梁欣儀，王東旭，李茹柳，朱易平，時(shí)玉霞，胡 玲，陳蔚文

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心、脾胃研究所，廣東 廣州 510405）

脾虛證是多種胃腸病變的主要中醫(yī)證型之一，脾虛患者可見胃黏膜損傷［1］和小腸黏膜損傷［2］。臨床研究表明，益氣健脾中藥對(duì)胃和小腸黏膜病變有治療作用［3-4］，但作用機(jī)制尚未闡明。四君子湯源于宋代《太平惠民和劑局方》：“治榮衛(wèi)氣虛，臟腑怯弱，心腹脹滿，全不思食，腸鳴泄瀉，嘔噎吐逆，大宜服之”，是益氣健脾的代表方，臨床協(xié)助治療克羅恩病及潰瘍性結(jié)腸炎等有良好療效。小腸吸收功能障礙的脾虛患兒服用健脾粉（四君子湯加黃芪），脾虛癥狀可基本消失；木糖吸收率較低的脾虛患兒經(jīng)此治療后，臨床癥狀和木糖吸收率亦有改善［5］。臨床運(yùn)用四君子湯加黃芪為基礎(chǔ)方加減協(xié)助治療克羅恩病能有效緩解癥狀并改善生存質(zhì)量［4］。本課題組前期研究結(jié)果表明，四君子湯多糖（Sijunzi decoction polysaccharides，SJZDP）可作用于多胺及其調(diào)控的上皮細(xì)胞遷移和細(xì)胞連接等環(huán)節(jié)而起到胃腸黏膜保護(hù)作用，其中促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用與其影響多胺信號(hào)通路有關(guān)［6-7］。本研究以非甾體類抗炎藥物吲哚美辛制備大鼠小腸黏膜損傷模型，觀察四君子湯水提物（Sijunzi decoction aqueous extract，SJZDA）和SJZDP對(duì)小腸黏膜損傷的改善作用，并基于多胺及其調(diào)控機(jī)制探討其作用機(jī)制及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑和主要儀器

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體重180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格許可證：SCXK（粵）2018-0034；飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境，廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單位使用許可證：SYXK（粵）2018-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理檢查委員會(huì)審核（批準(zhǔn)號(hào)：2016084）。

五加科植物人參（PanaxginsengC.A.Mey.）的干燥根、菊科植物白術(shù)（Atractylodesmacro?cephalaKoidz.）的干燥根（炒制）成、多孔菌科真菌茯苓〔Poriacocos（Schw.）Wolf.〕的干燥菌核和豆科植物烏拉爾甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）的根（蜜炙），均購(gòu)于廣州同康藥業(yè)有限公司，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室童家赟副教授鑒定。

D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；色譜級(jí)甲醇和乙腈（德國(guó)Merck KGaA公司）；BCA蛋白定量試劑盒（中國(guó)KeyGEN BioTECH公司）；SDS-PAGE凝膠試劑盒（中國(guó)Beyotime公司）、鼠鏈霉卵白素-生物素法免疫組化試劑盒（SP-9001）、兔鏈霉卵白素-生物素法免疫組化試劑盒（SP-9002）和DAB試劑盒（北京中杉金橋公司）；吲哚美辛、腐胺、精胺和精脒（美國(guó)Sigma公司）；D-乳酸檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ATT Bioquest公司）；Ca2+定量分析試劑盒（C045FC，加拿大HCB公司）；小鼠抗大鼠E鈣黏蛋白（ab231303）、β連環(huán)蛋白（ab32572）、α連環(huán)蛋白（ab51032）和GAPDH單克隆抗體（ab181602）（英國(guó)Abcam公司）（一抗）；兔抗大鼠閉合蛋白（40-4700）、閉鎖小帶蛋白（61-7300）和封閉蛋白3多克隆抗體（PA5-16867）（美國(guó)Invitrogen公司）（一抗）；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體和生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗）（北京中杉金橋公司）。

UVmini-1240紫外分光光度計(jì)和AUW120D型分析天平（日本島津公司）；E2695高效液相色譜（HPLC）儀和2414示差折光檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；3300 ELSD蒸發(fā)光檢測(cè)器（美國(guó)Alltech公司）；Waters Ultrahydrogel Linear Column色譜柱（7.8 mm×300 mm，美國(guó)Waters公司）；Hypersil ODS2色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，日本 Ecosil公司）；iMark酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；IX73型熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DNA Expert型多用途微量板檢測(cè)儀（奧地利Tecan公司）。

