■楊建榮 趙佳瑋 李 晶 李彥伸 高永林 盧國柱 尤艷莉*

（1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264005；2.煙臺綠葉動物保健品有限公司，山東煙臺 264005）

隨著我國經(jīng)濟(jì)水平和人們生活水平的不斷提高，人們對營養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量較高的禽畜肉的需求量正快速增加，禽畜養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展不僅對飼料的需求量大大增加，更對飼料的品質(zhì)有了更高的要求，飼料的品質(zhì)會直接影響到養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人們的食品質(zhì)量安全，因此保證飼料的質(zhì)量安全是保障食品安全和人類健康的重要途徑之一。目前飼料中普遍存在的霉菌毒素是飼料生產(chǎn)和使用過程中常見的問題。飼料中常見且危害較大的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2 毒素及伏馬菌素等[1]。龔阿瓊等[2]從市場上抽取的63 份樣品皆檢測出多種霉菌毒素。霉菌毒素被動物采食后可能導(dǎo)致動物生長受阻、繁殖機能下降、組織壞死、免疫抑制、癌變及基因突變等[3]。T-2 毒素是A 型單端孢霉烯族毒素中最強的毒素，主要存在于玉米、小麥、大麥和燕麥中。T-2 毒素主要作用于骨髓、肝臟等，可引起動物食欲下降或拒絕采食、體重降低、腹瀉和反應(yīng)遲鈍等癥狀，還可造成脾臟出血等[4]。GB 13078-2017 規(guī)定了豬、禽配合飼料中T-2 毒素的限量為≤0.5 mg/kg。毒素的存在不僅會使飼料利用率大大降低，更嚴(yán)重的問題是毒素會殘留在肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品中，導(dǎo)致食用者霉菌毒素中毒，危害人類健康。因此毒素的存在對禽畜養(yǎng)殖業(yè)具有很嚴(yán)重的危害性，飼料中毒素的檢測和脫毒已成為飼料研究的重要項目。天然礦物質(zhì)蒙脫石（MMT）的主要成分是硅鋁酸鹽，能吸附霉菌毒素、重金屬、細(xì)菌，在動物腸道中修復(fù)和保護(hù)消化道黏膜，防治腹瀉[5]，是目前飼料中除霉除菌的主要添加成分。研究表明，硅鋁酸鹽在pH 6.5 條件下對黃曲霉毒素的吸附效果較好，吸附率能達(dá)到84.00%[6]。酵母多糖的主要成分為大分子的葡聚糖、甘露聚糖及糖蛋白復(fù)合物，已有研究表明酵母多糖對黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮都有較好的吸附脫毒能力[7]。蒙脫石+酯化葡甘露聚糖對黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素的吸附率最高可達(dá)96%、95%和98%[8]。另外，動物試驗證明由蒙脫石和葡甘露聚糖組成的復(fù)合吸附劑添加到飼料中不僅對動物機體沒有傷害，而且能減少由于飼料霉變而引起的肝、腎等的腫脹，恢復(fù)機體的總蛋白含量和血清酶活性等的正常水平[9]。對T-2 毒素的吸附脫毒可以采用物理法、化學(xué)法和生物法等[10]。陳亞黎[11]進(jìn)行苯甲酰胺衍生物和β-環(huán)糊精對T-2 毒素脫除效果的研究。Devegowda 從酵母菌細(xì)胞中分離出酯化葡甘露聚糖，進(jìn)行了對T-2 毒素的脫毒效果研究。目前飼料脫毒研究較多的是蒙脫石對黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的吸附脫毒，而蒙脫石和酵母多糖對T-2 毒素的吸附脫毒還少有研究[12]。本試驗在蒙脫石和三種酵母多糖中分別添加T-2 毒素，經(jīng)體外吸附試驗，研究不同吸附劑對T-2 毒素的吸附效果。本試驗根據(jù)T-2 毒素在208 nm 有紫外吸收的特點，采用高相液相色譜法測定T-2 毒素的含量，從而得出一定濃度范圍內(nèi)蒙脫石和酵母多糖對T-2毒素的吸附率和吸附量，以期對飼料中T-2 毒素的脫毒提供理論依據(jù)，為飼料生產(chǎn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設(shè)備

