李婉春 吳光斌 陳發(fā)河

雙螺桿擠壓對(duì)低值海參多肽提取率及抗氧化活性的影響*

李婉春 吳光斌 陳發(fā)河①

(集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建 廈門(mén) 361021)

海地瓜()屬低值海參產(chǎn)品，為了提高其使用價(jià)值，本研究以海地瓜為原料，利用雙螺桿擠壓輔助不同濃度亞硫酸鈉(Na2SO3)處理，并對(duì)擠出物多肽提取率、游離巰基含量和蛋白質(zhì)溶解度進(jìn)行測(cè)定；利用DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)擠出物多肽進(jìn)行分離純化，并對(duì)多肽純化組分的分子量分布和抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，雙螺桿擠壓輔助3.0% Na2SO3處理組多肽提取率、游離巰基含量和蛋白質(zhì)溶解度分別為(57.12±0.62)%、(110.32±0.07)%和(28.72±0.13)%，較空白對(duì)照組(control check, CK)分別顯著提升(7.66±0.35)%、(105.32±0.01)%和(4.91±0.15)% (<0.05)；粗肽經(jīng)純化得到純化組分Ⅰ(1000～3000 u)和純化組分Ⅱ(<1000 u)。CK組、雙螺桿擠壓輔助3.0% Na2SO3處理組及其經(jīng)分離純化后得到的的純化組分Ⅰ、Ⅱ海地瓜多肽的DPPH自由基清除率的IC50值分別為25.51、12.72、6.58和9.02 mg/mL，對(duì)超氧陰離子自由基清除率的IC50值分別為25.56、13.51、11.87和8.44 mg/mL。純化組分Ⅰ在濃度為80 μg/mL時(shí)，人正常肝細(xì)胞(human normal liver cell, LO2)細(xì)胞存活率較損傷組最大提高(20.33±0.41)%；純化組分Ⅱ在濃度為20 μg/mL時(shí)，LO2細(xì)胞存活率較損傷組最大提高(17.07±1.18)%。綜上所述，雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理海地瓜提高了多肽的提取率，并增強(qiáng)了海地瓜多肽抗氧化活性。

低值海參；擠壓加工；多肽；抗氧化

我國(guó)大約有140多種海參，在遼寧、山東、福建省有豐富的資源(王麗麗等, 2019)，可食用的種類(lèi)有20多種，其中，在黃海和渤海區(qū)域的刺參食用品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高(李忠清等, 2016)。海地瓜()是海參的一個(gè)種類(lèi)，屬棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea)、芋參目(Molpadida)、海地瓜屬()，因其外觀(guān)形似地瓜，故被稱(chēng)為海地瓜；其體壁纖維粗壯，食用品質(zhì)較差，被列為中國(guó)海參市場(chǎng)上的低值海參(趙麗等, 2019)。海地瓜營(yíng)養(yǎng)成分不亞于刺參()(伏緯華等, 1991)，其含有蛋白質(zhì)、多糖、皂苷等多種生物活性物質(zhì)(王方國(guó)等, 1998)。海參膠原肽是海參膠原蛋白在一定條件下螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生分解后的產(chǎn)物，通常采用酶法制備(王晴等, 2020)，具有抗氧化、抗炎、降血壓和降糖等功效(Ratih, 2018)。