1.2 SJZDA制備和SJZDP提取、純化和檢測(cè)

人參、白術(shù)、茯苓和炙甘草各300 g，12倍體積純水常溫浸泡2 h后煎煮2 h，收集濾液；濾渣同法煎煮并收集濾液；合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，冷凍干燥，得SJZDA凍干粉425.0 g（得率35.4%）。

按上述步驟得1150 mL濾液，加4倍體積95%乙醇使之含醇為75%，4℃靜置過夜，布式漏斗抽濾，取沉淀加適量純水溶解；重復(fù)醇沉操作3次，末次沉淀加純水溶解，8400×g離心15 min，棄沉淀，得水提醇沉液3100 mL。取上液加1/3體積Severge去除蛋白，分液漏斗振蕩20 min，靜置8 h至分層，取水層。重復(fù)操作5次，末次水層5000×g離心10 min，取上清水層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至400 mL，冷凍干燥得SJZDP凍干粉83.1 g（得率7.2%）。苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖含量（以葡萄糖計(jì)）。

HPLC法檢測(cè)SJZDP多糖圖譜。SJZDP多糖樣品以超純水配成1.0 g·L-1，0.45 μm水系濾膜過濾，加入樣品瓶待測(cè)。色譜條件：Waters 2695色譜系統(tǒng)；2414示差折光檢測(cè)器（RID）；色譜柱：Waters色譜柱；檢測(cè)器靈敏度：4；流動(dòng)相：超純水；流速：0.6 mL·min-1；檢測(cè)器溫度：30℃；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3 動(dòng)物分組和給藥

SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分組，分為正常對(duì)照組（n=8）、模型對(duì)照組（n=16）、模型+SJZDA 5和15 g·kg-1組（n=12）及模型+SJZDP 0.358和1.074 g·kg-1組（n=12）。SJZDP 0.358和1.074 g分別相當(dāng)于SJZDA 5和15 g。大鼠造模前1 h，模型+SJZDA和模型+SJZDP組按10 mL·kg-1ig給予相應(yīng)劑量SJZDA和SJZDP，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積純水；1 h后除正常對(duì)照組外，各組大鼠均按10 mL·kg-1皮下注射吲哚美辛6 mg·kg-1；SJZDA、SJZDP和吲哚美辛均每天1次，共6 d。末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，ip給予10%水合氯醛麻醉，取腹主動(dòng)脈血置肝素鈉抗凝離心管，5500×g離心15 min，取上清，-80℃保存；摘除小腸并剪開，冰生理鹽水沖洗，觀察小腸黏膜大體損傷，拍照并評(píng)分；沿幽門向下約20 cm取損傷較明顯的小腸約10 cm，在黏膜損傷明顯處取2～3 cm小腸置4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。余小腸冰上用載玻片刮取黏膜，凍存管收集，先置于液氮，取材結(jié)束后移至-80℃保存。

1.4 小腸黏膜損傷大體評(píng)分［8］和組織病理評(píng)分［9］

按潰瘍和黏連分別評(píng)分，總分為兩者之和。潰瘍大體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，未出現(xiàn)明顯損傷；1分，局部充血、水腫但未出現(xiàn)潰瘍；2分，有潰瘍，但不伴黏膜明顯充血、水腫等炎癥表現(xiàn)和腸壁增厚；3分，一處黏膜有潰瘍伴炎癥，潰瘍＜1 cm；4分，有多處潰瘍伴炎癥，潰瘍＜1 cm；5分，有多處潰瘍伴炎癥，至少一處潰瘍＞1 cm；若潰瘍和（或）炎癥＞2 cm，病變范圍每增加1 cm，計(jì)分加1分。黏連評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無黏連；1分，黏連較輕，少許力量可將小腸與其他組織分開；2分，黏連較重。

顯微鏡下觀察小腸組織病理變化。0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，并伴有毛細(xì)血管充血；2分：上皮下間隙擴(kuò)大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴(kuò)張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細(xì)胞變性、壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落；4分：上皮細(xì)胞層變性壞死、脫落，部分絨毛脫落、固有層裸露，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血；5分：絨毛脫落，固有層崩解，出血或潰瘍形成。

