■吳建軍 劉 偉 邱 權(quán) 周 櫻 付大波 徐 麗

（1.武漢新華揚生物股份有限公司，湖北武漢 430074；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北武漢 430223）

脂肪在魚類生命代謝過程中具有多種生理作用，除了為魚類生長發(fā)育提供能量和必需脂肪酸、作為組織細胞的組成外，還有助于脂溶性維生素的吸收和在體內(nèi)的運輸、節(jié)省飼料蛋白質(zhì)，是魚類必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一[1]。但脂肪含量過高或過低，都會影響魚類的正常生長。飼料中脂肪含量不足或缺乏可導致魚體代謝紊亂、飼料蛋白質(zhì)利用率下降，還可并發(fā)脂溶性維生素和必需脂肪酸缺乏癥[2-3]。飼料中脂肪含量過高又會導致魚體脂肪沉積過多，造成魚體抗病力下降[4]。在當前的商品飼料生產(chǎn)過程中，為了促進養(yǎng)殖魚類的快速生長，飼料中的油脂添加量有逐漸增加的趨勢，這不僅增加了飼料的配方成本，而且還增加了養(yǎng)殖魚類脂肪肝等問題的發(fā)生[5-7]，因此，如何有效提高魚類對飼料中脂肪的利用率，減少脂肪在肝臟的積累，避免脂肪肝等疾病的發(fā)生已成為水產(chǎn)飼料研究與開發(fā)中首要關(guān)注問題。

脂肪酶和乳化劑是能夠促進飼料脂肪消化、吸收的兩種添加劑，已經(jīng)被廣泛應用于畜禽飼料中，并取得了較好的應用效果[8]。相關(guān)的研究也表明，在飼料中添加脂肪酶或乳化劑，對于提高脂肪的利用效率、減少油脂的添加量和促進肝臟脂肪代謝是有利的[9-11]。但是，關(guān)于脂肪酶和乳化劑對水產(chǎn)飼料中脂肪節(jié)約效應以及對養(yǎng)殖魚類肝臟健康的影響方面的研究尚不多見，因此本研究擬通過補充外源性的乳化劑和脂肪酶來提高羅非魚對飼料中脂肪的消化吸收率，從而降低飼料中油脂的添加水平，以達到降低飼料成本和解決當前飼料脂肪水平過高引起脂肪消化吸收不暢的問題。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料與試驗設計

試驗用脂肪酶LP100（酶活為10 000 U/g）和乳化劑分別由武漢新華揚生物股份有限公司和湖北華揚科技有限公司提供。

以魚粉、豆粕、菜粕、棉粕、小麥和米糠等為原料配制4 組飼料。HL、LL 組分別為高脂組、低脂組，HLEE、LLEE組分別為高脂+脂肪酶+乳化劑組、低脂+脂肪酶+乳化劑組。原料粉碎后過60目篩，按配方準確稱量各種飼料原料，微量組分采用逐級擴大法混合，混合均勻后用小型環(huán)模顆粒機壓制成粒徑為2.0 mm的顆粒飼料，風干后用封口袋包裝置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩ｏ暳铣煞址治鰠⒄誂OAC（2020）的方法[12]，即水分含量采用105 ℃常壓干燥法測定，粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測定。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎，g/kg）

1.2 試驗過程

養(yǎng)殖試驗在中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所（武漢）室內(nèi)試驗基地進行。吉富羅非魚（Genetic improvement of farmed tilapia, GIFT）由中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所飼料室提供。試驗前先將試驗魚用高錳酸鉀溶液浸泡消毒后，置暫養(yǎng)池暫養(yǎng)2周，投喂商品飼料以適應養(yǎng)殖環(huán)境。待試驗魚馴養(yǎng)穩(wěn)定后，挑選大小一致、鱗片完整的健康魚[平均體重為（40.55±0.14）g]360 尾，放入1 套循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的12 個養(yǎng)殖桶中（有效容積100 L），隨機分成4組，每組設3 個重復，每個重復30 尾魚。試驗期56 d，采用循環(huán)水控溫養(yǎng)魚，24 h充氣增氧，水溫控制在（25±2）℃，pH控制在7.5～8.5，氨氮濃度控制在0.3 mg/L以下，亞硝酸鹽濃度低于0.1 mg/L。每天投喂2 次，時間分別為9：00和16：00，投喂率為魚體重的4%～5%。