雙螺桿擠壓技術(shù)是一種高溫高壓加工技術(shù)，通過(guò)螺桿轉(zhuǎn)動(dòng)，推動(dòng)擠出物料，在摩擦力和剪切力的作用下，物料發(fā)生破碎、捏合、混煉、殺菌、成型等物理和生化反應(yīng)，最后通過(guò)不同的模口形成不同形態(tài)的“熔化物”(劉鵬等, 2018; 王旭等, 2020)。研究表明，擠壓加工使蛋白質(zhì)的酶作用位點(diǎn)暴露，多肽得率有所提升(張旭娜等, 2017)，提高多肽的生物活性(王瑞斌等, 2019)。侯殿志等(2020)研究發(fā)現(xiàn)，擠壓小米多肽與發(fā)酵小米多肽相比有更強(qiáng)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-I-converting enzyme, ACE)抑制活性和抗氧化能力，并能提高蛋白質(zhì)消化率。齊寶坤等(2016)利用雙螺桿擠壓膨化預(yù)處理制備豆粕多肽，制得的多肽抗氧化能力得到提升。Ralston等(2008)利用亞硫酸鈉(Na2SO3)和半胱氨酸處理蛋白質(zhì)，使其二硫鍵斷裂，可提高溶解度。蘇笑芳(2018)通過(guò)Na2SO3誘導(dǎo)大豆分離蛋白原料并進(jìn)行雙螺桿擠壓，使蛋白原料中的二硫鍵斷裂，游離巰基含量增多，蛋白質(zhì)聚集程度降低。目前，尚未見(jiàn)利用雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理技術(shù)制備海洋動(dòng)物蛋白多肽的研究報(bào)道。

為解決海地瓜利用率低、肽提取率低的問(wèn)題，本文以海地瓜為原料，研究了雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理對(duì)海地瓜多肽提取率和抗氧化活性的影響，以期為海地瓜開(kāi)發(fā)利用及其多肽加工新工藝提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 材料與試劑

海地瓜干品(山東帆歌海洋食品有限公司)；亞硫酸鈉、乙腈和三氟乙酸(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇(分析純，廣東西隴化工股份有限公司)；牛血清白蛋白生化試劑(滬試級(jí)BR)、福林酚(分析純)、胰蛋白酶和DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(北京索萊寶科技有限公司)；大孔吸附樹(shù)脂(DA201-C)(河南鄭州勤實(shí)科技有限公司)；超氧陰離子試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

G32型雙螺桿擠壓機(jī)(山東濟(jì)南盛潤(rùn)機(jī)械公司)；DFY-500D高速粉碎機(jī)(浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；DHG-9146鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；HH-4恒溫水浴鍋(江蘇金壇市科析儀器有限公司)；GL-20G-Ⅱ-D臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；Ultimate 3000高效液相色譜儀(DIONEX公司，美國(guó))；T6新世紀(jì)-H紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理 將海地瓜干品充分泡發(fā)，洗凈去泥沙，剪成1 cm3左右的碎塊，于70℃的干燥箱中烘干至恒重，取出，用粉碎機(jī)粉碎成大小均勻的粉末，過(guò)60目篩，裝入密封袋中于–20℃中冷藏備用。以該方法制備的海地瓜干粉作為空白對(duì)照，記為CK組。

1.3.2 雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理海地瓜工藝

參考蘇笑芳(2018)方法略作修改，以1.3.1制備的海地瓜干粉為原料，分別用0 g/100 g、1.5 g/100 g、3.0 g/100 g干基原料的亞硫酸鈉溶于去離子水，調(diào)節(jié)海地瓜干粉水分含量至50%，并于4℃條件下平衡水分，過(guò)夜。設(shè)置螺桿轉(zhuǎn)速為34 Hz，機(jī)筒溫度為140 ℃，喂料速度為18 Hz，進(jìn)行擠壓加工，擠出物二次烘干并粉碎過(guò)篩，裝袋備用。以該方法制備的海地瓜干粉為雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理組。

1.3.3 海地瓜多肽制備工藝 CK組和雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理海地瓜多肽制備工藝：以制備的海地瓜干粉→酶解→醇沉除多糖→旋蒸濃縮→冷凍干燥備用。酶解工藝條件：選用胰蛋白酶，pH值為8，酶解溫度為37℃，酶解時(shí)間為4 h，加酶量為10,000 U/g，料液比1∶120。

1.3.4 多肽提取率的測(cè)定 參考Lowry等(1951)的方法，取適量酶解液，加入10%的三氯乙酸(檀志芬等, 2005)，使大分子蛋白質(zhì)沉淀，離心后取上清液，稀釋一定倍數(shù)，取1 mL按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法操作，于640 nm處測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和以下公式計(jì)算多肽提取率。

