電針聯(lián)合再灌注對(duì)急性腦梗死大鼠腦損傷的影響※

●陳桂云 金海鵬 李相良 施鎮(zhèn)國(guó) 王 永

Lancet 發(fā)表的最新中國(guó)疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告[1]顯示，1990—2017年，腦卒中取代了下呼吸道感染和新生兒疾病，成為國(guó)民死亡、殘疾調(diào)整壽命年數(shù)（DALYs）、和疾病負(fù)擔(dān)的主要原因。而缺血性卒中又占卒中的70%～80%[2]，其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率給社會(huì)、家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。急性缺血性卒中治療的關(guān)鍵在于盡早開(kāi)通阻塞血管、挽救缺血半暗帶。最新發(fā)表的九大溶栓隨機(jī)對(duì)照研究的匯總分析顯示，與對(duì)照組相比，靜脈溶栓后3～6個(gè)月死亡率未明顯降低，仍高達(dá)17.9%，且2∕3 的患者依然遺留有不同程度的殘疾[3]，因此，找到一個(gè)優(yōu)于溶栓劑或提高其療效的急性缺血性腦卒中的治療方法仍然是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。目前，在所有電針預(yù)處理對(duì)急性腦缺血再灌注損傷的研究中，電針預(yù)處理干預(yù)的時(shí)間窗都在腦缺血前，雖然證實(shí)了電針預(yù)處理能誘導(dǎo)腦缺血耐受，但因患者發(fā)生腦梗死的時(shí)間窗是未知的，其在臨床的應(yīng)用尚缺乏可行性。本研究立足于臨床，通過(guò)建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，將電針預(yù)處理的時(shí)間窗置于再灌注前，即模擬急性腦梗死患者在溶栓前接受電針?biāo)疁涎ê桶贂?huì)穴治療，探索提高再灌注后進(jìn)一步減小腦神經(jīng)功能缺損癥狀的方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（閩）2008-0001。于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1 w，控制室溫（22±1）℃，濕度（55±5）%，光照時(shí)間7：00～19：00，自由攝食和飲水，在廈門大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心分組飼養(yǎng)。按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為4組，分別是假手術(shù)組、MCAo組、再灌注組和電針+再灌注組，每組20 只。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡及造模不合格的大鼠由備用大鼠補(bǔ)齊。

1.2 主要試劑和儀器2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（美國(guó)Sigma）；TUNEL 試劑盒（美國(guó)Roche）；戊巴比妥鈉（德國(guó)Merck）；韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）；熒光顯微鏡（德國(guó)Leica）；切片機(jī)（德國(guó)Leica）。

1.3 動(dòng)物模型制備參照Z(yǔ)ea Longa[4]線栓法加以改進(jìn)制作大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAo）。術(shù)前12 h 對(duì)大鼠禁食，6 h禁水。先用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL∕100 g）進(jìn)行腹腔注射麻醉，再將大鼠仰臥位固定，線栓從頸外動(dòng)脈至頸內(nèi)動(dòng)脈插入大腦中動(dòng)脈，線栓深入顱內(nèi)約18～20 mm。再灌注組阻斷110 min后拔出線栓，完成缺血再灌注。電針組阻斷90 min時(shí)以電針干預(yù)20 min后撥出線栓，完成缺血再灌注模型。假手術(shù)組除不插線栓外其余步驟同MCAo組。

