田祥云，孫 毅，邵 帥，劉曉倩，譚 博，蘇瑞斌

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

阿片類生物堿及相關(guān)藥物是治療急慢性疼痛最有效的鎮(zhèn)痛藥，其中嗎啡和可待因是主要的活性阿片類生物堿。早期研究表明，阿片類藥物及其衍生物作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的μ阿片受體（μ-opioid receptor，MOR）后，主要通過抑制性G蛋白（Gi）與細(xì)胞效應(yīng)因子相互作用來傳遞鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等［1-2］。近年來，人們對β-制動蛋白分子的認(rèn)識不斷加深，提出了β-制動蛋白可以作為G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCR）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器，獨立于G蛋白介導(dǎo)下游信號通路的傳遞的理論，這與以往認(rèn)定的β-制動蛋白是G蛋白信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子觀點有所不同。GPCR結(jié)構(gòu)解析的進一步研究表明，受體的激活構(gòu)象是動態(tài)可變的，與不同配體結(jié)合會呈現(xiàn)出不同的激動態(tài)結(jié)構(gòu)，從而不同程度地招募G蛋白和β-制動蛋白，觸發(fā)不同的信號通路，最終引起千差萬別的效應(yīng)［3-4］。

隨著人們對MOR結(jié)構(gòu)解析研究的深入，如2012年解析的MOR-β-富納曲胺（funaltrexamine，F(xiàn)NA）（拮抗劑）復(fù)合物結(jié)構(gòu)［5］、2015年解析的MOR-橋聯(lián)吡咯烷嗎啡喃（bridged pyrrolidinomor?phinan，BU72）（激動劑）復(fù)合物結(jié)構(gòu)［2］和2018年解析的 MOR-DAMGO-Gi蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)［6］，均提示了不同配體與MOR相互作用后，MOR發(fā)生不同的構(gòu)象變化，最終形成不同的穩(wěn)定構(gòu)象［2-4］。Smith等［7］提出“三元復(fù)合物”模型從結(jié)構(gòu)上解釋受體、配體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白之間的相互作用。當(dāng)配體與受體結(jié)合后，受體會發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，形成中間構(gòu)象狀態(tài)，而這一狀態(tài)決定了受體是結(jié)合G蛋白還是結(jié)合β-制動蛋白形成最終穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)構(gòu)解析研究顯示，受體中的某些基元如NPxxY，可能與β-制動蛋白的招募有關(guān)［8］，而某些基元如脯氨酸5.50-異亮氨酸3.40-苯丙氨酸6.44三聯(lián)體，可能與G蛋白信號通路相關(guān)［2］。本研究以嗎啡和DAMGO為例，采用計算機模擬方法預(yù)測影響其與MOR結(jié)合的氨基酸位點，將相應(yīng)位點突變后，通過G蛋白依賴性信號通路和β-制動蛋白依賴性信號通路的激活程度來分析其中的關(guān)鍵氨基酸位點。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

芬太尼（軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所合成，純度99%）；鹽酸嗎啡（國藥準(zhǔn)字H63020013，青海制藥廠有限公司，批號：20020201）；DAMGO（批號：1171，美國Tocris Bioscience公司）；納曲吲哚（naltrindole hydrochloride，批號：14A/204708，美國Tocris Bioscience公司）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)基和不依賴CO2的培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；定點突變試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（德國QIAGEN公司）；DNA純化回收試劑盒、2×Pfu PCR MasterMix和DNA Marker 2000（北京天根生物技術(shù)公司）；DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京博邁德基因技術(shù)有限公司），瓊脂糖（西班牙Biowest Agarose公司）；胰蛋白胨和酵母提取物（英國Oxoid公司）；NaCl（西隴科學(xué)股份有限公司）；氨芐青霉素、卡那霉素和毛喉素（forskolin，F(xiàn)OR）（美國Sigma公司）；Q5熱啟動超保真2×Master Mix（美國NEB公司）；NheⅠ限制性內(nèi)切酶、SacⅠ限制性內(nèi)切酶、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、10×T4 DNA連接酶緩沖液、反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒、SYBR Green/ROX qPCR試劑盒和Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑（美國Thermo Scientific公司）；M5 Gelred Plus核酸染料（北京聚合美生物科技有限公司）；SNAP-Lumi4-Tb、5×Tag-lite標(biāo)記緩沖液和Taglite MOR熒光標(biāo)記配體（美國Cisbio公司）；兔抗人MOR多克隆抗體（美國Minipore公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆lgG和小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體（北京普利采基因技術(shù)公司）；小鼠抗人β-制動蛋白單克隆抗體（美國CST公司）；DMSO（美國MP Biomedical公司）；pGloSensorTM-22F cAMP 質(zhì)粒（a-f）、GloSensorTMcAMP Reagent、Nano?BiT?PPI MCS Starter System和Nano-Glo?活細(xì)胞分析系統(tǒng)（美國Promega公司）；重組質(zhì)粒構(gòu)建以及實時定量PCR所需引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