式中，為測(cè)定樣品的質(zhì)量濃度(μg/mL)；為測(cè)定時(shí)取用的體積(mL)；為稀釋倍數(shù)；為樣品質(zhì)量(g)。

1.3.5 游離巰基含量的測(cè)定 參考Anderson等(2000)的方法，準(zhǔn)確稱(chēng)取30 mg樣品，加入1.0 mL A液(pH為8.0的0.2 mol/L Tris-HCl，8 mol/L的尿素，1% SDS和3 mmol/L EDTA)，迅速混勻，25℃振蕩水浴1 h，加入0.1 mL B液(pH 8.0的0.2 mol/L Tris-HCl和10 mmol/L DTNB)，繼續(xù)25℃振蕩水浴1 h，12,000 r/min離心15 min，取上清液，于412 nm處測(cè)定OD值，并作空白對(duì)照。

1.3.6 蛋白質(zhì)溶解度的測(cè)定 參考Wu等(2012)的方法，稱(chēng)取1 g樣品，加20 mL蒸餾水，振蕩混勻，95℃水浴20 min，取出后補(bǔ)蒸餾水至液面線(xiàn)位置，冷卻，4500 r/min離心20 min，福林酚法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量。根據(jù)公式計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)溶解度，計(jì)算公式如下：

式中，測(cè)為上清液中蛋白質(zhì)含量(mg)；為樣品中總蛋白質(zhì)含量(mg)。

1.3.7 海地瓜多肽的分離純化方法 參照孟春英(2016)和王穎(2015)的方法，選擇DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂純化雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理海地瓜多肽粗提物。實(shí)驗(yàn)條件：柱規(guī)格為1.5cm×30.0 cm，樣品濃度為10 mg/mL，上樣量為10 mL，洗脫速度為4mL/min，用25%、50%、75%和95%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，于220 nm處測(cè)定OD值，收集洗脫峰旋轉(zhuǎn)濃縮，凍干備用。

1.3.8 海地瓜多肽分子量的測(cè)定 參照朱翰林等(2020)的方法，色譜柱選用TSK-GEL G2000SWXL(7.8mm×300.0 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為乙腈∶超純水∶三氟乙酸(35∶65∶0.1)，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，樣品濃度為2 mg/mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C (12,400 Da)，抑肽酶(6500 Da)，維生素B12(1355 Da)，谷胱甘肽(613Da)和L-精氨酸(174 Da)，以洗脫體積和相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lg MW)作圖得到的相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)及方程：= –0.268 5+5.641 6，2= 0.999 6。

1.3.9 海地瓜多肽DPPH自由基清除率的測(cè)定 參照趙夢(mèng)倩等(2020)的方法，取各濃度的樣品2.0 mL，加入2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，漩渦振蕩混勻，室溫條件下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定OD值，記為A。取各濃度的樣品2.0 mL，加入2.0 mL的無(wú)水乙醇，記為。取2.0 mL無(wú)水乙醇，加入2.0 mL的DPPH溶液，記為0。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.3.10 海地瓜多肽超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定 根據(jù)南京建成超氧陰離子試劑盒的說(shuō)明書(shū)，對(duì)純化海地瓜多肽超氧陰離子自由基清除率進(jìn)行測(cè)定。

1.3.11 不同純化組分海地瓜多肽對(duì)LO2細(xì)胞存活率的影響 參照霍嘉穎等(2018)的方法，采用MTT法測(cè)定純化組分Ⅰ和純化組分Ⅱ海地瓜多肽對(duì)人正常肝細(xì)胞(human normal liver cell, LO2)細(xì)胞存活率的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1.5×104cells/孔的密度接種于96孔板，每孔100 μL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的純化組分Ⅰ和純化組分Ⅱ海地瓜多肽，空白對(duì)照組不作處理。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的0.5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h后避光加入150 μL的DMSO溶液，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm吸光值，其中，空白對(duì)照組記為0，樣品組為1，按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.12 H2O2誘導(dǎo)LO2細(xì)胞氧化損傷模型的建立 按照1.3.11方法培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照組(不做任何處理)，損傷組(不同濃度的H2O2溶液處理)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的0.5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h后避光加入150 μL的DMSO溶液，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處吸光值，按公式(1～4)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.13 不同純化組分海地瓜多肽對(duì)LO2細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用 按照1.3.11方法培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照組(不做任何處理)，損傷組(H2O2處理)和樣品組(不同濃度的純化組分Ⅰ溶液或純化組分Ⅱ溶液+H2O2)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為80 μmol/L的H2O2，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入100 μL的0.5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h后避光加入150 μL的DMSO溶液，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處吸光值，按公式(1～4)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理對(duì)海地瓜多肽提取率、游離巰基含量和蛋白質(zhì)溶解度的影響

