軟棗獼猴桃在體外模擬消化過(guò)程中酚類物質(zhì)及抗氧化活性的變化規(guī)律

李 斌，張繼月，耿麗娟，呂慶紅，辛 廣，程順昌，高凝軒，徐清海

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110122；3.遼寧太平醫(yī)藥有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110141；4.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

流行病學(xué)研究表明，食用富含酚類的果蔬可以預(yù)防多種慢性疾病，包括癌癥、心血管疾病和糖尿病[1]。軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）是一種具有光滑可食用表皮的漿果[2]，可以整體食用，其中含有大量具有抗氧化活性的植物化學(xué)物質(zhì)，例如酚類、類黃酮、類胡蘿卜素、多糖、有機(jī)酸和礦物質(zhì)[3]，是很好的膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。軟棗獼猴桃的總酚含量（total phenolic content，TPC）約為634 mg /100 g（結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示，下同），高于許多常見水果（如梨（91.0～124.7 mg/100 g）、蘋果（75.8～125.4 mg/100 g）、草莓（244.1 mg/100 g）[4]）。

酚類化合物要達(dá)到促進(jìn)健康的作用，必須在消化系統(tǒng)中耐受，在體外消化過(guò)程中，生物可利用的酚類化合物既包含消化結(jié)束后保留的酚類化合物，又包含消化過(guò)程中釋放的酚類化合物[5]。有研究表明，蔬菜、水果和谷物在體外模擬消化過(guò)程中，TPC及其抗氧化活性變化顯著[6]，消化過(guò)程的環(huán)境條件（例如pH值和消化酶）會(huì)改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性[7]，甚至導(dǎo)致某些酚類化合物的降解和轉(zhuǎn)化[8]。因此，研究消化過(guò)程中酚類化合物含量和抗氧化活性的變化規(guī)律，對(duì)進(jìn)一步了解其對(duì)人體的有益作用至關(guān)重要。體外模擬消化系統(tǒng)作為預(yù)測(cè)化合物在體內(nèi)消化的模型，相對(duì)簡(jiǎn)單、便宜、快速且重現(xiàn)性好，已廣泛應(yīng)用于研究各種食物來(lái)源中酚類化合物等生物活性物質(zhì)在消化過(guò)程中的變化[9-10]。然而近年來(lái)，關(guān)于軟棗獼猴桃在消化過(guò)程中酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性變化規(guī)律鮮有報(bào)到。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究軟棗獼猴桃整果、游離型酚類提取物和果渣在體外模擬口腔、胃、腸消化階段中的酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性的變化規(guī)律，為綜合利用和評(píng)估軟棗獼猴桃的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃品種分別為‘LD-241’（LD-241）、‘LD-121’（LD-121）、‘懷柔’（HR）、‘長(zhǎng)江一號(hào)’（CJ-1），由稼盛（丹東）生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供。

二乙酸二氟熒光素（fluorescein diacetate，DCFH-DA）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；2,2’-偶氮二(2-甲基丙基咪)（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，ABAP） 上海麥克林生物化學(xué)有限公司；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶 上海里昂生物技術(shù)有限公司；膽汁提取物 北京奧寶星生物技術(shù)有限公司；HepG2細(xì)胞 沈陽(yáng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍重癥創(chuàng)傷中心實(shí)驗(yàn)室；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑 美國(guó)亞特蘭大生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純 上海國(guó)藥控股化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Franklin公司；超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）儀 德國(guó)Bruker公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本Shimadzu公司；C18柱 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 軟棗獼猴桃整果樣品的預(yù)處理

4個(gè)軟棗獼猴桃品種果實(shí)洗凈后分別稱取50 g放入燒杯中，加入50 mL超純水，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)勻漿，將得到的軟棗獼猴桃勻漿（即為整果樣品）在－80 ℃下密封保存，以備進(jìn)一步分析。