基因擴增儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；電泳儀和水平電泳槽（北京市六一儀器廠）；紫外透視儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；多功能成像儀（美國Kodak公司）；紫外可見分光光度計（美國Unico公司）；倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Perkin Elmer公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；離心機（德國Eppendorf公司）；實時熒光定量PCR儀器（美國Applied Bionsystem公司）。

1.2 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

HEK 293T細(xì)胞（中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫），用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 計算機模擬預(yù)測MOR與配體相互作用的關(guān)鍵位點

本實驗室與復(fù)旦大學(xué)付偉教授團隊合作進行DAMGO和嗎啡與MOR的分子對接。使用Discov?ery Studio 3.5軟件中同源模建模塊，以小鼠激動態(tài)MOR的X射線晶體結(jié)構(gòu)（PDB編碼：5C1M）［2］為模板建立人源激動態(tài)MOR三維結(jié)構(gòu)模型，原MOR晶體結(jié)構(gòu)中的所有水分子均保留；使用Maestro 3.5程序中的Glide Docking模塊將DAMGO和嗎啡對接到MOR的結(jié)合位點，從而得到化合物與MOR的分子對接圖。

1.4 SNAP-MOR突變體質(zhì)粒的構(gòu)建

以本實驗室譚博構(gòu)建的SNAP-MOR質(zhì)粒為模板設(shè)計引物，將質(zhì)粒進行反向PCR擴增并引入突變堿基，引物序列見表1。反應(yīng)體系：2×Max緩沖液12.5 μL，正向引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，反向引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，dNTP 混合物（10 mmol·L-1）0.5 μL，Phanata Mix Super-Fidelity DNA 聚合酶0.5 μL，SNAP-MOR（500 mg·L-1）0.5 μL，雙蒸水9.0 μL。反應(yīng)過程：① 95℃ 30 s，② 95℃ 15 s，③64～68.5℃ 15 s，④ 72℃ 5 min，⑤ 72℃ 5 min，其中過程②～④循環(huán)33次，退火采用程序升溫，每個循環(huán)增加0.1℃；其中的退火溫度：Y7.43F為65.5～68.5℃；H6.52L，Y7.43A和Y7.43S為61～64℃；H6.52D和H6.52W為64～67℃。

Tab.1Sequence of primers for μ-opioid receptor（MOR）site mutation

擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后得到目的基因（6000 bp），用DNA純化回收試劑盒將目標(biāo)質(zhì)粒純化回收后經(jīng)DpnⅠ消化，去除甲基化模板質(zhì)粒，反應(yīng)體系為DpnⅠ1 μL，擴增產(chǎn)物40 μL；反應(yīng)條件為37℃恒溫2 h；消化完成后將產(chǎn)物進行重組反應(yīng)，反應(yīng)體系為5×CE Ⅱ緩沖液 8 μL，DpnⅠ消化產(chǎn)物 2 μL，exnase Ⅱ4 μL，雙蒸水26 μL；置37℃恒溫反應(yīng)30 min，冰水浴冷卻5 min；將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，接種到含氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后挑取若干單克隆，在擴大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，進行目的基因的測序比對。