海地瓜的多肽提取率、蛋白質(zhì)溶解度和游離巰基含量見(jiàn)表1，CK組多肽提取率為(49.47±0.26)%，游離巰基含量為(5.00±0.05)%，蛋白質(zhì)溶解度為(23.81± 0.28)%。在雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理組中，當(dāng)Na2SO3添加量為0時(shí)，與CK組相比，多肽提取率顯著增加了(2.52±0.01)% (<0.05)，游離巰基含量增加了(7.15±0.05)%，蛋白質(zhì)溶解度增加了(1.41±1.06)%；當(dāng)Na2SO3添加量為1.5%時(shí)，與CK組相比，多肽提取率顯著增加了(4.24±0.48)% (<0.05)，游離巰基含量顯著增加了(21.64±0.03)% (0.05)，蛋白質(zhì)溶解度增加了(1.96±1.25)%；當(dāng)Na2SO3添加量為3.0%時(shí)，與CK組相比，多肽提取率顯著增加了(7.65±0.35)%，游離巰基含量顯著增加了(105.32±0.01)%，蛋白質(zhì)溶解度顯著增加了(4.91±0.15)%。

表1 雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理對(duì)海地瓜多肽提取率、游離巰基含量和蛋白質(zhì)溶解度的測(cè)定

雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理提高了海地瓜多肽提取率，可能是海地瓜膠原蛋白在Na2SO3作用下蛋白質(zhì)二硫鍵斷裂并發(fā)生解聚，游離巰基含量增多，使得蛋白質(zhì)溶解度提高，再經(jīng)過(guò)雙螺桿擠壓，海地瓜膠原蛋白在剪切力和摩擦力的作用下，蛋白質(zhì)分子展露出更多的酶作用位點(diǎn)，使得酶能充分作用于底物，進(jìn)而加強(qiáng)酶解效果，從而使多肽提取率得到提升。根據(jù)上述結(jié)果，雙螺桿擠壓輔助3.0% Na2SO3處理組的多肽提取率最高，選用該組進(jìn)行后續(xù)分離純化實(shí)驗(yàn)。

2.2 雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理海地瓜多肽的分離純化

海地瓜粗肽的分離純化結(jié)果見(jiàn)圖1，樣品經(jīng)25%、50%、75%和95%乙醇梯度洗脫后得到2個(gè)組分，經(jīng)25%乙醇洗脫得到的組分命名為純化組分Ⅰ，經(jīng)50%乙醇洗脫得到的組分命名為純化組分Ⅱ。以上2個(gè)組分海地瓜多肽分別經(jīng)旋蒸濃縮后凍干備用。

2.3 純化海地瓜多肽相對(duì)分子質(zhì)量的分布分析

純化組分Ⅰ和純化組分Ⅱ的高效液相色譜圖見(jiàn)圖2，根據(jù)純化組分Ⅰ和純化組分Ⅱ的保留時(shí)間，由相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)的回歸方程= –0.2685+5.6416，2=0.999 6計(jì)算得出，純化組分Ⅰ中相對(duì)分子質(zhì)量在1000～3000 u范圍內(nèi)的多肽占相對(duì)含量的(61.97±1.71)%，相對(duì)分子質(zhì)量在1000 u以?xún)?nèi)的多肽占相對(duì)含量的(37.49±2.67)%；純化組分Ⅱ中的多肽相對(duì)分子質(zhì)量大多在1000 u以?xún)?nèi)。

