右美托咪定緩解TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠炎癥介質(zhì)的分泌和NLRP3 炎癥小體的活化①

莊淵釗 顏景佳 謝文欽 謝文吉 王一雄

（福建省泉州市第一醫(yī)院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院麻醉科，泉州 362000）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種彌漫性炎癥疾病，臨床表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉及血便等，還可能伴有發(fā)熱、體重減輕等全身癥狀，具有明顯慢性疾病特點(diǎn)——疾病復(fù)發(fā)和緩解頻繁交替，嚴(yán)重可能危及肝臟、皮膚、視覺(jué)等器官［1-2］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期存在廣泛病變的潰瘍性結(jié)腸炎患者，具有較高的結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［3］。目前，對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎的病因尚未明確，可能是遺傳、環(huán)境及免疫等多因素相互作用引起的［4］。臨床常用氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑等藥物治療，但整體療效不甚理想［5］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一種α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，是臨床上常用的麻醉藥物。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Dex 具有抗炎作用，對(duì)多種器官炎癥損傷有保護(hù)作用［6-7］。GUL 等［8］研究顯示，Dex 對(duì)炎癥性腸病有較好的改善作用。NLRP3 炎癥小體具有強(qiáng)大的促炎作用，參與固有免疫調(diào)節(jié)。據(jù)報(bào)道，NLRP3 炎癥小體參與炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展［9］。因此，本研究通過(guò)觀察不同劑量Dex 對(duì)2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸組織、炎癥介質(zhì)分泌和NLRP3 炎癥小體活化的影響，旨在探究Dex 在潰瘍性結(jié)腸炎中的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源 55 只SPF 級(jí)健康Wistar 雄性大鼠，6～8周齡，體重200～240 g，購(gòu)于南京君科生物工程有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2019-0004。

1.1.2 藥品與試劑 鹽酸右美托咪定注射液購(gòu)于宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20183390，規(guī)格2 ml∶200 μg；TNBS購(gòu)于美國(guó)Sigma；TUNEL 試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物；ELISA 試劑盒購(gòu)于武漢華聯(lián)科生物；髓過(guò)氧化物酶（MPO）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物；蛋白抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling；引物由上海碧云天生物合成。

1.1.3 儀器 光學(xué)顯微鏡（CX-31 型，日本Olympus）；酶標(biāo)儀（RT-2100C，美國(guó)RAYTO）；實(shí)時(shí)熒光PCR儀（Lightcycler 480，瑞士Roche）。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)腸炎大鼠模型的制備［10］采用TNBS/乙醇復(fù)合法制備結(jié)腸炎大鼠模型，具體操作如下：提前配制5%TNBS/乙醇復(fù)合液備用，禁食12 h 后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取塑料軟管從大鼠肛門(mén)插入至結(jié)腸（約8 cm 處），注入5%TNBS/乙醇復(fù)合液0.8 ml，再將大鼠倒置15 min 后放回。模型大鼠在造模第2 天開(kāi)始出現(xiàn)黏液膿血便，隨機(jī)挑選3只模型大鼠，處死后剖取結(jié)腸組織，肉眼可見(jiàn)炎性損傷和潰瘍，并做病理檢查驗(yàn)證模型制備成功。

1.2.2 分組與處理 55 只Wistar 大鼠隨機(jī)挑選10 只作健康對(duì)照組（Control），剩余大鼠采用TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠模型，Control 組注入等量生理鹽水。待模型穩(wěn)定1 周后，將模型大鼠隨機(jī)分為模型組和Dex 低、中、高劑量加藥組，每組10 只。Dex 加藥組腹腔分別注射12.5、25、50 μg/kg Dex，健康對(duì)照組和模型組以生理鹽水替代［11］。

1.2.3 大鼠大體觀察和樣本采集 記錄大鼠建模后精神狀態(tài)、毛發(fā)、進(jìn)食、體重及大便等情況，給藥7 d后，禁食24 h，注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，2 000 r/min 離心10 min，取上層血清，并解剖距肛門(mén)8 cm處結(jié)腸組織，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 疾病活動(dòng)指數(shù)的計(jì)算［12］根據(jù)大鼠體重變化、大便性狀和便血情況，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（DAI），DAI=（體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）/3。其中體重改變?yōu)? 記0 分，下降1%～5%記1分，下降5%～10%記2分，下降10%～15%記3分，下降＞15%記4分；大便正常記0分，大便松散記2分，稀便記4分；無(wú)隱血或血便記0分，潛血陽(yáng)性記2分，肉眼血便記4分。