1.3.2 游離型酚類化合物的提取

游離型酚類化合物的提取方法參考文獻(xiàn)[11]并稍作修改。取10 g 1.3.1節(jié)制備的軟棗獼猴桃勻漿，室溫下化凍后添加200 mL體積分?jǐn)?shù)80%的丙酮溶液浸提10 min，然后在2 500×g下離心10 min。離心后，收集上清液，用濾紙過(guò)濾。重復(fù)浸提兩次后收集果渣備用并合并上清液，將上清液在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去丙酮，然后用蒸餾水定容至20 mL獲得游離型酚類提取物，在果渣中加入20 mL蒸餾水制成混懸液，并于－80 ℃保存，果渣中主要含有結(jié)合型酚類化合物。

1.3.3 體外模擬消化

體外模擬消化參考文獻(xiàn)[12]并稍作修改。在模擬消化的整個(gè)過(guò)程中，使用6 mol/L HCl和0.9 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值?？谇幌A段：取3個(gè)25 mL試管，分別加入15 mL軟棗獼猴桃勻漿（0.5 mg/mL）、游離型酚類提取物（0.5 mg/mL）和果渣混懸液（0.5 mg/mL），調(diào)節(jié)各體系的pH值為7.0，然后加入3.75 mL模擬唾液（12.5 mL 1 mmol/L CaCl2中加入16.25 mgα-淀粉酶），在水浴振蕩器（37 ℃、120 r/min）中孵育10 min以進(jìn)行口腔消化模擬，分別取出5 mL口腔模擬消化后的樣品進(jìn)行口腔消化階段指標(biāo)測(cè)定。胃消化階段：將剩余口腔模擬消化后樣品的pH值調(diào)至3.0后加入2.5 mL模擬胃液（0.4 g胃蛋白酶加入至10 mL 0.1 mol/L HCl溶液中），向試管內(nèi)填充氮?dú)獠⒚芊?，在水浴振蕩器?7 ℃、120 r/min）中孵育2 h進(jìn)行胃模擬消化，分別取出5 mL胃模擬消化后的樣品進(jìn)行胃消化階段指標(biāo)測(cè)定。腸消化階段：調(diào)整胃模擬消化后的剩余樣品pH值為7.5，加入12.5 mL模擬腸液（1 g胰酶、6 g膽汁鹽加入至50 mL 0.1 mol/L NaHCO3溶液中），向試管中充滿氮?dú)獠⒚芊?，在水浴振蕩器?7 ℃、120 r/min）中孵育2 h后進(jìn)行模擬腸消化階段指標(biāo)的測(cè)定。將每個(gè)消化階段獲得的樣品在4 ℃、10 000 r/min下離心5 min，收集上清液并冷凍干燥，在－80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 總酚含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[13]的方法測(cè)定TPC。用福林-酚試劑（100 μL）處理沒(méi)食子酸溶液和軟棗獼猴桃整果、游離型酚類提取物、果渣混懸液體外消化各階段樣品（100 μL）6 min，然后將混合物用1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的Na2CO3溶液堿化。90 min后，使用熒光分光光度計(jì)在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合物的吸光度。TPC結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示，單位為mg/100 g。

1.3.5 超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)軟棗獼猴桃中酚類單體化合物的定性分析

采用UPLC-Q-TOF-MS進(jìn)行體外消化過(guò)程中的單體酚類化合物的定性分析。利用Waters-C18柱（3.0 mm×150 mm，5 μm）進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相由A相（體積分行0.1%甲酸水溶液）和B相（乙腈）組成。流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序設(shè)置如下：0～1 min，10% B；1～3 min，10%～11% B；3～12 min，11%～15% B；12～17 min，15%～18% B；17～22 min，18%～20% B；22～30 min，20%～30% B；30～55 min，30%～40% B；55～58 min，40%～100% B；58～65 min，100%～10% B。源參數(shù)如下：負(fù)離子模式；毛細(xì)電壓2.8 kV；N2流速3.0 L/min；溫度200 ℃。碰撞誘導(dǎo)離解的碰撞氣體入口壓力為0.3 bar。碰撞能量設(shè)置為10 eV。質(zhì)譜分析使用軟件Bruker Compass Data Analysis 4.4。

1.3.6 高效液相色譜-光電二極管陣列質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)軟棗獼猴桃中酚類單體化合物的定量分析