1.4 電針干預(yù)方法大鼠水溝穴和百會(huì)穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]穴位標(biāo)準(zhǔn)。在大腦中動(dòng)脈缺血90 min后，予電針干預(yù)1 次。操作方法：將0.25 mm×13 mm無(wú)菌針灸針（華佗牌）分別刺入大鼠水溝穴和百會(huì)穴，水溝穴針尖朝向鼻中隔方向針刺2 mm，百會(huì)穴針向前平刺2 mm，連接好電針治療儀導(dǎo)線。應(yīng)用韓式穴位神經(jīng)刺激儀（HANS E200），選用疏密波，電流強(qiáng)度1 mA，頻率2∕15 Hz，時(shí)間20 min。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)分 大鼠造模后24 h，每組隨機(jī)取10只，參照Z(yǔ)ausinger[6]評(píng)分法對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，具體如下：①無(wú)法行動(dòng)，評(píng)為0分；②向右轉(zhuǎn)圈，評(píng)為1 分；③提起鼠尾，若有很明顯的向右旋轉(zhuǎn)且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)向左旋轉(zhuǎn)，評(píng)為2分；④將排除2分的大鼠置于平地，手抓住鼠尾固定大鼠，分別對(duì)其兩側(cè)施加同樣的壓力，若右側(cè)抵抗力不如左側(cè)，則評(píng)為3分；⑤將排除3 分的大鼠讓其自由活動(dòng)，觀察其右側(cè)前爪是否能伸直，若無(wú)法伸直評(píng)為4分；⑥若雙側(cè)沒(méi)有任何區(qū)別，評(píng)為5分。

1.5.2 TTC 染色觀察大鼠大腦梗死面積 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，每組隨機(jī)取10只大鼠采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后斷頭取腦，將大鼠大腦切成2 mm 的冠狀切片。將腦切片放入2%TTC溶液，于37 ℃溫箱中孵育10 min，再用4%多聚甲醛溶液固定后拍照，使用image pro plus 6.0軟件測(cè)定梗死面積（梗死面積=對(duì)側(cè)半球面積-病變半球非梗死面積），然后計(jì)算相對(duì)腦梗死面積百分比，即梗死面積與對(duì)側(cè)半球面積的比值。

1.5.3 TUNEL染色檢測(cè)大鼠大腦皮層缺血半暗帶細(xì)胞凋亡 TTC 染色后，每組取另外10 只大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛溶液約100 mL，將其在4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度10 μm）。切片常規(guī)脫臘、抗原修復(fù)后將切片與TUNEL 試劑混合液室溫背光孵育1 h。PBS 洗滌后，用DAPI 核染色劑觀察細(xì)胞核。由對(duì)分組不知情的研究人員使用400 倍熒光顯微鏡在每個(gè)切片中隨機(jī)觀察大腦皮層缺血半暗帶區(qū)5 個(gè)不同視野，并計(jì)數(shù)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量的百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 19.0 系統(tǒng)軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)（One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test，K-S 檢驗(yàn)），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，符合正態(tài)分布者，多組間數(shù)據(jù)差異比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差不齊采用Dunnett’s T3 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較經(jīng)單因素方差分析，各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分有顯著差異（P＜0.01）。各組經(jīng)兩兩比較，MCAo 組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于假手術(shù)組（P＜0.01）；經(jīng)再灌注干預(yù)，再灌注組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著高于MCAo 組（P＜0.01）；而經(jīng)電針干預(yù)后再進(jìn)行再灌注處理，電針+再灌注組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分較再灌注組又有顯著提高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠干預(yù)后神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.2 各組大鼠相對(duì)腦梗死面積百分比比較經(jīng)單因素方差分析，各組大鼠相對(duì)腦梗死面積百分比有顯著差異（P＜0.01）。各組經(jīng)兩兩比較，MCAo 組大鼠相對(duì)腦梗死面積百分比顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；經(jīng)再灌注干預(yù)，再灌注組大鼠相對(duì)腦梗死面積百分比較MCAo 組顯著降低（P＜0.01）；而經(jīng)電針干預(yù)后再進(jìn)行再灌注處理，電針+再灌注組大鼠的相對(duì)腦梗死面積百分比較再灌注組進(jìn)一步顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠干預(yù)后相對(duì)腦梗死面積百分比比較

2.3 各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶細(xì)胞凋亡水平比較經(jīng)單因素方差分析，各組大鼠大腦皮層缺血半暗帶細(xì)胞凋亡水平有顯著差異（P＜0.01）。各組經(jīng)兩兩比較，MCAo 組大鼠大腦皮層缺血半暗帶細(xì)胞凋亡水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；經(jīng)再灌注干預(yù)，再灌注組顯著低于MCAo 組（P＜0.01）；而經(jīng)電針干預(yù)后再進(jìn)行再灌注處理，電針+再灌注組大鼠大腦皮層缺血半暗帶細(xì)胞凋亡水平較再灌注組又有顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠干預(yù)后大腦皮層缺血半暗帶TUNEL凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率比較