1.3 樣品采集

試驗開始和結(jié)束時，魚體均禁食24 h，稱量并記錄試驗魚初始體重（initial body weight, IBW）和終末體重（final body weight, FBW），同時計數(shù)羅非魚尾數(shù)，計算增重率（weight gain rate, WGR）和成活率（survival rate, SR）。試驗結(jié)束后統(tǒng)計每個重復投喂的飼料重量，計算飼料系數(shù)（feed conversion rate, FCR）和蛋白質(zhì)效率（protein efficiency ratio, PER）。

每個養(yǎng)殖桶隨機取3尾魚，用于測定全魚基本營養(yǎng)成分；另從每個養(yǎng)殖桶中隨機取3尾魚并測量其體重和體長，計算肥滿度（condition factor，CF）；之后從尾部靜脈采血，4 ℃靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上層血清用Sysmex 全自動生化分析儀（Chemix-800）測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶活性（alkaline phosphatase，ALP），總膽固醇（total cholesterol，TCHO）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）、葡萄糖（glucose，GLU）、白蛋白（albumin，ALB）、總蛋白（Total protein，TP）和三酰甘油（triglyceride，TG）的含量；將試驗魚進行解剖，分離內(nèi)臟和肝臟并稱重，計算肝體比（hepatosomatic index，HSI）和臟體比（viscerosomatic index，VSI）；將肝臟保存于-80 ℃冰柜，用于肝臟抗氧化指標的測定。丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性均采用南京建成生物技術(shù)研究所試劑盒測定。每桶另取3尾魚解剖并取其肝臟，用波恩氏液固定，石蠟包埋切片（切片厚度6 μm），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學顯微鏡觀察并照相。

每桶另外隨機取3尾魚于冰盤上處死，取出全部的腸道，剝除腸道外的脂肪和結(jié)締組織，用冷凍去離子水洗凈腸道中的內(nèi)容物，濾紙吸干水分后稱重。加入10倍冷凍去離子水，于4 ℃冰浴中勻漿，離心15 min（4 ℃、12 000 r/min），所得上清液即為消化酶粗酶液。酶液于4 ℃保存，24 h內(nèi)檢測完畢。蛋白酶活性按照GB/T 23527—2009中的福林酚法測定，酶活性的定義為：在30 ℃、pH 7.5、底物酪蛋白濃度為2%的條件下，1 min內(nèi)1 g組織中蛋白酶分解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活性單位（U）[13]。淀粉酶活性按照GB/T 24401—2009的方法測定，酶活性的定義為：在30 ℃、pH 7.5、1%的可溶性淀粉作為底物條件下，1 min內(nèi)1 g組織中的淀粉酶能完全水解淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽糖為一個酶活性單位（U）[14]。脂肪酶活性按照GB/T 23535—2009 的方法測定，酶活性的定義為：在37 ℃條件下，每克組織蛋白在反應體系中與底物反應1 min，每消耗1 μmol底物為一個酶活性單位（U）[15]。

增重率（WGR，%）=[（試驗末魚均重-試驗初魚均重）/試驗初魚均重]×100

特定生長率（SGR，%/d）=(ln 終末體重-ln 初始體重)/試驗天數(shù)×100

肝體比（HSI，%）=肝重/體重×100

臟體比（VSI，%）=內(nèi)臟重/體重×100

肥滿度（CF，g/cm3）=平均體重/平均體長3×100

成活率（SR，%）＝試驗結(jié)束時魚尾數(shù)/試驗開始時魚尾數(shù)×100

飼料系數(shù)（FCR）=飼料投喂量/試驗魚增重量；

蛋白質(zhì)效率（PER）=（終末體重-初始體重）/（投料量×飼料中蛋白質(zhì)含量）

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果用“平均值±標準差”表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行two-way ANOVA分析，并以LSD作多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚生長性能、飼料利用及形態(tài)的影響（見表2）