蒙脫石（含量95%）由煙臺海潤斯生物科技有限公司提供；酵母細(xì)胞壁、酵母β-葡聚糖G70、甘露糖蛋白由安琪酵母股份有限公司提供。

T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品（以色列Fermantteck公司）；乙腈（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸氫二鉀和氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）配制成pH6.8的緩沖溶液；磷酸二氫鉀和鹽酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）配制成pH 3.0的緩沖溶液。

Agilent1100 高效液相色譜儀（配VWD 紫外檢測器）；AL-204 分析天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；SHA-CA水浴恒溫振蕩器（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；TGL-16gR 高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 T-2含量的HPLC檢測方法

1.2.1.1 色譜條件

根據(jù)紫外掃描T-2 毒素在208 nm 處有吸收，因此本試驗選擇檢測波長為208 nm；色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈+水=70+30；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速：1 mL/min。

1.2.1.2 T-2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取5 mg的標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈稀釋定容至5 mL，得到濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)貯備液用乙腈稀釋定容至2 mL，得到濃度為50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確移取20、40、80、120、200 μL 標(biāo)準(zhǔn)中間液用乙腈稀釋定容至2 mL，得到濃度分別為0.5、1、2、3、5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)使用液的濃度和峰面積作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)保留時間定性，外標(biāo)法定量。

1.2.2 吸附試驗

1.2.2.1 蒙脫石對T-2毒素的等溫吸附試驗

準(zhǔn)確稱取5 份2 mg 蒙脫石至5 mL 具塞離心管中，分別加入100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液20、30、40、50、60 μL，再加入pH 為6.8 的磷酸緩沖溶液使其最終體積為2 mL，于37 ℃恒溫振蕩吸附2 h，振蕩速率為140 r/min，再于6 000 r/min 的離心機上離心5 min，上清液用0.45 μm膜過濾后用HPLC檢測，同時做3次平行試驗。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出吸附后溶液的濃度，得到濃度的平均值，見式（1）、（2）求出蒙脫石的吸附量和吸附率。

式中：Q——吸附量（μg/mg）；

C0——吸附前T-2濃度（μg/mL）；

C——吸附后T-2濃度（μg/mL）；

V——溶液體積（mL）；

m——吸附劑質(zhì)量（mg）；

Y——吸附率（%）。

1.2.2.2 不同吸附時間對三種酵母多糖吸附作用的影響

分別準(zhǔn)確稱取5 mg三種酵母多糖各4份，準(zhǔn)確加入100 μg/mL T-2 標(biāo)準(zhǔn)溶液30 μL，再加入pH 6.8 的磷酸緩沖溶液使其最終體積為2 mL，渦旋混合均勻后，在37 ℃、140 r/min的條件下，分別振蕩0、1、2、3 h后離心（6 000 r/min，5 min），0.45 μm 濾膜過濾。在上述色譜條件下測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的峰面積得到吸附后T-2 的平均濃度并求出吸附量和吸附率。平行測定3次。

1.2.2.3 不同溫度對三種酵母多糖吸附作用的影響

本試驗研究了常溫25 ℃和體溫37 ℃下三種酵母多糖的吸附作用。分別準(zhǔn)確稱取5 mg三種酵母多糖各2 份，準(zhǔn)確加入100 μg/mL T-2 標(biāo)準(zhǔn)溶液30 μL，再加入pH 6.8 的磷酸緩沖溶液使其最終體積為2 mL，在其他條件完全相同的情況下分別探究25、37 ℃下酵母多糖對T-2 毒素吸附脫毒效果的影響。平行測定3次。

1.2.2.4 不同pH值對三種酵母多糖吸附作用的影響

因為胃液pH在3左右，腸道pH在6.8左右，因此本試驗采用pH 3.0 和pH 6.8 探討pH 對吸附作用的影響。分別準(zhǔn)確稱取2 組5 mg 三種酵母多糖各6份，依次準(zhǔn)確加入100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、30、40、50、60 μL，第一組加入pH 6.8的磷酸緩沖溶液、第二組加入pH 3.0 的磷酸緩沖溶液并使最終體積皆為2 mL，渦旋混合均勻后，經(jīng)振蕩（37 ℃，140 r/min，2 h）、離心（6 000 r/min，5 min），上清液用0.45 μm 濾膜過濾。在上述色譜條件下測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的峰面積得到吸附后T-2 的平均濃度并求出吸附量和吸附率。平行測定3次。

