■孔祎頔 李 民 吳雪芹 尹 壯 單曉楓 王桂芹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118）

烏鱧（Channa argus）屬鱸形目、鱧科、鱧屬，是一類有胃的肉食性魚類，在我國分布范圍廣泛，是我國北方名特優(yōu)魚類，是國家“十三五”漁業(yè)規(guī)劃重點(diǎn)發(fā)展魚類，具有抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價值高等諸多優(yōu)點(diǎn)，得到了養(yǎng)殖者廣泛喜愛。近年來，隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，水體環(huán)境逐漸惡化，養(yǎng)殖者為了滿足市場需求，錯誤地投喂高糖高脂飼料，又常常因儲存方式不當(dāng)導(dǎo)致飼料發(fā)生霉變及氧化酸敗，將這樣的飼料投喂給魚類，直接影響了它們健康，引發(fā)各類魚病，在烏鱧的養(yǎng)殖過程中最常見的疾病就是脂肪肝、肝膽綜合征等。于是，養(yǎng)殖者開始大量使用化學(xué)藥物或抗生素藥物進(jìn)行治療，然而，抗生素的濫用不僅會導(dǎo)致水體藥物殘留，影響水產(chǎn)品安全及人類健康，阻礙烏鱧的綠色養(yǎng)殖，還會導(dǎo)致耐藥菌株日益增多，破壞魚類機(jī)體內(nèi)微生態(tài)平衡。隨著飼料無抗時代的到來，尋求有效的替抗添加劑尤為重要，當(dāng)下具有潛力的包括中草藥、植物提取物及益生菌等。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作為一類FAO公認(rèn)的益生菌，是由發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性菌，是水產(chǎn)動物腸道中的固有菌群之一，同時也是《飼料添加劑品種目錄（2013）》中允許添加的菌種。LAB具有降脂、抑制有害菌、維持腸道菌群平衡以及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等諸多優(yōu)點(diǎn)。因此，功能性LAB的篩選成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)之一，對研究水產(chǎn)動物的疾病有重要意義。目前，已從多種水產(chǎn)動物的腸道中篩選出了LAB，例如：尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、鯉（Cirrhinus mrigala）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）等。本研究選取烏鱧為研究對象，探討在飼料中添加從健康烏鱧腸道內(nèi)容物中篩選出的乳酸乳球菌L19最適添加量對烏鱧生長和免疫功能的影響，為烏鱧的健康養(yǎng)殖及LAB在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及飼料

乳酸乳球菌L19（GenBank: MT102745.1）從健康烏鱧腸道內(nèi)容物中篩選獲得并由本實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)烏鱧購自山東臨沂某養(yǎng)殖場，試驗(yàn)前暫養(yǎng)于塑料水族箱中，暫養(yǎng)期間投喂基礎(chǔ)飼料，馴化14 d?；A(chǔ)飼料以魚粉為蛋白源，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0（對照組）、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109、1.0×1010CFU/gL. lactisL19，配制成6種等氮等脂的試驗(yàn)飼料（見表2）。飼料原料經(jīng)充分粉碎后、稱重、混均、擠壓成直徑為1.5 mm的顆粒，將菌懸液均勻噴灑于基礎(chǔ)飼料中制成L. lactisL19 終含量分別為1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109、1.0×1010CFU/g的飼料，基礎(chǔ)飼料噴灑與菌懸液等體積的PBS溶液作為對照組飼料，在25 ℃空調(diào)房晾干，每3 d準(zhǔn)備一批新的飼料，保存在4 ℃的單獨(dú)密封的塑料容器中，以保持LAB的活性，每天檢測制備的飼料中LAB活性。

表1 試驗(yàn)飼料配方及其營養(yǎng)水平（%干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

暫養(yǎng)結(jié)束后，選取540 尾體質(zhì)健康、大小一致的烏鱧，初始體質(zhì)量為（8.68±0.22）g，隨機(jī)分配到18 個塑料水族箱中，分成6 個處理組，每處理3 重復(fù)，每重復(fù)30尾魚。每天09：00、16：00飽食投喂2次，飼養(yǎng)8周，溫度（26±2）℃，pH（7.5±0.1），氨氮＜0.5 mg/L，亞硝酸鹽＜0.05 mg/L，溶解氧＞7.0 mg/L。

1.3 樣品收集

飼養(yǎng)8周，禁食24 h，計(jì)數(shù)并稱重；每桶隨機(jī)取10尾魚，用100 mg/L MS-222 麻醉，尾靜脈采血，4 ℃靜置12 h，4 000 r/min離心15 min收集血清，-20 ℃保存待測。在冰上快速收集肝臟和腸道，在液氮中快速冷凍，-80 ℃保存待測。