表2 飼料脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚生長性能、飼料利用和形態(tài)的影響

由表2 可知，經(jīng)過56 d 的飼養(yǎng)，飼料中添加了脂肪酶和乳化劑的HLEE組和LLEE組試驗魚的終末體重、增重率和特定生長率均分別顯著高于未添加這兩種添加劑的HL 組和LL 組（P＜0.05）。在飼料利用方面，HLEE 組和LLEE 組的飼料系數(shù)分別顯著低于HL組和LL組（P＜0.05），HLEE組的蛋白質(zhì)效率也顯著高于HL 組（P＜0.05）。HLEE 組的肝體比分別顯著高于HL組和LL組（P＜0.05）。脂肪酶和乳化劑的聯(lián)合使用對各組羅非魚的肥滿度均無顯著影響（P＞0.05）。雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，脂肪酶和乳化劑的添加對試驗魚的終末體重、增重率、特定生長率及飼料系數(shù)均造成了顯著影響（P＜0.05）；脂肪水平與脂肪酶和乳化劑的添加對試驗魚的飼料系數(shù)和蛋白質(zhì)效率產(chǎn)生了交互影響（P＜0.05）。

2.2 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚魚體成分組成的影響（見表3）

表3 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚魚體成分組成的影響

由表3可知，試驗魚的魚體水分、粗蛋白和粗脂肪沒有受到脂肪酶和乳化劑添加的影響（P＞0.05），但HLEE組和LLEE組魚體粗灰分分別較HL組和LL組降低了23.90%、17.71%（P＞0.05）。脂肪水平與酶和乳化劑的添加沒有對魚體體成分造成交互影響（P＞0.05）。

2.3 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚內(nèi)源消化酶活性的影響（見圖1）

從圖1 中可以看出，與HL 組和LL 組相比，HLEE組和LLEE 組有提高羅非魚胃、前腸、中腸、后腸和肝臟等消化器官中蛋白酶和脂肪酶活性的趨勢，但對淀粉酶活性沒有產(chǎn)生明顯的影響（P＞0.05），僅有提高胃中淀粉酶活性的趨勢。

圖1 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚內(nèi)源消化酶活性的影響

2.4 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚肝臟抗氧化能力的影響（見表4）

由表4可知，飼料中添加脂肪酶和乳化劑顯著降低了LLEE 組肝臟過氧化氫酶（CAT）的活性以及HLEE 組和LLEE 組的總抗氧化能力（T-AOC）（P＜0.05）。HLEE 組和LLEE 組羅非魚肝臟中丙二醛（MDA）的含量均顯著低于HL 組和LL 組（P＜0.05）。各組羅非魚肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性和超氧化物歧化酶（SOD）無顯著性差異（P＞0.05）。脂肪水平與脂肪酶和乳化劑的添加未對羅非魚肝臟各抗氧化指標造成交互影響。

表4 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚肝臟中抗氧化能力的影響

2.5 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚血液生化指標的影響（見表5）

由表5可知，通過雙因素方差分析，隨著飼料脂肪水平的降低，羅非魚血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的活性顯著降低（P＜0.05），而總蛋白（TP）和三酰甘油（TG）濃度則有提高趨勢（P＞0.05），其他血液生化指標未受脂肪水平變化的影響。在高脂肪飼料中添加脂肪酶和乳化劑顯著降低了血液中ALT 的活性，而提高羅非魚血液中TG的濃度；在低脂肪飼料中添加脂肪酶和乳化劑顯著降低了血液中TP的濃度（P＜0.05）。脂肪水平與脂肪酶和乳化劑的添加只對羅非魚血液中LDLC和TP產(chǎn)生了交互影響。

表5 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚血清生化指數(shù)的影響

2.6 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚肝臟組織形態(tài)學的影響（見圖2）

如圖2所示，肝臟切片顯示，HL組和LL組羅非魚肝臟中部分肝細胞出現(xiàn)核偏移，肝細胞的細胞質(zhì)減少，細胞核消失，出現(xiàn)了大量的空泡現(xiàn)象，而在飼料中添加脂肪酶和乳化劑后，HLEE 組羅非魚肝臟中肝細胞形態(tài)相對正常，細胞核位于細胞中間，僅見少量細胞出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，LLEE 組羅非魚肝臟中肝細胞索清晰，肝細胞形態(tài)正常，細胞核均居于細胞中間，未見空泡現(xiàn)象。