1.2.3 最低檢出限、定量下限和精密度的測定

將T-2標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋后進(jìn)樣，當(dāng)峰高為基線噪聲的3 倍（約為0.06 mAU）時所對應(yīng)的濃度即為儀器的最低檢出限。

將T-2標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋后進(jìn)樣，當(dāng)峰高為基線噪聲的10 倍（約為0.2 mAU）時所對應(yīng)的濃度即為定量下限。

將標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積求出該儀器精密度。

本試驗取得的數(shù)據(jù)采用方差分析中單因素方差法（one-way ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用顯著性檢驗法進(jìn)行分析判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（見圖1、圖2）

圖1 T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)色譜

圖2 T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)溶液在確定的色譜條件下進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，保留時間為3.9 min，色譜圖見圖1。

根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是y=4.749 2x+0.116 8，相關(guān)系數(shù)是R2=0.999 1，說明在該線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

2.2 蒙脫石對T-2 毒素的吸附量和吸附率（見圖3～圖4）

圖3 蒙脫石吸附毒素后的色譜峰

圖4 蒙脫石對T-2的等溫吸附曲線

將蒙脫石在試驗條件下吸附T-2 毒素后的濾液進(jìn)樣，得到樣液的色譜圖如圖3 所示，保留時間4.001 min的峰即為T-2的峰。

根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得蒙脫石對T-2毒素的吸附量和吸附率，以平衡濃度為橫坐標(biāo)，吸附率為縱坐標(biāo)，得到蒙脫石在pH 為6.8、37 ℃時的等溫吸附曲線如圖4 所示。由圖4 得出，MMT 對T-2 的等溫吸附曲線呈非線性相關(guān)。在本試驗條件下蒙脫石的最大吸附量可以達(dá)到1.80 μg/mg，最大吸附率為87.10%。

2.3 吸附時間、溫度、pH對三種酵母多糖吸附效果的影響

2.3.1 不同吸附時間對吸附效果的影響（見圖5）

如圖5 所示，隨著吸附時間的增加，三種酵母多糖對T-2 毒素的吸附在2 h 達(dá)到飽和。在不同的吸附時間，酵母細(xì)胞壁的吸附率顯著高于其他兩種酵母多糖（P＜0.05）。其中酵母細(xì)胞壁在2 h 時的吸附率最大為45.60%，最大吸附量為0.56 μg/mg；其次是甘露糖蛋白，吸附率為33.60%，最大吸附量為0.14 μg/mg。由試驗可看出，吸附時間對甘露糖蛋白作用更加明顯，吸附量和吸附率隨時間的改變變化較大。由于解吸作用使3 h 時的吸附量和吸附率有所下降。

圖5 不同吸附時間三種酵母多糖吸附率對比

2.3.2 不同溫度對吸附效果的影響（見圖6）

圖6 不同溫度三種酵母多糖吸附率對比

如圖6 所示，三種酵母多糖在37 ℃時的吸附率和吸附量都高于25 ℃時。三種酵母多糖都具有吸附效果，但效果差異并不顯著。其中酵母細(xì)胞壁的吸附率最大為39.79%，吸附量為0.41 μg/mg；其次是甘露糖蛋白，最大吸附率為33.60%，吸附量為0.14 μg/mg。由圖6 可看出，溫度對酵母細(xì)胞壁和酵母β-葡聚糖作用更加明顯，吸附率變化較大，對甘露糖蛋白的影響較小。分析其原因可能是甘露糖蛋白分子間存在氫鍵使其熱穩(wěn)定性更好，不易受外界溫度影響。由試驗可看出，溫度會顯著影響酵母多糖對T-2 的吸附能力，在體溫37 ℃下更有利于發(fā)揮其生物活性，增強吸附效果。