1.5 柱前衍生HPLC法檢測(cè)小腸黏膜多胺含量［10］

多胺對(duì)照品配制：稱取腐胺0.041 g、精脒0.0255 g和精胺0.0238 g，分別加入色譜甲醇溶解，定容于50 mL，得腐胺、精脒和精胺分別為9.3×10-3，3.51×10-3和2.35×10-3mol·L-1的單一對(duì)照品溶液；再各取1 mL分別加色譜甲醇定容于100 mL，得腐胺、精脒和精胺分別為9.3×10-5，3.51×10-5和2.35×10-5mol·L-1的對(duì)照品。

BCA法檢測(cè)黏膜組織蛋白質(zhì)含量：稱取待測(cè)小腸黏膜組織，加入RIPA裂解液和PMSF冰上勻漿，冰上放置30 min，4℃，12 000×g離心15 min，取上清液；設(shè)3復(fù)孔，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算黏膜組織蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量（mg·g-1組織）=（黏膜組織勻漿蛋白質(zhì)濃度×對(duì)應(yīng)裂解液體積）/黏膜組織質(zhì)量。

小腸黏膜組織多胺含量測(cè)定：稱取約0.2 g小腸黏膜組織，加5%冷高氯酸1.5 mL，3000×g離心10 min，吸取上清液和多胺對(duì)照液各1 mL，分別加入2 mol·L-1NaOH 1 mL和苯甲酰氯8 μL，渦旋混勻，靜置20 min；加入飽和NaCl和氯仿各2 mL，渦旋1 min，3000×g離心10 min；吸取下層有機(jī)相1.5 mL，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?0 mL EP管以0.5 mL流動(dòng)相〔甲醇：水=55：45（V/V）〕溶解；50℃水浴8 h，所得溶液加入NaOH 2 mol·L-1和氯仿各2 mL，渦旋混勻1 min；3000×g離心10 min，吸取1.5 mL下層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?；殘?jiān)?.5 mL流動(dòng)相溶解，0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，加入樣品瓶。色譜條件：Hypersil ODS2 色譜柱；柱溫 25℃；流速 1 mL·min-1；波長(zhǎng)234 nm；流動(dòng)相：甲醇：水=55∶45（V/V）。樣品測(cè)定：進(jìn)樣40 μL樣品，多胺標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)樣10，20，30，40，50，60和70 μL，繪制峰面積-多胺質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品多胺含量。多胺（腐胺、精脒或精胺）含量（nmol·g-1蛋白）=多胺的測(cè)定質(zhì)量/（黏膜質(zhì)量×黏膜組織勻漿蛋白質(zhì)含量）。

1.6 鄰甲酚酞絡(luò)合酮法檢測(cè)小腸黏膜組織Ca2+含量

BCA法測(cè)定小腸黏膜組織蛋白質(zhì)含量，按試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm讀取吸光度值（A450nm）。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品 0 μg·L-1的A450nm值為B0，其余各孔A450nm值為B，結(jié)合率（%）=B/B0×100%。以結(jié)合率（%）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg·L-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黏膜組織Ca2+含量（μg·L-1）。

1.7 Amplite熒光法測(cè)定血漿D-乳酸濃度

按D-乳酸測(cè)定試劑盒說明書操作，運(yùn)用DNA Expert型多用途微量板檢測(cè)儀檢測(cè)。發(fā)射波長(zhǎng)532 nm，激光波長(zhǎng)590 nm，讀取吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿D-乳酸濃度。

1.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小腸黏膜組織連接蛋白表達(dá)

小腸組織切片60℃加熱20 min，常規(guī)脫蠟、水化，放入0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液，微波爐加熱修復(fù)抗原，SP法阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，封閉后與相應(yīng)一抗（緊密連接蛋白：閉鎖小帶蛋白1∶200、閉合蛋白1∶100和封閉蛋白3 1∶100；黏附連接蛋白：E鈣黏蛋白1∶100、α連環(huán)蛋白1∶100和β連環(huán)蛋白1∶500）4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫 45 min；PBS 洗3次，每次5 min；室溫與二抗孵育15 min，沖洗后室溫與辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育15 min，PBS洗3次后DAB室溫顯色10 min，顯微鏡下控制染色程度。自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，自來水沖洗；常規(guī)脫水，中性樹膠封片、鏡檢。顯微鏡下見到胞膜和（或）胞漿出現(xiàn)棕黃色為待測(cè)蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性。每張切片選5個(gè)視野（200×）用Image Pro Plus軟件分析棕黃色積分吸光度（integrated absorbance，IA），平均吸光度（IA/目標(biāo)面積）表示待測(cè)蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SJZDP組成和多糖含量