圖2 羅非魚肝臟組織學觀察（×200，N：細胞核；NM：核偏移；V：空泡）

3 討論

3.1 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚生長性能、飼料利用的影響

脂肪酶和乳化劑是脂肪代謝中必不可少的兩種消化物質(zhì)，很多研究已經(jīng)表明，在飼料中添加外源脂肪酶和乳化劑可以有效改善養(yǎng)殖動物的生長性能，促進其快速生長[16-18]。本試驗研究結(jié)果也表明，在兩種不同脂肪水平的羅非魚飼料中添加脂肪酶和乳化劑，羅非魚的增重率較對照組分別提高了6.77%、9.51%，特定生長率分別提高了3.75%、5.18%，而且在低脂肪水平飼料中添加脂肪酶和乳化劑后，羅非魚的增重率和特定生長率均達到了甚至超過了高脂肪水平組，這說明脂肪酶和乳化劑的添加具有一定的節(jié)約飼料中脂肪的作用，意味著可以通過添加脂肪酶和乳化劑，在不影響羅非魚生長性能的情況下，適當降低飼料中的脂肪水平。

從理論上講，乳化劑除了可減少脂肪在分解過程中的表面張力，使分散體系的勢能下降，加速乳化過程外，還可以提高消化道乳糜微粒的數(shù)量，使乳糜微粒能與脂肪酶充分接觸，而脂肪酶可以促進脂肪的消化，提高其吸收效率，因而二者聯(lián)用可以提高脂肪的消化吸收率。在本試驗中，脂肪酶和乳化劑的聯(lián)合應用顯著提高了高脂肪組飼料的蛋白質(zhì)效率，降低了不同脂肪水平羅非魚的飼料系數(shù)。該結(jié)果與谷金皇等[19]的研究結(jié)果類似，他發(fā)現(xiàn)在黃顙魚飼料中添加不同濃度的外源脂肪酶，對蛋白質(zhì)效率沒有產(chǎn)生顯著的影響，而顯著降低了飼料系數(shù)。這表明脂肪酶和乳化劑的添加對飼料利用的影響可能與飼料的配方結(jié)構(gòu)、飼料的營養(yǎng)水平有關(guān)，這還有待進一步研究。

3.2 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚內(nèi)源消化酶活性的影響

消化酶的活性影響魚對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，決定生長速度。而腸道內(nèi)容物中消化酶的活性反映了酶分泌與降解的動態(tài)平衡[20]。谷金皇[21]在黃顙魚中的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酶的添加均可以顯著提高胰蛋白酶和腸淀粉酶活性，100 mg/kg 的脂肪酶組還顯著提高了胰脂肪酶和胰淀粉酶活性。Liu 等[22]報道，在草魚飼料中添加脂肪酶可以顯著提高肝臟和腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。本試驗的研究結(jié)果表明，脂肪酶和乳化劑的添加顯著增加了HLEE組和LLEE組羅非魚胃、肝、腸中蛋白酶的活性。而與王國霞等[23]的研究發(fā)現(xiàn)在花鱸飼料中添加外源脂肪酶對中腸和肝中的消化酶活性沒有影響不一致。這些研究結(jié)果不盡一致，可能與動物(種類、年齡、生理狀態(tài)等)、飼料組成、環(huán)境條件等諸多因素有關(guān)[24]，也可能與酶制劑來源、添加的劑量以及本身的一些特性有關(guān)。

3.3 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚生化指標的影響

ALT 和AST 主要存在于肝細胞內(nèi)，肝細胞受損時，細胞膜通透性增強，細胞內(nèi)釋放ALT和AST，從而提高了血清中ALT 和AST 的活性，因此血清ALT 和AST的活性在一定程度反映了肝臟的健康程度[25]。血清中的ALP 主要來自肝臟，當肝臟發(fā)生病變時，血清中ALP的活性也會出現(xiàn)增高，因此在臨床上也常用來衡量肝臟是否受損[26]。本試驗中，無論是在高脂肪飼料還是在低脂肪飼料中添加脂肪酶和乳化劑都顯著降低了血清中AST 和ALP 的活性。這說明了脂肪酶和乳化劑的添加有利于提高魚體肝臟的健康狀況。