圖1 雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理海地瓜多肽的分離純化

2.4 海地瓜多肽體外抗氧化能力分析

2.4.1 海地瓜多肽DPPH自由基清除率的分析 對(duì)CK組、雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理組及其分離純化后制得的純化組分Ⅰ和純化組分Ⅱ的DPPH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定。如圖3所示，隨著樣品濃度的增加，4種海地瓜多肽對(duì)DPPH自由基的清除均呈上升趨勢(shì)，IC50值分別為25.51、12.72、6.58和9.02 mg/mL。與CK組相比，原料經(jīng)處理后制得的海地瓜多肽抗氧化活性得到提升，其中，純化組分Ⅰ的DPPH自由基的清除效果最好。

2.4.2 海地瓜多肽對(duì)超氧陰離子自由基清除率的分析 對(duì)CK組、雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理組及其分離純化后制得的純化組分Ⅰ和純化組分Ⅱ的超氧陰離子自由基清除率進(jìn)行測(cè)定。如圖4所示，隨著樣品濃度的增加，4種海地瓜多肽對(duì)超氧陰離子自由基的清除均呈上升趨勢(shì)，IC50值分別為25.56、13.51、11.87和8.44 mg/mL。與CK組相比，原料經(jīng)處理后制得的海地瓜多肽抗氧化活性得到提升，其中，純化組分Ⅱ的超氧陰離子自由基的清除效果最好。

圖2 純化組分Ⅰ和純化組分Ⅱ海地瓜多肽的相對(duì)分子量分布

圖3 4種海地瓜多肽DPPH自由基的清除率分析

圖4 4種海地瓜多肽超氧陰離子自由基清除率分析

這可能是由于原料經(jīng)雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理后酶解制得的海地瓜與未處理原料制得的海地瓜多肽相比，在多肽的氨基酸序列和相對(duì)含量等方面會(huì)有所改變，從而影響了多肽的抗氧化活性。關(guān)于本研究中海地瓜多肽的氨基酸序列和相對(duì)含量與抗氧化活性之間的關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。

2.5 不同純化組分海地瓜多肽對(duì)LO2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

2.5.1 不同純化組分海地瓜多肽對(duì)LO2細(xì)胞存活率的影響 不同純化組分海地瓜多肽對(duì)LO2細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖5。純化組分Ⅰ濃度在20～100 μg/mL內(nèi)，能提高LO2細(xì)胞存活率，其中，濃度為40 μg/mL時(shí)，LO2細(xì)胞存活率達(dá)到最大值[(126.25±5.63)%]。純化組分Ⅱ在0～40 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率提高，在濃度為20 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到最大值[(112.84±2.53)%]，濃度>40 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率開(kāi)始下降。

2.5.2 H2O2誘導(dǎo)LO2細(xì)胞氧化損傷模型的建立 H2O2處理后細(xì)胞存活率見(jiàn)圖6。與對(duì)照組相比，在H2O2作用濃度小于60 μmol/L時(shí)，LO2細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著變化；濃度≥80 μmol/L時(shí)，存活率開(kāi)始下降，開(kāi)始對(duì)細(xì)胞具有刺激作用(<0.05)，此時(shí)，細(xì)胞受到一定程度的氧化應(yīng)激，但還未達(dá)到不可逆轉(zhuǎn)的狀態(tài)。隨著H2O2濃度的增大，細(xì)胞受到刺激的程度加深，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率越低。因此，選擇濃度為80 μmol/L的H2O2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 純化組分Ⅰ和純化組分Ⅱ海地瓜多肽對(duì)LO2細(xì)胞存活率的影響

圖6 不同濃度H2O2對(duì)LO2細(xì)胞存活率的影響

2.5.3 不同純化組分海地瓜多肽對(duì)LO2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 不同純化組分海地瓜多肽對(duì)LO2氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用見(jiàn)圖7。經(jīng)80 μmol/L H2O2處理后，細(xì)胞存活率顯著降低，說(shuō)明模型構(gòu)建成功。經(jīng)濃度為60～300 μg/mL的純化組分Ⅰ預(yù)處理后，細(xì)胞存活率顯著上升，且在濃度為80 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率較損傷組最大提高(20.33±0.41)%。純化組分Ⅱ在20～50 μg/mL內(nèi)能顯著提高細(xì)胞存活率，在濃度為20 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率較損傷組最大提高(17.06±1.18)%。說(shuō)明純化組分Ⅰ和Ⅱ均對(duì)氧化損傷的LO2細(xì)胞具有保護(hù)作用。