1.4 生長指標(biāo)測定

平均增重率（WG，%）=100×（Wt-W0）/W0

特定生長率（SGR，%/d）=100×（lnWt-lnW0）/t

飼料效率（FER，%）=100×（Wt-W0）/I

蛋白質(zhì)效率（PER）=（Wt-W0）/（I×C）

成活率（SR，%）=100×（試驗(yàn)?zāi)┐婊铘~總數(shù)/試驗(yàn)初存活魚總數(shù)）

式中：I——攝入飼料的重量（g）；

t——試驗(yàn)時間（d）；

W0、Wt——試驗(yàn)初始和結(jié)束時烏鱧的體質(zhì)量（g）；

C——飼料蛋白質(zhì)的含量（%）。

1.5 免疫及抗氧化相關(guān)酶測定

血清中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）活性及免疫球蛋白M（IgM）、補(bǔ)體3（C3）、補(bǔ)體4（C4）含量，肝臟和腸道中總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量，均參考Liu 等和Guo 等的方法通過南京建成研究所試劑盒測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s多重比較法進(jìn)行組間多重比較，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. lactis L19 對烏鱧生長和飼料利用的影響（見表3）

表3 乳酸乳球菌L19對烏鱧生長和飼料利用的影響

由表3可知，8周的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，L. lactisL19添加量分別為1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g 和1.0×1010CFU/g 組烏鱧的終末體質(zhì)量、增重率、特定生長率、飼料效率及蛋白質(zhì)效率均顯著高于對照組（P＜0.05），但上述的試驗(yàn)組間的差異不顯著（P＞0.05）。其中，L. lactisL19添加量為1.0×108CFU/g 組達(dá)到最高。與對照組相比，L. lactisL19添加量為1.0×106CFU/g組的這些指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 L. lactis L19對烏鱧免疫功能的影響（見圖1）

由圖1A、B可知，8周的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，L. lactisL19 添加量分別為1.0×108、1.0×109CFU/g 和1.0×1010CFU/g 組烏鱧血清中的IgM 和C4 含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。與對照組相比，L. lactisL19添加量分別為1.0×106CFU/g和1.0×107CFU/g組烏鱧血清中的IgM 和C4 含量有升高趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。由圖1C、D、E 和F 可知，8 周的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，除L. lactisL19 添加量為1.0×106CFU/g 組烏鱧血清中的ACP、AKP 和LZM 活性及C3 含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），其余各添加組均顯著高于對照組（P＜0.05），其中，L. lactisL19添加量為1.0×108CFU/g組達(dá)到最高。

圖1 乳酸乳球菌L19對烏鱧血清非特性免疫指標(biāo)的影響

2.3 L. lactis L19對烏鱧抗氧化能力的影響（見圖2）

由圖2A 可知，8 周的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，L. lactisL19添加量分別為1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g和1.0×1010CFU/g組烏鱧肝臟和腸道中的SOD活性均顯著高于對照組（P＜0.05），其中，L. lactisL19 添加量為1.0×108CFU/g 組達(dá)到最高。由圖2B 可知，L. lactisL19 添加量分別1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g 和1.0×1010CFU/g 組烏鱧肝臟中的CAT活性均顯著高于對照組（P＜0.05）；L. lactisL19 添加量分別1.0×108、1.0×109CFU/g和1.0×1010CFU/g組烏鱧腸道中的CAT活性顯著高于對照組（P＜0.05）。由圖2C 可知，在肝臟中，除L. lactisL19 添加量為1.0×106CFU/g 組烏鱧的GSH-Px 活性與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），其余各添加組均顯著高于對照組（P＜0.05）；在腸道中，1.0×106CFU/g 組和1.0×1010CFU/g 組的GSH-Px活性與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），1.0×107、1.0×108CFU/g 組和1.0×109CFU/g 組顯著高于對照組（P＜0.05）。相反地，由圖2D 可知，所有添加L. lactisL19組烏鱧肝臟中的MDA含量均顯著低于對照組（P＜0.05），其中，L. lactisL19 添加量為1.0×108CFU/g 組達(dá)到最低，L. lactisL19 添加量為1.0×109CFU/g 和1.0×1010CFU/g 組有逐漸回升的趨勢。在腸道中，除L. lactisL19 添加量為1.0×106CFU/g 組的烏鱧MDA含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），其余各添加組均顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖2 乳酸乳球菌L19對烏鱧肝臟和腸道抗氧化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 L. lactis L19對烏鱧生長、飼料利用的影響