HPLC測(cè)定結(jié)果（圖1）所示，SJZDP主要有5個(gè)吸收峰，最大吸收峰（峰4）為較狹窄的對(duì)稱峰，保留時(shí)間16.098 min，峰面積占79.2%，提示其為雜多糖。苯酚-硫酸法測(cè)得SJZDP多糖含量為81.6%。

Fig.1 High performance liquid chromatography(HPLC)image of Sijunzi decoction polysaccharides(SJZDP).SJZDP was extracted from Sijunzi decoction aqueous extract(SJZDA)via ethanol precipitation and severge deproteinization.

2.2 SJZDA和SJZDP對(duì)吲哚美辛所致大鼠小腸黏膜損傷的改善作用

2.2.1 小腸黏膜損傷大體評(píng)分

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型對(duì)照組大鼠死亡7只（7/16），模型+SJZDA 5和15 g·kg-1組分別死亡6只（6/12）和3只（3/12），模型+SJZDP 0.358和1.074 g·kg-1組分別死亡4只（4/12）和2只（2/12）。大鼠死亡原因均為小腸穿孔。

各組存活大鼠小腸黏膜損傷大體觀察（圖2）可見，正常對(duì)照組大鼠小腸腸管無黏連，腸黏膜未見明顯異常。模型對(duì)照組小腸腸管均有不同程度黏連，小腸黏膜充血、糜爛，部分腸段可見多發(fā)潰瘍?cè)?，大體評(píng)分較正常對(duì)照組明顯增高（P＜0.01），提示小腸黏膜損傷模型制備成功。模型+SJZDA 5和15 g·kg-1組小腸腸管黏連，黏膜充血；但前者部分腸段可見潰瘍，大體評(píng)分與模型對(duì)照組比較無顯著差異；后者無明顯潰瘍，大體評(píng)分較模型對(duì)照組下降（P＜0.01）。模型+SJZDP 0.358 和1.074 g·kg-1組小腸腸管有不同程度黏連，黏膜可見充血和水腫；前者部分大鼠小腸可見潰瘍形成，損傷評(píng)分較模型對(duì)照組降低（P＜0.05）；后者腸壁局部結(jié)節(jié)樣增厚，損傷評(píng)分較模型對(duì)照組降低更加明顯（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of SJZDA and SJZDP on small intestinal mucosal injuries of rats induced by indomethacin.The rat intestinal mucosal injury model was induced by injecting subcutaneously with indomethacin 6 mg·kg-1，once daily，for 6 d.The rats were ig given SJZDA（5 and 15 g·kg-1）or SJZDP（0.358 and 1.074 g·kg-1）1 h before injection of indomethacin，every day，except those in normal and model control groups.B was the intestinal mucosal injury score of A.±s，n=6-10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model control group.

2.2.2 小腸黏膜組織病理評(píng)分

如圖3所示，正常對(duì)照組大鼠小腸黏膜完整，腸絨毛上皮未見脫落。模型對(duì)照組小腸黏膜上皮變性、壞死，絨毛脫落，固有層崩解，潰瘍形成。模型+SJZDA 5 g·kg-1組小腸黏膜絨毛面上皮細(xì)胞脫落，固有層崩解，組織病理評(píng)分與模型對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；模型+SJZDA 15 g·kg-1組僅見小腸黏膜少數(shù)絨毛頂端上皮脫落，大部分絨毛面完整，組織病理評(píng)分降低（P＜0.01）。模型+SJZDP 0.358 g·kg-1組小腸黏膜部分絨毛面上皮細(xì)胞脫落，固有層裸露，組織病理評(píng)分降低（P＜0.05）；模型+SJZDP 1.074 g·kg-1組小腸黏膜絨毛面上皮細(xì)胞基本完整，僅見個(gè)別上皮細(xì)胞缺失，組織病理評(píng)分下降更為明顯（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of SJZDA and SJZDP on small intestinal mucosal pathological injuries of rats induced by indomethacin.See Fig.2 for the rat treatment.The arrows show areas of intestinal mucosal injury.B was intestinal mucosal injury path?ological scores of A.±s，n=6-10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model control group.