圖7 純化組分Ⅰ和純化組分Ⅱ海地瓜多肽對(duì)氧化損傷LO2細(xì)胞存活率的影響

3 討論

3.1 雙螺桿擠壓輔助亞硫酸處理海地瓜對(duì)多肽提取率的提升作用

雙螺桿擠壓技術(shù)主要應(yīng)用于以淀粉和蛋白質(zhì)為原料的食品加工領(lǐng)域(涂德星等, 2020; 趙貴興等, 2017)。在輔助制備植物多肽中有一些報(bào)道，陳盛楠等(2012)利用雙螺桿擠壓膨化高溫豆粕酶解制備豆粕肽的得率得到明顯提高。相關(guān)研究表明，亞硫酸鈉處理蛋白可使聚集蛋白質(zhì)解聚，二硫鍵斷裂，從而提高蛋白質(zhì)溶解度(Tsen, 1969)。將雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理技術(shù)用于海地瓜膠原蛋白多肽制備目前尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究通過(guò)雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理海地瓜酶解制備多肽，使海地瓜膠原蛋白中的二硫鍵斷裂，多肽提取率為(57.12±0.62)%，較CK組顯著提升(7.66±0.35)% (<0.05)，游離巰基含量顯著提升(105.32±0.01)% (<0.05)，蛋白質(zhì)溶解度顯著提升(4.91±0.15)% (<0.05)。童靜靜(2014)利用蛋白酶酶解方法對(duì)海地瓜膠原蛋白進(jìn)行水解，得到的海地瓜多肽提取率為52.63%。陳超(2014)利用胰蛋白酶對(duì)海地瓜膠原蛋白進(jìn)行水解，在最優(yōu)工藝條件下多肽提取率為(42.66±1.51)%。說(shuō)明雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理聯(lián)合酶解技術(shù)與普通酶解方法相比，能有效提高海地瓜膠原蛋白的多肽提取率，使海地瓜的使用價(jià)值得到提升。

3.2 雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理對(duì)海地瓜多肽抗氧化活性的提升作用

近年來(lái)，大量研究表明，海參膠原蛋白經(jīng)酶解后產(chǎn)生的多肽對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基等有清除作用(Zhou, 2012)。曹亞蘭等(2011)研究表明，擠壓預(yù)處理技術(shù)可提高蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。本研究表明，CK組、雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理組及純化組分Ⅰ(1000～3000 u)和純化組分Ⅱ(<1000 u)的DPPH自由基清除率IC50值分別為25.51、12.72、6.58和9.02 mg/mL；超氧陰離子自由基清除率IC50值分別為25.56、13.51、11.87和8.44 mg/mL，經(jīng)雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理的海地瓜多肽的抗氧化能力與申彩紅(2015)研究結(jié)果相似。李真(2015)研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)分子質(zhì)量在1000～5000 Da海地瓜多肽對(duì)DPPH自由基清除能力較好，而<1000 Da的海地瓜清除效果次之，本研究結(jié)果與上述一致。但不同分子量范圍的海參多肽清除氧自由基的能力存在差異，抗氧化活性與分子量并不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，多肽的抗氧化性還取決于組成多肽的氨基酸組成和序列。當(dāng)短肽中能與自由基發(fā)生反應(yīng)的供氫基團(tuán)充分暴露時(shí)，此時(shí)才具有較強(qiáng)的抗氧化性(王靜等, 2010)。經(jīng)H2O2誘導(dǎo)建立LO2細(xì)胞氧化損傷模型，純化組分Ⅰ在濃度為80 μg/mL時(shí)，LO2細(xì)胞存活率較損傷組顯著提高(20.33±0.41)% (0.05)，純化組分Ⅱ在濃度為20 μg/mL時(shí)，LO2細(xì)胞存活率較損傷組顯著提高(17.07±1.18)% (0.05)，這表明低分子量的海地瓜多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，這與王天明等(2014)的研究結(jié)果相一致。綜上所述，海地瓜膠原蛋白經(jīng)雙螺桿擠壓和亞硫酸鈉處理后制得的多肽分子量較小，抗氧化能力得到提升，對(duì)氧化損傷細(xì)胞有較好的保護(hù)作用。