采用HPLC-光電二極管陣列質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC coupled with photo-diode array mass spectrometry，HPLCPDA-MS）進(jìn)行體外消化過(guò)程中的單體酚類化合物的定量分析[14]。色譜柱為Waters-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。軟棗獼猴桃多酚由流動(dòng)相A相（體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液）和B相（體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液）以0.3 mL/min的流速梯度洗脫，分離出不同單體酚類。梯度洗脫程序設(shè)置如下：0～1 min，10% B；1～3 min，10%～11% B；3～5 min，11%～12% B；5～17 min，12%～13% B；17～22 min，13%～14% B；22～28 min，14%～15% B；28～33 min，15%～17% B；33～38 min，17%～18% B；38～48 min，18%～20% B；48～53 min，20%～24% B；53～54 min，24%～25% B；54～63 min，25%～30% B；63～68 min，30%～100% B；68～80 min，100%～10% B。進(jìn)樣量為10 μL，分別在280 nm和350 nm波長(zhǎng)處收集酚酸和黃酮的總離子流圖。單體峰由保留時(shí)間和MS/MS碎片確定。以綠原酸為酚酸的標(biāo)準(zhǔn)品，槲皮素-3-O-葡萄糖苷為黃烷醇和黃酮醇的標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)相應(yīng)的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酚類物質(zhì)的含量，單位為μg/g。

1.3.7 過(guò)氧自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15-16]分析消化過(guò)程中軟棗獼猴桃整果、游離型酚類提取物和果渣混懸液的抗氧化活性。分別取60 μL消化前和每個(gè)消化階段的樣品（0.5 mg/mL）加入96 孔板，在每孔加入60 μL 0.265 mmol/L DCFH（107 μL 2.48 mmol/L DCFH-DA與893 μL 1 mmol/L KOH混合后孵育5 min）和30 μL 200 mmol/L ABAP。使用熒光分光光度計(jì)在發(fā)射波長(zhǎng)為538 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm下測(cè)定混合物的熒光強(qiáng)度。根據(jù)VC標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算過(guò)氧自由基清除能力（peroxyl radical scavenging capacity，PSC），結(jié)果以VC當(dāng)量表示，單位為μmol/100 g。

1.3.8 細(xì)胞抗氧化活性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17-19]測(cè)定細(xì)胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）。將100 μL的含有HepG2細(xì)胞（6×105個(gè)/mL）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接種到96 孔板中。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，除去培養(yǎng)基后用100 μL pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（含0.1 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L NaH2PO4）洗滌細(xì)胞。然后分別取100 μL軟棗獼猴桃勻漿、游離型酚類提取物在消化前和最終腸消化后的溶液，加入100 μL 25 μmol/L DCFH-DA，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，將細(xì)胞用100 μL PBS溶液洗滌（PBS洗滌方案，無(wú)PBS洗滌方案則不進(jìn)行此洗滌步驟）。最后加入100 μL/孔ABAP（600 μmol/L），在發(fā)射波長(zhǎng)為538 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm下測(cè)定混合物的熒光強(qiáng)度，計(jì)算CAA，結(jié)果以槲皮素當(dāng)量表示，單位為μmol/100 g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)SPSS 20軟件中的Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，采用SPSS 20軟件進(jìn)行Pearson’s相關(guān)性分析。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟棗獼猴桃樣品體外消化后總酚含量

軟棗獼猴桃整果、游離型酚類提取物和果渣在未消化、口腔、胃和腸消化階段TPC的變化如圖1所示。無(wú)論是整果、游離型酚類提取物還是果渣樣品，4個(gè)品種軟棗獼猴桃在不同消化階段TPC的變化趨勢(shì)一致。對(duì)于整果樣品，與未消化階段相比（395.27～526.31 mg/100 g），口腔消化后TPC輕微降低（385.28～505.35 mg/100 g），胃消化后TPC繼續(xù)降低（362.77～483.69 mg/100 g），腸消化階段TPC顯著降低（263.95～391.32 mg/100 g）。游離型酚類提取物體外消化過(guò)程中TPC變化趨勢(shì)與其對(duì)應(yīng)的整果提取物一致：與未消化階段相比（386.44.27～516.89 mg/100 g），口腔消化后TPC輕微降低（373.94～495.50 mg/100 g），胃消化后TPC繼續(xù)降低（357.03～473.52 mg/100 g），腸消化階段TPC顯著降低（232.63～352.90 mg/100 g）。果渣樣品體外消化過(guò)程中TPC變化趨勢(shì)與其對(duì)應(yīng)的整果和游離酚提取物不同：與未消化階段相比（35.61～53.27 mg/100 g），口腔消化后TPC輕微降低（33.12～47.81 mg/100 g），胃消化后TPC升高（38.75～61.84 mg/100 g），腸消化階段TPC繼續(xù)升高（43.68～69.26 mg/100 g），消化后果渣樣品中TPC提高。