2.3 SJZDA和SJZDP對(duì)小腸黏膜損傷模型大鼠小腸黏膜組織多胺含量的影響

如表1所示，模型對(duì)照組大鼠小腸黏膜組織精脒含量較正常對(duì)照組降低（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，模型+SJZDA 15 g·kg-1、模型+SJZDP 0.358和1.074 g·kg-1組小腸黏膜組織精脒含量明顯提高（P＜0.05，P＜0.01）。各組腐胺和精胺含量均無明顯變化。

Tab.1 Effect of SJZDA and SJZDP on polyamines of intestinal mucosa tissue of rats with small intestinal mucosal injuries induced by indomethacin

2.4 SJZDA和SJZDP對(duì)小腸黏膜損傷模型大鼠小腸黏膜組織Ca2+含量的影響

如圖4所示，模型對(duì)照組大鼠小腸黏膜組織Ca2+含量較正常對(duì)照組無明顯變化；與模型對(duì)照組比較，模型+SJZDA 15 g·kg-1和模型+SJZDP 1.074 g·kg-1組小腸黏膜組織Ca2+含量明顯提高（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of SJZDA and SJZDP on Ca2+content of intestinal mucosa tissue of rats with small intestinal mucosal injuries induced by indomethacin.See Fig.2 for the rat treatment.Ca2+content was measured with O-cresol?phthalein complexone method.±s，n=6-10.＊P＜0.05，compared with model control group.

2.5 SJZDA和SJZDP對(duì)小腸黏膜損傷模型大鼠血漿D-乳酸濃度的影響

如圖5所示，模型對(duì)照組大鼠血漿D-乳酸濃度較正常對(duì)照組升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，模型+SJZDA 15 g·kg-1、模型+SJZDP 0.358 和1.074 g·kg-1組大鼠血漿D-乳酸水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.5 Effect of SJZDA and SJZDP on plasma D-lactate concentration of model rats with small intestinal mucosal injuries induced by indomethacin.See Fig.2 for the rat treatment.The D-lactate concentration in plasma was detected by Amplite fluorescence method.±s，n=6-10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model control group.

2.6 SJZDA和SJZDP對(duì)小腸黏膜損傷模型大鼠小腸黏膜組織連接蛋白表達(dá)的影響

如圖6和圖7所示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠小腸黏膜組織緊密連接蛋白（閉鎖小帶蛋白、閉合蛋白、封閉蛋白3）和黏附連接蛋白（E鈣黏蛋白和α連環(huán)蛋白）表達(dá)下降（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，模型+SJZDA 5和15 g·kg-1及模型+SJZDP 1.074 g·kg-1組小腸黏膜組織中閉鎖小帶蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；模型+SJZDP 0.358和1.074 g·kg-1組小腸黏膜組織中閉合蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；模型+SJZDA 15 g·kg-1、模型+SJZDP 0.358和1.074 g·kg-1組小腸黏膜組織中封閉蛋白3、E鈣黏蛋白和α連環(huán)蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；模型+SJZDA 15 g·kg-1和模型+SJZDP 1.074 g·kg-1組小腸黏膜組織中黏附連接蛋白β連環(huán)蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.6 Effect of SJZDA and SJZDP on expression of ZO-1（A），occludin（B）and claudin-3（C）of intestinal mucosa tissue of model rats with small intestinal mucosal injuries induced by indomethacin.See Fig.2 for the rat treatment.The arrows showed positive expressions of the tested proteins.The expression levels of the tested proteins were indicated by mean integrated absorbance.A2，B2 and C2 were the semi-quantitative results of A1，B1 and C1，respectively.±s，n=6-10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model control group.

Fig.7 Effect of SJZDA and SJZDP on expressions of E-cadherin（A），α-catenin（B）and β-catenin（C）of intestinal mucosa tissue of rats with small intestinal mucosal injuries induced by indomethacin.See Fig.2 for the rat treatment.The arrows show positive expressions of the tested proteins.A2，B2 and C2 were the semi-quantitative results of A1，B1 and C1，respec?tively.±s，n=6-10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model control group.