4 小結(jié)

本研究利用雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理結(jié)合酶解技術(shù)制備海地瓜多肽，海地瓜膠原蛋白中游離巰基含量、蛋白質(zhì)溶解度和多肽提取率得到提升。與CK組相比，雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理組及其純化組分抗氧化能力得到提升。同時(shí)，2個(gè)純化組分對(duì)氧化損傷的LO2細(xì)胞有較好的保護(hù)作用。綜上所述，雙螺桿擠壓輔助亞硫酸鈉處理技術(shù)能提升海地瓜多肽提取率和抗氧化能力，該方法可為海地瓜多肽的制備新工藝提供新思路。

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Effect of Twin-Screw Extrusion on the Extraction Rate and Antioxidant Activity of Low-Value Sea Cucumber Polypeptides

LI Wanchun, WU Guangbin, CHEN Fahe①

(College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen, Fujian 361021,China)

The sea cucumberis a low-value aquatic product of the ocean. To increase its value, in this study, dried body walls of low-valuewere selected as research material, from which the polypeptides were extracted by employing twin-screw extrusion with sodium sulfite-assisted treatment. The extraction rate of polypeptides and free sulfhydryl groups, and protein solubility from extrudate ofwere determined. Polypeptides were separated from the extrudate and purified with DA201-C type microporous adsorption resin, and the molecular weight distribution and antioxidant ability of the purified components were determined. The results showed that for thetreated with twin-screw extrusion-assisted 3.0% sodium sulfite, the polypeptide extraction rate, free sulfhydryl content, and protein solubility were (57.12±0.62)%, (110.32±0.07)%, and (28.72±0.13)%, respectively, which were significantly higher (<0.05) by (7.66±0.35)%, (105.32±0.01)% and (4.91±0.15)%, respectively, compared with those of the control check (CK). Moreover, the molecular weights of the purified polypeptides component I and Ⅱ were 1000～3000 u and <1000 u, respectively. Additionally, comparing thepolypeptides with those in the CK group, twin-screw extrusion-assisted 3.0% sodium sulfite extraction group, purified component I, and purified component Ⅱ, the IC50values of DPPH radical scavenging rate were 25.51 mg/mL, 12.72 mg/mL, 6.58 mg/mL, and 9.02 mg/mL, respectively, and the IC50values of the superoxide anion radicals scavenging rate were 25.56mg/mL, 13.51 mg/mL, 11.87 mg/mL and 8.44 mg/mL, respectively. The results of oxidation damage protection test suggested that for purified component I, the optimal concentration for the survival rate of LO2cells was 80 μg/mL, with (20.33±0.41)% increase compared with that in the injured group; as for the purified component Ⅱ, it was 20 μg/mL with (17.07±1.18)% increase than that in the injured group. In summary, the twin-screw extrusion-assisted sodium sulfite treatment onimproved the extraction rate of polypeptide and the extracted polypeptide possessed enhanced antioxidant activity.

Low-value sea cucumber; Extrusion processing; Polypeptide; Anti-oxidation

CHEN Fahe, E-mail: fhchen@jmu.edu.cn

TS254.4

A

2095-9869(2021)06-0142-09

10.19663/j.issn2095-9869.20201014001

http://www.yykxjz.cn/

李婉春, 吳光斌, 陳發(fā)河. 雙螺桿擠壓對(duì)低值海參多肽提取率及抗氧化活性的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(6): 142–150

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陳發(fā)河，教授，E-mail: fhchen@jmu.edu.cn

2020-10-14,

2020-12-18

*廈門(mén)南方海洋研究中心科技項(xiàng)目(14GZP007NF07)和福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(B18097-2)共同資助[This work was supported by Science and Technology Project of Xiamen Southern Oceanographic Center (14GZP007NF07), and Open Fund of Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering (B18097-2)]. 李婉春，E-mail: 1135663452@qq.com

(編輯 陳 輝)