圖1 不同樣品中未消化、口腔、胃、腸消化階段TPCFig. 1 TPC of raw and digested samples at in vitro oral, gastric and intestinal digestion stages

在體外模擬消化過(guò)程中，許多物理因素（溫度、pH值、離子強(qiáng)度）和生物因素（膽汁鹽和酶）會(huì)影響酚類化合物的穩(wěn)定性[16-17]。一般情況下，酚類化合物在胃部酸性條件下穩(wěn)定，而且酸性條件有利于酚類化合物從與之結(jié)合的食物基質(zhì)中釋放出來(lái)[18]，例如果渣中與食物中大分子（蛋白質(zhì)、淀粉、膳食纖維和木質(zhì)素）結(jié)合的酚類化合物，在胃消化階段大量釋放，使樣品TPC升高[19-20]；同時(shí)，由于提取、水解、釋放、降解、去糖基化、酯化、氧化和裂解可能在胃階段發(fā)生，胃消化過(guò)程也會(huì)造成一定程度上酚類化合物的損耗[21]。因此，根據(jù)提取物性質(zhì)不同，消化后的酚類化合物含量可能產(chǎn)生增加或減少兩種不同的結(jié)果[22]。多酚對(duì)堿性條件高度敏感，會(huì)轉(zhuǎn)變成具有不同化學(xué)性質(zhì)的結(jié)構(gòu)形式[23]。

體外模擬消化過(guò)程中，軟棗獼猴桃整果、游離酚提取物和果渣3 種樣品TPC均在口腔消化階段輕微下降，這是由于某些酚類化合物部分降解或轉(zhuǎn)化，之前有報(bào)道過(guò)類似結(jié)果[24]。軟棗整果樣品中游離型酚類化合物占絕大部分[25]，因此整果和游離酚提取物樣品體外模擬消化過(guò)程中TPC變化趨勢(shì)一致，即胃消化和腸消化階段持續(xù)降低，且腸消化階段降低更為顯著，與之前報(bào)道的結(jié)果[24]一致。在腸消化階段TPC顯著降低，因?yàn)榇蠖鄶?shù)酚類在pH 7.4條件下不穩(wěn)定[26]，在一些涼茶中也報(bào)道了類似的結(jié)果[27]。整果和游離酚提取物體外模擬消化后，與未消化的樣品相比TPC顯著降低，說(shuō)明多酚在消化過(guò)程中被高度代謝[28]，例如在水解或氧化時(shí)，被轉(zhuǎn)化為與初始化合物完全不同的代謝物，其含量和生物利用度并因此改變[29]。軟棗獼猴桃果渣樣品中的酚類化合物主要以結(jié)合形式存在，胃消化后TPC增加，是由于低pH值（2.0）下破壞了酚類與食物基質(zhì)（蛋白質(zhì)和多糖）的結(jié)合[30]，以及酶促作用和水解作用[31]，促進(jìn)了與膳食纖維或蛋白質(zhì)結(jié)合的酚類化合物的釋放，與先前的研究結(jié)果[32]一致，且低pH值條件下酚類物質(zhì)更穩(wěn)定；腸消化階段TPC略升高，與未消化的樣品相比，果渣提取物經(jīng)過(guò)體外模擬消化后TPC升高，與之前的研究結(jié)果[33]一致。