3 討論

本研究制備吲哚美辛皮下注射誘導(dǎo)小腸黏膜損傷大鼠模型，觀察了SJZDA和SJZDP對(duì)小腸黏膜損傷的改善作用。研究結(jié)果表明，SJZDA 15 g·kg-1、SJZDP 0.358和1.074 g·kg-1可明顯減輕模型大鼠小腸腸管黏連、黏膜充血和潰瘍等小腸黏膜大體損傷，而且可改善模型大鼠小腸黏膜絨毛面上皮細(xì)胞脫落等小腸黏膜組織的病理改變，提示SJZDA和SJZDP對(duì)吲哚美辛誘導(dǎo)大鼠小腸黏膜損傷具有改善作用。

緊密連接和黏附連接作為細(xì)胞連接的主要元件是腸黏膜上皮屏障的關(guān)鍵構(gòu)成部分，對(duì)維護(hù)腸屏障功能起重要作用。功能性消化不良患者十二指腸黏膜緊密連接蛋白明顯減少，導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷從而引起腸黏膜損傷［12］。以E鈣黏蛋白為基礎(chǔ)的黏附連接對(duì)調(diào)節(jié)腸上皮穩(wěn)態(tài)過程（如刷狀緣的建立、上皮細(xì)胞遷移和增殖）有重要作用［13］。多胺對(duì)緊密連接和黏附連接的形成和穩(wěn)定起重要作用，多胺耗竭能降低小腸上皮細(xì)胞緊密連接和黏附連接蛋白表達(dá)而致上皮屏障異常［14-15］。多胺還對(duì)腸黏膜損傷其他修復(fù)環(huán)節(jié)如上皮細(xì)胞遷移、增殖及黏膜重建發(fā)揮重要作用［16］，其中Ca2+調(diào)節(jié)在多胺介導(dǎo)的信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，Ca2+升高可促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞遷移及黏膜修復(fù)［17］。E鈣黏蛋白表達(dá)依賴Ca2+，多胺通過提高Ca2+水平而促進(jìn)E-鈣黏蛋白和β連環(huán)蛋白表達(dá)［18］。

為此，本研究從多胺及其調(diào)控機(jī)制方面探討SJZDA和SJZDP改善模型大鼠小腸黏膜損傷的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，SJZDA和SJZDP可提高模型大鼠小腸黏膜組織多胺（精脒）含量和Ca2+水平，改善腸道通透性（降低血漿D-乳酸水平），并增加小腸黏膜組織緊密連接蛋白（閉鎖小帶蛋白、閉合蛋白和封閉蛋白3）和黏附連接蛋白（E鈣黏蛋白、α連環(huán)蛋白和β連環(huán)蛋白）的表達(dá)。本課題組前期觀察了四君子湯對(duì)吲哚美辛所致大鼠胃黏膜損傷的影響，研究結(jié)果與本研究結(jié)果相符［19］。另外，本課題組前期用小腸上皮細(xì)胞（IEC-6）研究亦表明，黨參、白術(shù)、黃芪和甘草提取物（多糖或黃酮或皂苷等）可通過多胺及其調(diào)控的上皮細(xì)胞增殖、遷移、分化和細(xì)胞連接等環(huán)節(jié)而發(fā)揮對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用［20-26］。

多糖是中藥發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。SJZDP 0.358和1.074 g·kg-1相當(dāng)于四君子湯復(fù)方生藥5和15 g·kg-1，對(duì)吲哚美辛導(dǎo)致的小腸黏膜損傷均有改善作用，進(jìn)一步表明SJZDP為四君子湯發(fā)揮小腸黏膜損傷改善作用的有效組分。

綜上提示，多胺及其調(diào)控的信號(hào)通路可能是SJZDA和SJZDP改善小腸黏膜損傷的作用靶點(diǎn)之一，SJZDP是四君子湯發(fā)揮該作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。本研究為探討四君子湯胃腸黏膜保護(hù)作用及其機(jī)制提供了參考，為臨床選擇益氣健脾復(fù)方用于防治非甾體類抗炎藥物所致小腸黏膜損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。