1.5 熒光標(biāo)記配體結(jié)合實驗

1.5.1 細(xì)胞分組處理和熒光強度檢測

將SNAP-MOR和SNAP-MOR突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁伸展匯合度約80% 時，換含有 SNAP-Lumi4-Tb（100 nmol·L-1）工作液的培養(yǎng)基，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。棄SNAP-Lumi4-Tb工作液，用1×Tag-lite標(biāo)記緩沖液清洗細(xì)胞后加入0.02%乙二胺四乙酸溶液消化細(xì)胞，經(jīng)離心、重懸后制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×108L-1。使用熒光標(biāo)記配體（即帶有紅色熒光基因的納曲酮衍生物）作為結(jié)合分子進行熒光標(biāo)記配體結(jié)合實驗。在384孔板中每孔加入10 μL單細(xì)胞懸液，設(shè)如下組別：①熒光配體總結(jié)合組〔每孔加5 μL 1×Tag-lite標(biāo)記緩沖液、5 μL梯度濃度的熒光標(biāo)記配體（終濃度0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.3，12.5，25.0，50.0和100.0 nmol·L-1）〕；② 熒光配體非特異結(jié)合組〔每孔加5 μL 10 μmol·L-1的納曲吲哚、5 μL梯度濃度的熒光配體（終濃度同①）〕；③ 藥物競爭結(jié)合組〔每孔加5 μL 32 nmol·L-1的熒光標(biāo)記配體、5 μL梯度濃度的DAMGO或嗎啡（終濃度均為10-14～10-4mol·L-1）〕，每組設(shè)2復(fù)孔。加樣完成后，將384孔板貼膜封閉，微震混勻，避光孵育3 h，用多功能酶標(biāo)儀檢測在激發(fā)光340 nm，發(fā)射光665和615 nm波長下的熒光強度（fluorescence intensity，F(xiàn)I），以均相時間分辨熒光（homoge?neous time resolved fluorescence，HTRF）比值反映熒光標(biāo)記配體與MOR的結(jié)合程度，HTRF比值=FI665nm/FI615nm×104。實驗重復(fù)3次。

因此，選擇適合香菇優(yōu)良品種，綜合考慮品種特性、市場需求和當(dāng)?shù)貧夂蛱攸c[7]，結(jié)合區(qū)域氣候、地形、人力等基本情況，加強并提高技術(shù)管理形成規(guī)范化的模式和技術(shù)規(guī)程，對于引進菌類品種的栽培成功非常重要。跟進當(dāng)?shù)貧夂蜃兓闆r，因地制宜及時進行技術(shù)、管理調(diào)整，多參考前人成功事例，總結(jié)失敗與成功的經(jīng)驗，是產(chǎn)業(yè)落地穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展的重要步驟。

1.5.2 統(tǒng)計學(xué)分析

1.6 GloSensor cAMP生物傳感器測定cAMP含量

1.6.1 細(xì)胞分組處理和cAMP含量檢測

將SNAP-MOR和SNAP-MOR突變體質(zhì)粒分別與pGloSensorTM-22F質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞［9］，在轉(zhuǎn)染16～18 h后，取密度為1.5×108L-1的單細(xì)胞懸液100 μL接種到96孔板，12 h后棄培養(yǎng)液，換成平衡培養(yǎng)基（含88%不依賴CO2的培養(yǎng)基、10% FBS和2% GloSensor cAMP試劑原液）在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，孵育完成后，進行加藥處理，多功能酶標(biāo)儀測定400～700 nm范圍內(nèi)的化學(xué)發(fā)光強度（luminescence intensity，LI）。細(xì)胞分為空白組（每孔90 μL平衡培養(yǎng)基）；FOR組（每孔99 μL平衡培養(yǎng)基，加入 1 μL FOR 10 μmol·L-1）；藥物處理組〔每孔90 μL平衡培養(yǎng)基，加入10 μL梯度濃度的DAMGO或嗎啡（濃度為10-11～10-3mol·L-1），再每孔加入1 μL FOR 10 μmol·L-1〕，20 min后測定LI，以LI反映細(xì)胞內(nèi)cAMP含量。每組設(shè)3復(fù)孔，計算藥物作用后cAMP抑制百分率，以反映藥物對MOR下游G蛋白依賴性信號通路的激活。cAMP抑制百分率（%）=〔（FOR組LI-空白組LI）-（藥物處理組LI-空白組LI）〕/（FOR組LI-空白組LI）×100%。實驗重復(fù)3次。