在飼料中適量添加L. lactis，可有效促進(jìn)動物生長、飼料利用和蛋白質(zhì)合成。研究報道，添加LAB 可以顯著提高鯉（Cyprinus carpio）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、真鯛（Pagrus major）、太平洋紅鯛（Lutjanus peru）、羅非魚（Oreochromis spp.）、駝背鱸（Cromileptes altivelis）等的生長性能。在本研究中，飼料中L. lactisL19 添加量分別為1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g 和1.0×1010CFU/g時，烏鱧FBW、WG、FER、SGR和PER均顯著提高，比對照組和1.0×106CFU/g效果顯著，說明飼料中添加適量濃度的L. lactisL19能有效提高飼料蛋白質(zhì)利用率，從而促進(jìn)烏鱧的生長。與我們的研究結(jié)果一致，飼料中L. lactisHNL12添加濃度為1.0×108CFU/g和1.0×1010CFU/g時比對照組和1.0×106CFU/g組效果顯著，均能顯著提高駝背鱸的FBW、WG 和SGR。同樣，在飼料中添加1.0×108CFU/gL. lactis subsp. lactis JCM5805，飼喂給羅非魚6 周后顯著提高了FBW、WG和FER。以上結(jié)果均表明，飼料中添加適量的L. lactis能夠提高魚類的生長性能，但所添加的適宜濃度因魚種類、大小以及L.lactis菌株的不同而不同。

3.2 L. lactis L19對烏鱧免疫功能的影響

LAB作為典型的益生菌之一，是水產(chǎn)動物腸道中固有的菌群之一，能夠黏附在水產(chǎn)動物腸道表面，具有良好的抑制病原菌和增強(qiáng)機(jī)體免疫的能力。LAB可刺激造血功能，從而提高魚類的體液免疫。IgM、C3、C4、ACP、AKP和LZM是體液免疫系統(tǒng)的主要組成成分，在體液免疫中起關(guān)鍵作用，是評價魚類免疫功能的常見指標(biāo)。在本研究中，飼料中L. lactisL19 添加量為1.0×108、1.0×109CFU/g和1.0×1010CFU/g時，烏鱧血清中IgM 和C4 含量均顯著升高，比對照組、1.0×106CFU/g 組和1.0×107CFU/g 組效果顯著，當(dāng)飼料中L. lactisL19添加量為1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g和1.0×1010CFU/g時，烏鱧血清中的ACP、AKP和LZM活性及C3含量均顯著升高，比對照組和1.0×106CFU/g組效果顯著，且添加濃度為1.0×108CFU/g 組烏鱧表現(xiàn)出最好的免疫水平。與本研究結(jié)果相似，在飼料中添加1.0×107CFU/g 的德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii），飼喂黃河鯉8周后，ACP和LZM活性顯著增加。同樣，在飼料中添加1.0×106CFU/g沙克乳酸桿菌（Lactobacillus sakei），飼喂太平洋紅鯛6 周后，IgM 含量和LZM 活性顯著升高。此外，在飼料中添加1.0×1010CFU/g 的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）VSG3，飼喂南亞黑鯪60 d 后，IgM 含量及ACP 和LZM活性均顯著升高。在硬骨魚飼料中添加不同種屬LAB 的適宜添加量可能略有不同，推測原因可能是LAB菌種、飼料配方及其他環(huán)境因素等條件的不同。

3.3 L. lactis L19對烏鱧抗氧化能力影響

通常SOD、CAT、GSH-Px 和MDA 是檢測水產(chǎn)動物抗氧化能力的重要指標(biāo)。在本研究中，飼料中L.lactisL19 添加量分別為1.0×107、1.0×108CFU/g 和1.0×109CFU/g 時，烏鱧肝臟和腸道中SOD、GSH-Px及肝臟中的CAT 活性均顯著升高，比對照組和1.0×106CFU/g 組效果顯著，而MDA 則呈現(xiàn)相反的趨勢。在黃河鯉的研究中觀察到相似的結(jié)果，將添加1.0×107CFU/g德氏乳桿菌的飼料投喂黃河鯉8周后，肝臟中的SOD、CAT 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低。與本研究結(jié)果一致，將添加1.0×106CFU/g 沙克乳酸桿菌的飼料投喂太平洋紅鯛6周后，顯著增加了血清中的SOD和CAT活性。以上結(jié)果均表明，在飼料中添加適宜濃度的LAB 菌株可以有效清除魚體內(nèi)過多的自由基，增強(qiáng)魚類的抗氧化能力。

當(dāng)下，人們越來越重視水產(chǎn)品安全及水體環(huán)境等問題，細(xì)菌性疾病的暴發(fā)就成了困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖人員的難題之一，而益生菌、抗菌肽及中草藥制劑的研發(fā)成為了防控水產(chǎn)病害的新方法，能在一定程度上提高魚體健康。本試驗(yàn)結(jié)果為烏鱧健康養(yǎng)殖以及深入探討LAB對水產(chǎn)動物的益生作用奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

綜上所述，飼料中適量添加L. lactisL19 在一定程度上可有效促進(jìn)烏鱧生長、飼料利用，提高免疫功能和抗氧化能力。在本試驗(yàn)條件下，烏鱧飼料中L.lactisL19的適宜添加量為1.0×108CFU/g。