1.2.5 結(jié)腸組織病理觀察及評(píng)分［13］取結(jié)腸組織，沿腸系膜縱向剪開(kāi)，向上展開(kāi)黏膜，觀察黏連、潰瘍形成及炎癥情況，計(jì)算結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評(píng)分（CMDI），其中無(wú)黏連記0 分，輕度記1 分，重度記2 分；無(wú)潰瘍形成及炎癥記0 分，局部充血但無(wú)潰瘍記1分，1處潰瘍不伴充血或腸壁增厚記2分，1處潰瘍伴炎癥記3分，CMDI評(píng)分為各項(xiàng)得分總和的1/2。取損傷明顯處結(jié)腸組織制成石蠟切片，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察病理?yè)p傷變化，并根據(jù)炎癥嚴(yán)重程度、炎癥深度及隱窩損害，進(jìn)行結(jié)腸組織學(xué)損傷評(píng)分（HS）。其中無(wú)炎癥記0分，輕度記1分，中度記2 分，重度記3 分；炎癥未浸潤(rùn)記0 分，浸潤(rùn)至黏膜記1 分，浸潤(rùn)至黏膜和黏膜下層記2 分，浸潤(rùn)全層記3 分；無(wú)隱窩損害記0 分，基底1/3 損壞記1 分，基底2/3 損壞記2 分，整個(gè)隱窩消失記3 分，HS 評(píng)分為各項(xiàng)得分總和的1/3。

1.2.6 TUNEL 染色觀察結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡 取結(jié)腸組織制成石蠟切片，脫蠟后水化，加入蛋白酶K溶液去除組織蛋白，加入含有2%過(guò)氧化氫的緩沖液，室溫反應(yīng)5 min，再滴加TdT 酶緩沖液，室溫反應(yīng)3 min，滴加TdT 酶反應(yīng)液，37℃反應(yīng)1 h，然后加入預(yù)熱到37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，37℃反應(yīng)30 min，再滴加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，室溫反應(yīng)30 min，最后進(jìn)行DAB 染色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明后封片。陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核中有棕黃色顆粒，光鏡下隨機(jī)挑選200倍視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

1.2.7 ELISA 檢測(cè)血清炎癥因子含量 取血清樣本解凍，放至室溫后，參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)大鼠血清促炎因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、TNF-α、IL-6和抗炎因子IL-4、IL-10的含量。

1.2.8 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)腸組織中炎癥因子mRNA水平 取冰凍結(jié)腸組織，加入適量液氮研磨，再加入Trizol 溶液提取總RNA，溶解于DEPC 水中，檢測(cè)其純度、濃度和完整度，選用電泳條帶完整、A260/A280為1.80～2.00 的樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取2 μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增條件為：94℃35 s，57.5℃45 s，72℃45 s，共38 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算炎癥因子iNOS和IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9 比色法檢測(cè)結(jié)腸組織MPO 活性 取冰凍結(jié)腸組織，加入9 倍生理鹽水冰上勻漿，3 000 r/min離心10 min，參照試劑盒（比色法）說(shuō)明操作，檢測(cè)結(jié)腸組織中MPO活性。

1.2.10 Western blot 檢測(cè)結(jié)腸組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 取冰凍結(jié)腸組織，加入適量液氮研磨，再加入細(xì)胞裂解液收集總蛋白，取潔凈玻璃板配制10%SDS-PAGE 凝膠，每孔加入50 μg 蛋白樣本，恒壓110 V 下進(jìn)行電泳，再將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜，恒流300 mA下電轉(zhuǎn)90 min，應(yīng)用含有5%脫脂奶粉的緩沖液浸泡電轉(zhuǎn)膜，室溫下孵育1 h，添加蛋白一抗，其中半胱天冬酶3（Caspase-3，1∶1 000）、經(jīng)切割 的Caspase-3（cleaved cas3，1∶1 000）、Caspase-9（1∶1 500）、cleaved cas9（1∶1 500）、NLRP3（1∶1 000）、耦聯(lián)接頭蛋白ASC（1∶500）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（1∶1 000）、內(nèi)參GAPDH（1∶1 000）置于搖床中4℃放置過(guò)夜，次日添加HRP標(biāo)記的蛋白二抗（1∶10 000）室溫孵育30 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠體重的影響 如圖1，對(duì)照組大鼠體重隨著時(shí)間的推移，均呈持續(xù)增加趨勢(shì)，但模型組和Dex 加藥組建模后體重呈先下降再緩慢升高的變化趨勢(shì)，至給藥結(jié)束時(shí)，體重由輕到重依次為模型組、低、中、高劑量Dex加藥組、健康對(duì)照組。