TCHO、TG、LDLC、HDLC是反映機體脂肪代謝的重要指標[27]。谷金皇等[19]發(fā)現(xiàn)在黃顙魚飼料中添加100～500 mg/kg 的脂肪酶可以降低黃顙魚血清中TCHO、TG、LDLC 的含量。本試驗中，脂肪酶和乳化劑在飼料中的添加，除了顯著提高了高脂肪組TG 的含量外，其他指標均值出現(xiàn)了下降的趨勢，這說明脂肪酶和乳化劑的添加有一定的促進脂肪代謝的作用，但是要進一步提高此效果，還有待深入研究。

血清GLU 是評估糖代謝的重要指標。血糖的來源有二：進食后淀粉在腸內(nèi)水解生成的葡萄糖由門靜脈吸收進入血液；肝糖原分解為葡萄糖是禁食時血糖的來源[27]。本研究表明，脂肪酶和乳化劑的添加有提高禁食時血糖的趨勢，但與對照組差異不顯著，這可能與添加量不足有關(guān)。

血清ALB和總蛋白TP可以反映蛋白質(zhì)在機體內(nèi)的代謝情況[28]。本試驗中各組血清ALB 的含量沒有受到脂肪酶和乳化劑添加的影響，但是高脂飼料中添加脂肪酶和乳化劑比在低脂飼料中的添加在一定程度上提高了血清TP 的濃度，表明脂肪酶和乳化劑的添加能夠提高飼料中蛋白質(zhì)的吸收。

3.4 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚肝臟抗氧化指標的影響

由CAT、GSH-Px、SOD 等抗氧化酶指標和TAOC、MDA 等非酶指標組成的抗氧化系統(tǒng)在動物維持體內(nèi)自由基平衡、減少機體的氧化損傷方面發(fā)揮著重要的作用[29]。Liu 等[22]的研究表明在羅非魚飼料中添加不同含量的外源脂肪酶可以上調(diào)抗氧化酶的基因表達，從而提高抗氧化酶的活性。在本試驗中，飼料中脂肪酶和乳化劑顯著降低了HLEE組和LLEE組羅非魚肝臟中MDA 的含量，而對各組羅非魚肝臟中GSH-Px 的活性均無顯著性影響。這表明脂肪酶和乳化劑的添加對提高羅非魚肝臟抗氧化能力、減少體內(nèi)自由基和過氧化物含量、降低脂質(zhì)過氧化有良好的效果。

3.5 脂肪酶和乳化劑聯(lián)合應用對羅非魚肝臟形態(tài)的影響

脂肪是魚類必需營養(yǎng)元素之一，適宜的脂肪水平是保證養(yǎng)殖魚類正常生長的必要條件，但是飼料中脂肪含量過高又會導致養(yǎng)殖魚類的脂肪肝病的發(fā)生，從而影響到養(yǎng)殖魚類的健康[30-31]。已有研究表明飼料中脂肪含量在6%～9.35%之間對其生長最為有利[32-34]，然而，即使是最適生長水平的飼料脂肪水平，因為加工方式[34]、脂肪源[35]不同等原因仍然會導致肝臟受損。已有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加脂肪60 g/kg 和80 g/kg 會導致肝胰臟腫脹，肝細胞發(fā)生病理性改變[36]。本研究的結(jié)果也顯示，投喂脂肪含量約為75 g/kg 和80 g/kg的飼料，試驗羅非魚的肝臟均出現(xiàn)不同程度的病變。投喂含有脂肪酶和乳化劑的飼料56 d 后，試驗羅非魚肝臟病變情況有了較大程度的改善，這說明脂肪酶和乳化劑的聯(lián)合使用，能夠有效改善羅非魚肝臟的健康狀況。