2.2 酚類單體化合物的鑒定

表1顯示了4個(gè)軟棗獼猴桃品種酚類單體化合物的定性分析結(jié)果，由于果渣中酚類化合物含量較低，整果樣品中大部分為游離型酚類化合物，因此重點(diǎn)對(duì)軟棗獼猴桃游離型酚類提取物在體外模擬消化過(guò)程中含量變化進(jìn)行討論分析。在軟棗獼猴桃游離型酚類提取物中共鑒定出9 種單體物質(zhì)，包括3 種酚酸（即原兒茶酸、咖啡酸和綠原酸）、3 種黃烷醇（原花青素B2、原花青素C1和(+)-沒(méi)食子兒茶素）、3 種黃酮醇（槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷）。部分單體物質(zhì)的MS/MS光譜圖和碎片圖如圖2所示。

表1 UPLC-Q-TOF-MS定性分析軟棗獼猴桃中酚類單體Table 1 Qualitative analysis of phenolic compounds from kiwiberry fruit by UPLC-Q-TOF-MS

圖2 原花青素B2（A）、咖啡酸（B）、綠原酸（C）、原花青素C1（D）、槲皮素-3-O-半乳糖苷（E）、槲皮素-3-O-蕓香糖苷（F）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（G）的離子碎片圖Fig. 2 MS/MS fragmentation patterns of poanthocyanidin B2 (A),caffeic acid (B), chlorogenic acid (C), proanthocyanidin C1 (D), quercetin-3-O-galactoside (E), quercetin-3-O-rutinoside (F) and quercetin-3-O-glucoside (G)

通過(guò)HPLC-PDA-MS測(cè)定的軟棗獼猴桃游離型酚類提取物在體外模擬消化過(guò)程中單體物質(zhì)含量變化如表2所示。4個(gè)品種軟棗獼猴桃游離型酚類提取物中鑒定的單體物質(zhì)在體外模擬消化過(guò)程中呈逐步降低趨勢(shì)，在口腔和胃消化階段沒(méi)有明顯變化，在腸消化階段降低顯著，與TPC變化趨勢(shì)一致。根據(jù)4個(gè)品種單體含量平均值進(jìn)行分析，原兒茶酸：未消化（45.22 μg/g）＞口腔（44.00 μg/g）＞胃（41.11 μg/g）＞腸（32.12 μg/g）；咖啡酸：未消化（40.42 μg/g）＞口腔（ 39.33 μg/g） ＞ 胃 （ 36.74 μg/g） ＞腸（28.71 μg/g）；綠原酸：未消化（38.32 μg/g）＞口腔（37.28 μg/g）＞胃（34.84 μg/g）＞腸（27.22 μg/g）；原花青素B2：未消化（3.00 μg/g）＞口腔（2.92 μg/g）＞胃（2.73 μg/g）＞腸（2.13 μg/g）；原花青素C1：未消化（0.56 μg/g）＞口腔（0.54 μg/g）＞胃（0.51 μg/g）＞腸（0.40 μg/g）；(+)-沒(méi)食子兒茶素：未消化（2.32 μg/g）＞口腔（2.26 μg/g）＞胃（2.11 μg/g）＞腸（1.65 μg/g）；槲皮素-3-O-葡萄糖苷：未消化（0.89 μg/g）＞口腔（0.87 μg/g）＞胃（0.81 μg/g）＞腸（0.63 μg/g）；槲皮素-3-O-蕓香糖苷：未消化（1.86 μg/g）＞口腔（1.81 μg/g）＞胃（1.63 μg/g）＞腸（1.32 μg/g）；槲皮素-3-O-半乳糖苷：未消化（2.62 μg/g）＞口腔（2.55 μg/g）＞胃（2.38 μg/g）＞腸（1.86 μg/g）。

表2 軟棗獼猴桃游離型酚類提取物在體外不同消化階段單體含量Table 2 Compositions of individual phenolics in free phenolic extract of kiwiberry fruit at different stages of in vitro digestion μg/g