2.3.3 不同pH對吸附效果的影響（見圖7～圖9）

如圖7～圖9 所示，pH 對三種酵母多糖吸附效果的影響都較大，且pH 3.0 時的吸附量明顯大于pH 6.8 時的吸附量，說明酸性條件更有利于對T-2的吸附。酵母細(xì)胞壁和酵母β-葡聚糖都是隨著T-2 毒素濃度的增加，吸附量先逐漸增加，且在T-2濃度為1.5 μg/mL 時其吸附量達(dá)到最大，當(dāng)濃度再增加后吸附量反而會下降。

圖7 不同pH下酵母細(xì)胞壁對T-2的吸附

圖8 不同pH下酵母β-葡聚糖對T-2的吸附

圖9 不同pH下甘露糖蛋白對T-2的吸附

2.4 蒙脫石和三種酵母多糖吸附結(jié)果綜合分析（見圖10）

由圖10 可知，蒙脫石對T-2 的吸附作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于三種酵母多糖，可以作為常規(guī)飼料添加劑吸附T-2毒素。三種酵母多糖中酵母細(xì)胞壁的吸附作用最好，其次是甘露糖蛋白。

圖10 不同吸附劑吸附量對比

2.5 檢出限、定量限和精密度的測定

將標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋后制得一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述HPLC 色譜條件經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后進(jìn)樣檢測后知：檢出限為0.08 μg/mL，定量限為0.25 μg/mL，說明儀器靈敏度高，能滿足檢測要求。

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積得到精密度為2.81%，符合儀器精密度要求。

3 討論

霉菌毒素對禽畜養(yǎng)殖業(yè)造成的損失是非常嚴(yán)重的。本試驗?zāi)M動物體內(nèi)環(huán)境（pH 6.8，37 ℃）對T-2 進(jìn)行體外吸附，證明了蒙脫石對T-2 毒素有較高的吸附能力，在設(shè)定的試驗條件下蒙脫石的最大吸附量可以達(dá)到1.80 μg/mg，最大吸附率為87.1%。蒙脫石的吸附主要為化學(xué)吸附，這種吸附要強于生物吸附。因此也決定了蒙脫石的吸附效果要優(yōu)于酵母多糖。三種酵母多糖中酵母細(xì)胞壁對T-2 的吸附效果最好，吸附時間和pH 對酵母多糖的吸附效果影響較大。酵母細(xì)胞壁除富含β-葡聚糖和甘露聚糖（MOS）外，還含有多種生物活性物質(zhì)，因此，三種酵母多糖中酵母細(xì)胞壁的吸附效果最優(yōu)。已有研究結(jié)果表明，蒙脫石和酵母細(xì)胞壁的混合物能有效吸附飼料中的黃曲霉毒素（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEA）[7]，因此在未來吸附劑的發(fā)展可以側(cè)重尋找有效的輔助成分。本研究的不足之處是只探討了T-2 毒素的體外吸附試驗，與受各種生理因素影響的復(fù)雜的動物體內(nèi)的吸附可能存在一定的差異，還需進(jìn)一步做動物試驗進(jìn)行研究。另外在此基礎(chǔ)上可以繼續(xù)研究在飼料中添加蒙脫石和酵母多糖的配比問題以達(dá)到最佳吸附效果。

4 結(jié)論

蒙脫石對T-2毒素有較大的吸附作用；三種酵母多糖中，酵母細(xì)胞壁的吸附量最大。因此，在飼料中添加一定量的蒙脫石和酵母細(xì)胞壁不僅可以吸附黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等毒素，還可以有效吸附T-2 毒素。添加了酵母多糖的飼料還可以利用其生物活性增強禽畜免疫力，有效減少禽畜患病率，利于養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，有效減少給人體帶來的傷害。本試驗雖然只是應(yīng)用蒙脫石和酵母多糖對T-2 毒素進(jìn)行了體外吸附研究，與吸附劑在動物體內(nèi)的吸附還是有一定的區(qū)別，但可以為飼料生產(chǎn)企業(yè)使用蒙脫石和酵母多糖作為霉菌吸附劑提供依據(jù)。