1.6.2 統(tǒng)計學(xué)分析

1.7 蛋白質(zhì)相互作用分析體系測定配體激活MOR后對 β-制動蛋白2的募集

此分析系統(tǒng)需構(gòu)建MOR-SmBiT和LgBiTARRB2表達(dá)載體。MOR-SmBiT表達(dá)載體以SNAP-MOR質(zhì)粒為模板，正向引物：5’-CTAGC?TAGCATGGACAGCAGCGCG-3’，反向引物：5’-ATACGAGCTCTGGGCAACGGAGCAG-3’，在5’端引入NheⅠ限制性內(nèi)切酶位點，3’端引入SacⅠ限制性內(nèi)切酶位點；LgBiT-ARRB2表達(dá)載體以Flag-ARRB2質(zhì)粒為模板，正向引物：5’-ATAC?GAGCTCCATGGGGGAGAAACC-3’，反向引物：5’-CTAGCTAGCCTAGCAGAGTTGATCATC-3’，在5’端引入SacⅠ限制性內(nèi)切酶位點，3’端引入NheⅠ限制性內(nèi)切酶位點。PCR擴增MOR片段，反應(yīng)體系：Q5高保真熱啟動2×混合液12.5 μL，正向引物（10 μmol·L-1）1.25 μL，反向引物（10 μmol·L-1）1.25 μL，SNAP-MOR（500 mg·L-1）模板DNA 1.0 μL〔（SNAP-MOR（500 mg·L-1），F(xiàn)lag-ARRB2（869 mg·L-1）〕，雙蒸水9.0 μL；反應(yīng)過程：① 95℃ 1 min，② 95℃ 10 s，③ 65℃ 30 s，④ 72℃ 2 min，⑤ 72℃4 min，其中過程②～④循環(huán)30次。

PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，對目的條帶1200和1400 bp左右的膠進行回收。將擴增片段與目的載體進行酶切和連接。片段酶切體系：10×FastDigest緩沖液 4 μL，NheⅠ限制性內(nèi)切酶2 μL，SacⅠ限制性內(nèi)切酶 2 μL，片段 DNA 5 μL，雙蒸水27.0 μL；載體酶切體系同片段酶切體系，酶切條件為37℃水浴5 min。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)產(chǎn)物條帶位置無誤后，回收酶切產(chǎn)物進行連接。連接體系：10×T4 DNA連接酶緩沖液2 μL，T4 DNA連接酶0.2 μL，線性載體DNA 3 μL，插入片段DNA 14 μL，雙蒸水0.8 μL。連接條件：22℃孵育10 min，65℃熱失活10 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，從轉(zhuǎn)化平板上挑取單克隆，利用菌液PCR的方法篩選陽性克隆，PCR反應(yīng)體系：2×PCR 混合液 5 μL，正向引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，反向引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，菌液 2.0 μL，雙蒸水1.0 μL；PCR反應(yīng)過程同1.4。將PCR產(chǎn)物再次進行瓊脂糖凝膠電泳，驗證重組載體的構(gòu)建，從篩選出的陽性克隆中抽提質(zhì)粒進行測序。