續(xù)表2

有報(bào)道表明，由于消化條件復(fù)雜，酚類物質(zhì)經(jīng)攝入后其含量或者活性會(huì)受到影響[34]。根據(jù)Zheng Guiqing等的研究，山楂中酚類化合物可以在體外消化過(guò)程中釋放，特別是兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和綠原酸等[35]。綠原酸在低pH值（pH＜4.5）下穩(wěn)定，在堿性或中性pH值下穩(wěn)定性較差，含量降低[34]，咖啡酸是水果中主要酚類化合物，隨著消化過(guò)程中pH值的升高，穩(wěn)定性降低，含量也相應(yīng)降低[36]。

2.3 軟棗獼猴桃提取物過(guò)氧自由基清除能力

軟棗獼猴桃整果、游離型酚類提取物和果渣樣品在未消化、口腔、胃和腸消化階段的PSC如圖3所示。根據(jù)4個(gè)品種PSC的平均值進(jìn)行分析，整果樣品：未消化（4 475.89 μmol/100 g）＞口腔（4 334.74 μmol/100 g）＞胃（4 102.42 μmol/100 g）＞腸（3 351.87 μmol/100 g）；游離型酚類提取物：未消化（4 194.24 μmol/100 g）＞口腔（4 068.27 μmol/100 g）＞胃（3 748.08 μmol/100 g）＞腸（2 831.08 μmol/100 g）；果渣樣品：腸（355.00 μmol/100 g）＞胃（330.02 μmol/100 g）＞未消化（296.81 μmol/100 g）＞口腔（277.16 μmol/100 g）。

圖3 未消化、口腔、胃、腸消化階段不同樣品的PSCFig. 3 Peroxyl radical scavenging capacity (PSC) of raw samples and digested products at in vitro oral, gastric and intestinal digestion stages

對(duì)于整果和游離型酚類提取物，消化過(guò)程中抗氧化活性持續(xù)降低，表明部分抗氧化劑（主要是酚類化合物）在此階段降解或轉(zhuǎn)化，在柿子果實(shí)[37]和一些巴西本土水果[38]的體外消化實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。對(duì)于果渣樣品，消化過(guò)程有助于釋放與基質(zhì)中其他成分結(jié)合的酚類化合物[39]，而且酚類化合物可能不是果渣提取物中主要的抗氧化劑成分，樣品的抗氧化活性可能會(huì)受到其他抗氧化劑的影響，例如蛋白質(zhì)、維生素、類胡蘿卜素等，這些活性物質(zhì)可以逐漸從食物基質(zhì)中釋放出來(lái)，從而提高樣品的抗氧化能力[40-41]。3 種樣品PSC變化趨勢(shì)均與其對(duì)應(yīng)的TPC一致，許多報(bào)道表明水果和蔬菜的抗體氧化活性主要來(lái)自于酚類化合物，且酚類化合物含量與抗氧化活性之間存在顯著相關(guān)性[42-43]。

2.4 軟棗獼猴桃提取物細(xì)胞抗氧化活性

為了進(jìn)一步探究體外模擬消化后樣品的抗氧化水平，對(duì)消化后軟棗獼猴桃整果、游離型提取物和果渣樣品進(jìn)行細(xì)胞層面的抗氧化活性測(cè)定，但果渣樣品中由于酚類物質(zhì)含量低且大部分以結(jié)合形式存在以至于其CAA無(wú)法檢測(cè)，整果和游離型提取物腸消化階段的CAA如圖4所示。在無(wú)PBS洗滌條件下，通過(guò)CAA分析可確定與細(xì)胞膜結(jié)合的抗氧化劑的活性，并且抗氧化劑會(huì)通過(guò)膜進(jìn)入細(xì)胞。CJ-1整果提取物的CAA最高，其次是HR、LD-241、LD-121。整果的CAA在93.32（LD-121）～223.19 μmol/100 g（CJ-1）的范圍內(nèi)。游離型酚類提取物的CAA范圍與整果基本一致。

圖4 不同樣品在腸消化階段的CAAFig. 4 CAA of whole fruit and free phenolic extract at in vitro intestinal digestion stage