圖1 各組大鼠體重的變化Fig.1 Changes in weight of rats in each group

2.2 對(duì)結(jié)腸組織病理學(xué)的影響 如圖2，健康對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織中肌層結(jié)構(gòu)完整，上皮絨毛組織正常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組上皮絨毛組織結(jié)構(gòu)失常，腸黏膜內(nèi)細(xì)胞排列紊亂，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組相比，中、高劑量Dex加藥組黏膜潰瘍病變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度有明顯改善。與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠DAI、CMDI 和HS 評(píng)分均升高（P＜0.05）；與模型組相比，中、高劑量Dex加藥組上述評(píng)分均降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖2 光鏡下結(jié)腸組織病理學(xué)形態(tài)（HE，×200）Fig.2 Pathological morphology of colon tissues under light microscope（HE，×200）

表1 Dex對(duì)大鼠DAI、CMDI和HS評(píng)分的影響（）Tab.1 Effects of Dex on DAI，CMDI and HS scores（）

表1 Dex對(duì)大鼠DAI、CMDI和HS評(píng)分的影響（）Tab.1 Effects of Dex on DAI，CMDI and HS scores（）

Note：Compared with healthy control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

2.3 對(duì)結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡的影響 如圖3，與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中凋亡細(xì)胞率明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，中、高劑量Dex 加藥組凋亡細(xì)胞率明顯降低（P＜0.05）。

圖3 Dex對(duì)大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of Dex on apoptosis of colon tissues of rats

2.4 對(duì)結(jié)腸組織中凋亡標(biāo)志物表達(dá)的影響 如圖4，與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中cleaved cas3/Caspase-3 和cleaved cas9/Caspase-9 水平上調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，中、高劑量Dex 加藥組上述蛋白水平下調(diào)（P＜0.05）。

圖4 Dex對(duì)大鼠結(jié)腸組織中凋亡標(biāo)志物表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Dex on expressions of apoptosis markers in colon tissues of rats

2.5 對(duì)大鼠炎癥因子水平和結(jié)腸組織MPO 活性的影響 與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠血清TNF-α、iNOS、IL-6、IL-10、IL-4和結(jié)腸組織iNOS、IL-10 mRNA、MPO 水平均升高（P＜0.05）；與模型組相比，中、高劑量Dex 加藥組血清TNF-α、iNOS、IL-6 和結(jié)腸組織iNOS mRNA 和MPO 水平降低，血清IL-10、IL-4 和結(jié)腸組織IL-10 mRNA 水平升高（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖5。

表2 Dex對(duì)大鼠血清炎癥因子水平和結(jié)腸組織MPO活性的影響（）Tab.2 Effects of Dex on levels of serum inflammatory factors and MPO activity in colon tissues of rats（）

表2 Dex對(duì)大鼠血清炎癥因子水平和結(jié)腸組織MPO活性的影響（）Tab.2 Effects of Dex on levels of serum inflammatory factors and MPO activity in colon tissues of rats（）

圖5 Dex對(duì)大鼠結(jié)腸組織中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Dex on expressions of inflammatory factors mRNA in colon tissues of rats

2.6 對(duì)NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)的影響 如圖6，與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、ASC、IL-1β及IL-18蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，中、高劑量Dex加藥組上述蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。

圖6 Dex 對(duì)大鼠結(jié)腸組織中NLRP3 炎癥小體蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of Dex on expressions of NLRP3 inflammasome proteins in colon tissues of rats

3 討論

隨著對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎病因病機(jī)研究的不斷深入，普遍認(rèn)為其病因?yàn)槟c道菌群與黏膜免疫系統(tǒng)的失衡［14］。黏膜免疫系統(tǒng)是固有免疫的重要部分，屬于免疫系統(tǒng)識(shí)別自我非我的第一道防線，主要通過(guò)細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體識(shí)別內(nèi)外環(huán)境中的各種刺激，以保證細(xì)胞環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。近年來(lái)，炎癥調(diào)節(jié)通路在炎癥相關(guān)疾病中的調(diào)控作用成為研究熱點(diǎn)，如MAPK、NF-κB 通路等［15］。炎癥小體是這些固有免疫調(diào)節(jié)通路的中心環(huán)節(jié)，由多種蛋白組合形成功能復(fù)合體，參與炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展［16］。各種模式識(shí)別受體都具有一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)域，可感受多種刺激分子，形成炎癥小體，進(jìn)一步激活MAPK、NFκB 通路促進(jìn)炎癥小體自身組分及前炎癥因子的分泌與活化，發(fā)揮促炎及抗炎作用。

