCRV、SVCV、IHHNV、WSSV和SHIV為模板的三重PCR反應(yīng)均未擴(kuò)增出任何條帶，結(jié)果見圖3。

2.4 檢測結(jié)果

采用1.1推薦的方法檢測的結(jié)果顯示，122份鯽魚樣品中有15份為CyHV-2陽性，107份為CyHV-2陰性，從中抽取的30份鯽魚樣品進(jìn)行CyHV-3檢測，結(jié)果全部為陰性；60份鯉魚樣品中有8份為CyHV-3陽性，52份為CyHV-3陰性，采用三重PCR方法檢測的結(jié)果與以上結(jié)果一致。另外，以DNA混合樣為模板進(jìn)行的三重PCR反應(yīng)的結(jié)果顯示，8份為陽性，7份為陰性，具體結(jié)果見表4。

圖3 三重PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 三重PCR檢測方法評(píng)價(jià)

分別以國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 36194-2018)和水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 7212.1-2011)推薦的檢測方法為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)計(jì)算公式求得本研究建立的三重PCR檢測方法的診斷敏感性(Dse)和診斷特異性(Dsp)均為100%，結(jié)果見表5。

表4 樣品檢測結(jié)果

3 討論

2018年全國鯉魚和鯽魚的養(yǎng)殖總產(chǎn)量超過了573萬t，占淡水魚類養(yǎng)殖品種的比重達(dá)到19.37% (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等, 2019)。針對(duì)此類養(yǎng)殖占比較高的水產(chǎn)品種，采用精準(zhǔn)而高效的檢測技術(shù)對(duì)其易感病原進(jìn)行合理監(jiān)測，可有效提升對(duì)疫病發(fā)生的預(yù)警能力，這對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展具有重要意義。CyHV-2主要引起鯽(金)魚的造血器官壞死病，該病的發(fā)病率和死亡率均較高，屬于新發(fā)疫病，近幾年本實(shí)驗(yàn)室對(duì)送樣鯽魚進(jìn)行檢測時(shí)，也偶有檢出CyHV-2陽性，提示其對(duì)本地鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展可能存在潛在的威脅。此外，本研究對(duì)鯽魚進(jìn)行CyHV-3的檢測結(jié)果顯示，30份鯽魚樣品(包括15份CyHV-2陽性樣品)均為CyHV-3陰性。值得一提的是，CyHV-3主要感染鯉魚及其雜交種，但最新研究表明，鯽魚也會(huì)感染CyHV-3 (全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站等, 2020)，這說明對(duì)鯽魚進(jìn)行CyHV-3檢測具有一定的必要性。

PCR檢測方法作為生物實(shí)驗(yàn)研究中的常規(guī)技術(shù)手段，在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用廣泛(宋增磊等, 2019; 周朝偉等, 2019)。與傳統(tǒng)PCR相比，多重PCR可在1次反應(yīng)中檢測多個(gè)目的基因，也可用于多種病原的同時(shí)檢測，顯得更加便捷和高效(張迪等, 2013; 劉嬋等, 2018; 張文等, 2019)。本研究建立的三重PCR檢測方法擴(kuò)增的基因?qū)儆贑yHV-2和CyHV-3的同源序列，基因和基因分別為CyHV-2和CyHV-3的特有序列，在引物設(shè)計(jì)時(shí)，合理地控制3條目的條帶的長度，確保各擴(kuò)增條帶易于辨認(rèn)，從而有效區(qū)分相應(yīng)的病原。3對(duì)引物之間無交叉反應(yīng)，且對(duì)GCRV、SVCV、IHHNV、WSSV和SHIV 5種水生動(dòng)物病毒的基因無擴(kuò)增，具有良好的特異性。通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，該方法所能檢測的混合質(zhì)粒的最低極限為2.85×102copies/μL，比謝亞君等(2019)建立的CyHV-2雙重PCR檢測方法靈敏度高約50倍，與張文等(2019)建立的鯉浮腫病毒(carp edema virus, CEV)和CyHV-2三重PCR檢測方法的靈敏度接近。樣品檢測結(jié)果顯示，采用該方法與采用1.1推薦方法的檢測結(jié)果較一致，表明該方法的精確性和穩(wěn)定性都較高，并且該方法極大地縮短了樣品檢測的時(shí)間，有效提高檢測效率，可在大量樣品的實(shí)際檢測中廣泛應(yīng)用。

表5 不同方法對(duì)樣品的檢測

另外，由于CyHV-2和CyHV-3的主要宿主存在一定差異，在實(shí)際生產(chǎn)中很少會(huì)發(fā)生混合感染的情況，截至目前，作者并未見有這2種病毒混合感染的研究報(bào)道，但鯽魚也會(huì)感染CyHV-3的最新研究提示，在未來的養(yǎng)殖生產(chǎn)中，可能會(huì)發(fā)生鯽魚混合感染CyHV-2和CyHV-3的情況，而本研究建立的三重PCR檢測方法亦可對(duì)此種特殊樣品進(jìn)行有效的檢測與鑒定。

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Establishment and Application of the Triplex PCR Method for Simultaneous Detection of Cyprinid Herpesvirus 2 and Cyprinid Herpesvirus 3

PENG Junhui, AN Wei, ZHANG Minghui①

(Shanghai Fisheries Research Institute, Shanghai Fisheries Technical Extension Station, Shanghai 200433, China)

Cyprinid herpesvirus 2 (CyHV-2) and Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) mainly infect crucian carp (goldfish), common carp, koi, and their hybrids. They are highly infectious and pathogenic viruses and can seriously damage the culture of Cyprinid fishes. In order to establish a rapid, and efficient method for simultaneously detecting the two viruses, three pairs of specific primers were designed based on the conserved sequences of the genes encoding DNA polymerase (CyHV-2, 3), helicase (CyHV-2), and thymidine kinase (CyHV-3). By optimizing the reaction conditions and system for the triplex PCR, a detection method for identifying different types of carp herpesviruses was established and validated using theandtissue samples preserved in the laboratory. The results showed that the triplex PCR method amplified only three specific bands from the herpes virus positive carp samples, showing good specificity. Using the cloned plasmid as a template with 10-fold dilution, the detection limit of the method was 2.85×102copies/μL, showing high sensitivity. A total of 122 samples of crucian carp and 60 samples of common carp were analyzed by this method and the detection results were consistent with those of the national standard (GB/T 36194-2018) and industry standard (SC/T 7212.1-2011). In conclusion, the newly established triplex PCR method is not only highly accurate and sensitive, but can also detect two types of carp herpesvirus simultaneously, thereby effectively improve the detection efficiency.

Cyprinid herpesvirus;Triplex PCR;;

ZHANG Minghui, E-mail: mhzhang0907@163.com

S941.41

A

2095-9869(2021)06-0158-07

10.19663/j.issn2095-9869.20201124002

http://www.yykxjz.cn/

彭軍輝, 安偉, 張明輝. 鯉皰疹病毒2型和3型三重PCR檢測方法的建立與應(yīng)用. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(6): 158–164

PENG J H, AN W, ZHANG M H. Establishment and application of the triplex PCR method for simultaneous detection of Cyprinid herpesvirus 2 and Cyprinid herpesvirus 3. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(6): 158–164

張明輝，高級(jí)工程師，E-mail: mhzhang0907@163.com

2020-11-24,

2021-01-07

*上海市農(nóng)業(yè)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)預(yù)研制(2018-026)資助 [This work was supported by Pre-Development of Shanghai Agricultural System Standard (2018-026)]. 彭軍輝，E-mail: pengjhpeng@163.com

(編輯 馬璀艷)