1.7.2 細(xì)胞處理和檢測

突變型MOR-SmBiT表達(dá)載體以MOR-SmBiT質(zhì)粒為模板進行構(gòu)建，方法同1.4。分別將MORSmBiT、MOR-SmBiT突變體質(zhì)粒和LgBiT-ARRB2質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞［9］，在轉(zhuǎn)染16～18 h后，取密度為1.5×108L-1的單細(xì)胞懸液100 μL接種到96孔板，12 h后棄培養(yǎng)液，用Opti-MEM緩沖培養(yǎng)基在環(huán)境溫度中平衡10 min，平衡完成后，每孔加入25 μL Nano-Glo活細(xì)胞試劑，將細(xì)胞分為空白組和DAMGO或嗎啡處理組（每孔加入10 μL DAMGO或嗎啡，分別為1.35×10-11～1.35×10-3mol·L-1），作用15 min后用多功能酶標(biāo)儀測定400～700 nm范圍內(nèi)的LI。以LI指標(biāo)反映藥物作用后β-制動蛋白2的招募量，每組3復(fù)孔，計算藥物作用后β-制動蛋白2的招募量。β-制動蛋白2的招募量=藥物處理組LI-空白組LI。實驗重復(fù)3次。

1.7.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DAMGO和嗎啡與MOR相互作用關(guān)健位點

人源激動態(tài)MOR三維結(jié)構(gòu)模型見圖1A，DAMGO和嗎啡與MOR的分子對接圖確定了DAMGO和嗎啡與MOR的結(jié)合模式（圖1B和1C）。結(jié)果顯示，DAMGO和嗎啡的質(zhì)子化氮均與MOR中D3.32的羧基氧原子形成穩(wěn)定的離子鍵，Y7.43的羥基與D3.32的羧基形成氫鍵；嗎啡結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的羥基通過水橋與H6.52的咪唑側(cè)鏈相互作用、與K5.39的羧基氧相互作用，從而形成較復(fù)雜的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。由此推斷，H6.52和Y7.43參與DAMGO和嗎啡與MOR的相互作用。

Fig.1 Three dimensional structure models of human dynamic μ-opioid receptor（MOR）（A）and details of binding modes of DAMGO（B）and morphine（C）with wild type MOR.

2.2 DAMGO和嗎啡與野生型和各突變型MOR的競爭結(jié)合

熒光標(biāo)記配體飽和結(jié)合曲線（圖2A）顯示，熒光標(biāo)記配體與H6.52L，H6.52D和H6.52W突變型MOR特異結(jié)合的能力極弱，但可與Y7.43A，Y7.43F和Y7.43S突變型MOR特異結(jié)合，Kd值和Bmax值見表2。通常認(rèn)為，熒光標(biāo)記配體與突變型MOR結(jié)合的Kd值若處在野生型MOR的4倍Kd〔（13.1±1.5）nmol·L-1〕范圍內(nèi)則無明顯差異。實驗結(jié)果提示，Y7.43位點突變不改變熒光標(biāo)記配體與受體的結(jié)合。

熒光標(biāo)記競爭結(jié)合曲線（圖2B和2C）顯示，DAMGO、嗎啡與Y7.43A，Y7.43F和Y7.43S突變型MOR的競爭結(jié)合曲線相對于野生型MOR無變化。分別將DAMGO和嗎啡作用于Y7.43A，Y7.43F和Y7.43S突變型MOR后，與熒光標(biāo)記配體競爭的Ki值與作用于野生型MOR的Ki值比較（表2），均處在野生型MOR的4倍Ki范圍內(nèi)，提示Y7.43位點突變不改變DAMGO和嗎啡與MOR的親和力。

Fig.2 Site-mutations influence binding properties of fluorescent ligand with MOR.HEK293T cells were labeled in batch with SNAP-Lumi4-Tb and suspended in Tag-lite labeling buffer(TLB),then cells were divided into total binding,non-specific bind?ing and drug competitive binding groups.For total binding group,cells were incubated with fluorescent ligand(0.1-100 nmol·L-1)in TLB.Non-specific binding signal wells were incubated with 100 nmol·L-1naltrindole and fluorescent ligand(0.1-100 nmol·L-11).For drug competitive binding group,cells were incubated with DAMGO and morphine(10-14-10-4mol·L-1)in the presence of 8 nmol·L-1flu?orescent ligand.The fluorescence intensity(FI)at 665 nm and 615 nm was detected after 3 h incubation.A：fluorescent ligand satura?tion binding of wild-type（WT）and mutant MOR；B：homogeneous time-resolved fluorescence（HTRF）competition binding of fluores?cent ligands to DAMGO；C：HTRF competition binding of fluorescent ligands to morphine.The fluorescent ligand is a naltrexone deriva?tive with red fluorescent probe.HTRF ratio=FI665 nm/FI615 nm×104.±s，n=3.