3 討論

石學(xué)敏院士于1972 年開(kāi)創(chuàng)“醒腦開(kāi)竅”針刺法治療中風(fēng)病，其基于對(duì)古醫(yī)籍及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的深入研究，創(chuàng)先提出對(duì)中醫(yī)理論中“神”的把握及對(duì)中風(fēng)病病機(jī)“竅閉神匿，神不導(dǎo)氣”的認(rèn)識(shí)，明確其病位在腦，確立了以醒腦開(kāi)竅、滋補(bǔ)肝腎為主，疏通經(jīng)絡(luò)為輔的針刺治療方法，經(jīng)過(guò)四十年的臨床驗(yàn)證，取得了顯著的療效[7-10]。水溝穴是“醒腦開(kāi)竅”的主穴，系督脈穴，為手、足陽(yáng)明經(jīng)與督脈的交會(huì)穴，可調(diào)督脈、開(kāi)竅啟閉，醒腦寧神，而使機(jī)體生命活動(dòng)恢復(fù)，為臨床上常用的急救穴。另外，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦為髓海，其氣血輸注上在于百會(huì)穴，下在于風(fēng)府穴。而督脈總督一身之陽(yáng)脈，為“陽(yáng)脈之?！?，其起于胞中，下出會(huì)陰，沿脊內(nèi)上行至項(xiàng)進(jìn)入腦內(nèi)，屬腦。百會(huì)穴屬于督脈，根據(jù)“經(jīng)脈所過(guò)，主治所及”的經(jīng)絡(luò)理論，百會(huì)穴在治療腦血管疾病和脊髓相關(guān)疾病方面具有相對(duì)特異性和優(yōu)勢(shì)。從現(xiàn)代解剖學(xué)角度看，百會(huì)穴正下投影正好處于皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)區(qū)的投影區(qū)內(nèi)，同時(shí)大腦前動(dòng)脈主干也在其下走行。故本研究取水溝穴、百會(huì)穴共同干預(yù)急性腦缺血模型大鼠。隨著近代臨床醫(yī)生將電刺激引入針灸領(lǐng)域，針灸治療手段得到了擴(kuò)展和補(bǔ)充，而電針在卒中后的康復(fù)治療更是取得了一定的療效[11-16]。由于電針參數(shù)易于控制，將刺激量化，使治療量更精確，故可作為急性缺血性卒中救治的手段。

腦缺血后的溶栓治療，不僅要面臨腦出血的風(fēng)險(xiǎn)，還要考慮其它副作用，其中一個(gè)很重要的方面就是腦缺血再灌注損傷（CIRI）。腦缺血再灌注損傷的主要病理變化為細(xì)胞凋亡，凋亡是機(jī)體為了維護(hù)內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定，通過(guò)多種途徑使細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程，屬于一種生理性的細(xì)胞死亡，是可逆的。因此，本研究將電針干預(yù)置于再灌注前，明確大腦中動(dòng)脈缺血后，從神經(jīng)行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)角度，再灌注前電針?biāo)疁涎ê桶贂?huì)穴可以進(jìn)一步改善大腦中動(dòng)脈缺血性損傷，同時(shí)也在一定程度上逆轉(zhuǎn)了缺血半暗帶再灌注引起的神經(jīng)元凋亡，為急性腦梗死患者溶栓治療前予電針干預(yù)的可行性提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期未來(lái)可將這一治療手段應(yīng)用于急性腦梗死的搶救治療中。筆者團(tuán)隊(duì)將在后續(xù)的研究中探索相關(guān)機(jī)制，如電針聯(lián)合再灌注如何通過(guò)鈣超載、炎癥、氧化應(yīng)激等途徑改善缺血性腦梗死的神經(jīng)元凋亡。