經(jīng)PBS洗滌后，與細(xì)胞膜結(jié)合的抗氧化劑被洗掉，因此CAA分析僅能確定穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的抗氧化劑的活性。整果提取物的CAA范圍為20.42（HR、LD-121）～34.25 μmol/100 g（CJ-1）。CJ-1整果提取物的CAA最高，其次是LD-241、LD-121、HR。CJ-1游離型提取物的CAA最高，其次是LD-241、LD-121、HR。結(jié)果表明，無(wú)論是否用PBS洗滌細(xì)胞，體外模擬消化后軟棗獼猴桃整果和游離型酚類提取物均具有良好的抗氧化能力。

過(guò)量的自由基引起的生物分子（DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)）的氧化損傷與許多慢性疾病有關(guān)，包括心血管疾病、2型糖尿病、肥胖癥和癌癥[44]。軟棗獼猴桃中植物化學(xué)物質(zhì)具有清除自由基的能力可能是軟棗獼猴桃有助于預(yù)防慢性疾病的一種機(jī)制[45]。本研究基于化學(xué)和細(xì)胞兩個(gè)層面評(píng)估了軟棗獼猴桃提取物的抗氧化活性。PSC測(cè)定法被用作基于化學(xué)的方法來(lái)評(píng)估軟棗獼猴桃的抗氧化活性，該方法優(yōu)于先前的鐵離子還原/抗氧化能力和2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力[46]抗氧化檢測(cè)方法，與化學(xué)合成的2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基不同，PSC分析中使用的過(guò)氧自由基是存在于人體中的天然自由基，另外，鐵離子抗氧化能力法測(cè)定在pH 3.6下進(jìn)行，這不符合人體內(nèi)的正常pH值環(huán)境，而PSC測(cè)定條件在與人體內(nèi)一致的中性環(huán)境下（pH 7.4）。用CAA分析法使用HepG2細(xì)胞，從細(xì)胞層面測(cè)定軟棗獼猴桃提取物的抗氧化活性，由于它考慮了生物系統(tǒng)中抗氧化劑化合物的細(xì)胞吸收、分布和代謝，因此已被證明比基于化學(xué)物質(zhì)的抗氧化劑方法有很大的改進(jìn)，更加符合人體實(shí)際情況[47]。

2.5 二元相關(guān)性分析結(jié)果

對(duì)體外模擬消化后整果、游離型酚類提取物、果渣樣品中PSC和CAA之間的二元相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。整果（R2=0.995，P＜0.01）、游離型酚類提取物（R2=0.997，P＜0.01）、果渣（R2=0.935，P＜0.01）的PSC與其對(duì)應(yīng)的TPC極顯著相關(guān)。整果（R2=0.969，P＜0.01）、游離型酚類提取物（R2=0.981，P＜0.01）的CAA（無(wú)PBS洗滌）與其對(duì)應(yīng)的TPC之間也呈現(xiàn)出極顯著的相關(guān)性。

圖5 整果TPC與PSC（A）、游離型酚類提取物TPC與PSC（B）、果渣TPC與PSC（C）、整果TPC與無(wú)PBS洗滌CAA（D）、游離型酚類提取物TPC與無(wú)PBS洗滌CAA（E）之間的相關(guān)性Fig. 5 Correlation between PSC and TPC of kiwiberry fruit (A),between PSC and TPC of free phenolic extract (B), between PSC and TPC of pomace (C), between CAA without PBS wash and TPC of kiwiberry fruit (D), and between CAA without PBS wash and TPC of free phenolic extract (E)

3 結(jié) 論

軟棗獼猴桃整果樣品以游離型酚類化合物為主，果渣樣品以結(jié)合型酚類化合物為主。軟棗獼猴桃中游離型酚類化合物在模擬消化過(guò)程中持續(xù)發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化，但胃消化階段比腸消化階段穩(wěn)定，降解相對(duì)較少。同時(shí)，果渣中結(jié)合型酚類化合物在胃腸道環(huán)境的作用下逐漸釋放，消化結(jié)束后酚類化合物含量提高。酚類作為軟棗獼猴桃中主要活性物質(zhì)，其含量對(duì)抗氧化活性產(chǎn)生重要影響。該研究從模擬人體胃腸道消化角度對(duì)軟棗獼猴桃酚類提取物中的酚類物質(zhì)及其抗氧化性進(jìn)行了全面系統(tǒng)的評(píng)估，為軟棗獼猴桃天然產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。