Tab.2 Saturated binding parameters and competitive binding constants

2.3 配體對MOR下游腺苷酸(adenylic acid,AC)-環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)通路的激活

GloSensor cAMP實驗通過測定cAMP含量變化來反映藥物作用于MOR后對下游AC-cAMP通路的激活程度。DAMGO和嗎啡作用于H6.52突變型MOR后，與其作用于野生型MOR相比，量效曲線均右移（圖3A和3B）。H6.52L，H6.52D和H6.52W 3種突變型MOR均減弱了DAMGO和嗎啡刺激下的AC-cAMP通路激活，其中H6.52L極大程度地減弱嗎啡刺激下AC-cAMP通路的激活，由量效曲線計算得出的EC50和Emax值見表3。

Tab.3 Activation parameters of test agonists to stimulate MOR-mediated G-protein-dependent signaling

Fig.3 Effcet of DAMGO and morphine on forskolin-stimulated cAMP accumulation in H6.52 and Y7.43 mutant MOR.HEK293T cells were divided into blank，forskolin and drug groups.Drug groups were treated with DAMGO or morphine（10-12-10-4mol·L-1），forskolin and drug groups were treated with forskolin（10-5mol·L-1）sequentially for 20 min，then luminescence intensity（LI）was detected.cAMP inhibition（%）=（LI of forskolin group-LI of drug group）/（LI of forskolin group-LI of blank group）×100%.±s，n=3.

Y7.43A，Y7.43F和Y7.43S突變明顯減弱DAMGO對MOR下游AC-cAMP通路的激活，其中Y7.43A和Y7.43S減弱MOR下游通路激活的程度強于Y7.43F（P＜0.01）；Y7.43突變后不改變嗎啡對MOR下游AC-cAMP通路的激活（圖3C和3D），Y7.43A，Y7.43F和Y7.43S 3種突變型對MOR下游AC-cAMP通路的激活程度基本一致，由量效曲線計算得出的EC50和Emax值見表3。

2.4 配體激活MOR下游 β-制動蛋白2的招募

利用NanoBit蛋白相互作用分析方法檢測MOR和β-制動蛋白2的相互作用，反映MOR下游β-制動蛋白依賴性信號通路的激活程度。H6.52和Y7.43突變阻斷了DAMGO和嗎啡對MOR下游β-制動蛋白依賴性信號通路的激活。DAMGO作用于野生型MOR后會引起下游β-制動蛋白依賴性信號通路的激活，其EC50值為（1184±112）nmol·L-1，而H6.52和Y7.43突變后均大幅度減弱該通路的激活（圖4A）；嗎啡作用于野生型MOR后未引起下游β-制動蛋白依賴性信號通路的激活，H6.52和Y7.43突變后該通路仍保持未激活狀態(tài)（圖4B）。

Fig.4 Functional activity of test agonists to stimulate MOR-mediated β-arrestin-dependent signaling.HEK293T cells were divided into blank group and drug groups.Drug groups were treated with DAMGO or morphine（10-12-10-4mol·L-1）for 15 min，then LI was detected.A：DAMGO reduced β-arrestin 2 recruitment in H6.52 and Y7.43 mutant MOR；B：morphine did not change β-arrestin 2 recruitment in H6.52 and Y7.43 mutant MOR compared with WT.β-Arrestin 2 recruiment=LI of drug group-LI of blank group.±s，n=3.