NLRP3 是目前研究最為廣泛的炎癥小體，主要由NLRP3、ASC 及pro-caspase-1 組成，效應(yīng)過(guò)程中會(huì)激活下游 分子IL-1β 和IL-18 進(jìn)行炎癥調(diào)節(jié)［17］。LING 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3、ASC 及caspase-1 缺陷的小鼠在結(jié)腸炎中有保護(hù)作用。臨床數(shù)據(jù)也顯示，NLRP3 基因與結(jié)腸炎的易感性密切相關(guān)［19］。這些研究說(shuō)明，NLRP3 炎癥小體在結(jié)腸的形成過(guò)程發(fā)揮促炎作用。現(xiàn)有構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的方法較多，其中以TNBS/乙醇復(fù)合誘導(dǎo)法最常用，其主要致病機(jī)制為乙醇破壞腸黏膜屏障，TNBS浸潤(rùn)至結(jié)腸組織結(jié)合高分子物質(zhì)，引起黏膜免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，符合潰瘍性結(jié)腸炎從急性期到慢性期的長(zhǎng)期炎癥演變過(guò)程［20］。MPO 主要存在于中性粒細(xì)胞，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)TNBS/乙醇復(fù)合誘導(dǎo)大鼠后，大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸黏膜大體形態(tài)和組織病理學(xué)評(píng)分明顯增加，結(jié)腸組織中MPO 活性增加，NLRP3 炎癥小體各組分表達(dá)及炎癥因子水平上調(diào)，結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡率顯著升高，與既往研究結(jié)果相符［21］，提示結(jié)腸炎大鼠模型制備成功。

Dex 是臨床理想的靜脈麻醉藥物，近年研究發(fā)現(xiàn)，Dex 對(duì)于感染、休克及缺血再灌注等引起的炎癥反應(yīng)均具有抗炎作用，但Dex 抗炎作用研究仍處于初級(jí)階段［22］。張夢(mèng)婕等［23］研究顯示，腹腔注射Dex可減輕大鼠腹腔黏液，可能與激活膽堿能抗炎通路，減輕全身炎癥反應(yīng)有關(guān)。QIU 等［24］應(yīng)用脂多糖刺激BV2 細(xì)胞建立神經(jīng)炎癥模型，發(fā)現(xiàn)Dex 預(yù)處理可介導(dǎo)MAPK/ERK 通路發(fā)揮抗炎作用。但Dex 在結(jié)腸炎中的抗炎機(jī)制尚不完全明確。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量Dex干預(yù)后一定程度上緩解了結(jié)腸炎的發(fā)展，結(jié)腸組織中MPO 活性、NLRP3 炎癥小體成分及TNF-α、iNOS、IL-6、IL-1β 及IL-18 等強(qiáng)效促炎因子水平下調(diào)，抗炎因子IL-10 和IL-4 水平上調(diào)，提示中、高劑量Dex 可抑制NLRP3 炎癥小體活化，調(diào)節(jié)其下游相關(guān)炎癥因子水平，減少浸潤(rùn)至結(jié)腸組織中的炎癥細(xì)胞，從而緩解TNBS 誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎。炎癥反應(yīng)引起的細(xì)胞損傷積累到一定程度會(huì)導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡，其中細(xì)胞凋亡是最為經(jīng)典的形式，主要依賴caspase 家族蛋白的調(diào)控，其中Caspase-3 是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，Caspase-9 是凋亡信號(hào)的起始者，外界刺激下經(jīng)切割的Caspase-9 將對(duì)執(zhí)行者Caspase-3 進(jìn)行切割并使之激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TUNEL 染色證實(shí)，結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞有凋亡加速的現(xiàn)象，經(jīng)Dex 干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率下降，表明Dex可延緩結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡，可能與抑制凋亡標(biāo)志物Caspase-3、Caspase-9的活化有關(guān)。這與YANG 等［25］報(bào)道Dex 可下調(diào)Caspase-3水平抑制急性肝損傷的作用相似。

綜上所述，本研究首次提出Dex 可能抑制NLRP3 炎癥小體的活化，阻滯炎癥介質(zhì)的分泌，從而緩解TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。但這只是Dex 治療結(jié)腸炎的初步機(jī)制探索，其詳細(xì)作用靶點(diǎn)還有待深入分析。另外，在不同時(shí)期、不同嚴(yán)重程度的結(jié)腸炎模型中，NLRP3 炎癥小體的詳細(xì)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。