3 討論

本研究結(jié)果表明，Y7.43突變后，相較于野生型MOR，DAMGO和嗎啡對β-制動蛋白2的招募消失。2014年Hothersall團隊從MOR激動劑與受體結(jié)合的機制著手，首次研究了MOR的關(guān)鍵氨基酸殘基Y7.43在影響信號通路中的作用，結(jié)果證實嗎啡不能引起WT和Y7.43F突變型MOR下游β-制動蛋白依賴性信號通路的激活［10］，這與本研究得到的結(jié)論一致，提示Y7.43位點對于穩(wěn)定β-制動蛋白2偶聯(lián)的活性受體構(gòu)象具有重要作用。該結(jié)論在膽囊收縮素2受體的研究結(jié)果中同樣得到證實［11］。

另外，在氨基酸位點突變時，本研究考察了氨基酸的酸堿性、親水親脂性和位阻3個因素在影響藥物與MOR結(jié)合中可能發(fā)揮的重要作用。例如，將H6.52突變?yōu)長，D和W 3種氨基酸，是將組氨酸的咪唑側(cè)鏈替換為直鏈氨基酸、酸性氨基酸和具有增大位阻功能的吲哚基團；將Y7.43突變?yōu)锳，F(xiàn)和S 3種氨基酸，是將酪氨酸的R基替換為甲基、苯環(huán)和羥甲基。

在化合物與MOR結(jié)合層面，本研究結(jié)果表明，H6.52突變使得DAMGO和嗎啡均不能與MOR結(jié)合，而Y7.43突變后不改變DAMGO和嗎啡與MOR的結(jié)合，表明H6.52是影響DAMGO和嗎啡與MOR結(jié)合的位點。綜合配體、受體結(jié)合后產(chǎn)生的效應(yīng)和配體、受體分子對接結(jié)果分析得出，DAMGO與MOR分子對接時，DAMGO苯環(huán)上的酚羥基與D3.32 R基的羰基氧形成氫鍵，Y7.43的酚羥基與D3.32的羰基氧形成氫鍵，即形成3-7鎖；嗎啡與MOR分子對接時，嗎啡結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的羥基通過水橋同時與H6.52的咪唑側(cè)鏈和K5.39的羧基氧相互作用，因此存在較復(fù)雜的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，此外，Y7.43的酚羥基也與D3.32的羰基氧形成氫鍵，體系中存在3-7鎖。信號通路活性測定實驗結(jié)果表明，DAMGO和嗎啡均減弱下游G蛋白和β-制動蛋白通路的激活程度，推測H6.52位點通過影響DAMGO和嗎啡與MOR的結(jié)合來發(fā)揮作用，同時氫鍵網(wǎng)絡(luò)也可能參與其中；相對于H6.52D和H6.52W，H6.52L幾乎阻斷了DAMGO和嗎啡對下游G蛋白依賴性信號通路的激活，推測H6.52位點突變?yōu)榱涟彼嶙钄嗔嗽M氨酸的咪唑環(huán)與配體小分子的氫鍵作用。當(dāng)Y7.43位點突變后，使得體系中不存在3-7鎖，細(xì)胞實驗結(jié)果表明，Y7.43位點突變后，較野生型相比，DAMGO和嗎啡減弱MOR下游G蛋白和β-制動蛋白通路的激活效應(yīng)，由此推測3-7鎖是影響G蛋白和β-制動蛋白依賴性信號通路激活的關(guān)鍵因素，而對于嗎啡不激活野生型MOR下游β-制動蛋白依賴性信號通路，推測可能存在其他的相互作用參與此信號通路的激活，具體的作用機制還需要進一步的分子動力學(xué)模擬證實。

綜上所述，Y7.43是造成DAMGO和嗎啡對MOR下游信號通路差異性變化的位點，說明位點引起信號通路的變化不一定是位點干擾配體與受體的結(jié)合，而是不同的配體與受體具有不同的結(jié)合模式，即受體構(gòu)象學(xué)差異，因此，殘基在形成活性受體構(gòu)象中具有重要的作用，殘基突變則可以定性改變與配體結(jié)合后的受體激活方式。H6.52和Y7.43在一定程度上解釋了配體如何激活受體以及受體結(jié)合口袋在配體與效應(yīng)分子進行耦聯(lián)過程中所發(fā)揮的作用。