張彥瑾，劉宇軒，單煜恒，聶志勇，王永安

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科，北京 100853）

一氧化二氮（nitrous oxide，N2O）俗稱“笑氣”，是使用最廣泛的麻醉劑［1］，因麻醉效力低，早期在牙科手術(shù)中常作為麻醉輔助劑與其他麻醉藥聯(lián)用［2］。由于吸入N2O可引起成癮、致幻和欣快感［3］，N2O已成為一種濫用的吸入藥物［4］。根據(jù)2016年全球藥物調(diào)查結(jié)果［5］，N2O已經(jīng)成為第七大最常濫用的藥物。濫用N2O可中毒，最終出現(xiàn)不可逆的神經(jīng)損傷，但其致傷機(jī)制仍不明確。近年來(lái)，N2O濫用在我國(guó)也越來(lái)越嚴(yán)重，臨床病例逐漸增加。因此，開(kāi)展N2O吸入致傷效應(yīng)、機(jī)制及防治措施研究具有重要意義。建立N2O全身暴露動(dòng)態(tài)吸入裝置，是實(shí)現(xiàn)模擬N2O吸入評(píng)價(jià)的支撐和基礎(chǔ)。

N2O的致幻和致欣快作用與腦電和心電等電生理指標(biāo)密切相關(guān)。電生理遙測(cè)技術(shù)可從有意識(shí)自由活動(dòng)的機(jī)體中獲取生物信號(hào)，經(jīng)接收器將模擬頻率信號(hào)轉(zhuǎn)換成可分析的電生理信號(hào)［6］。無(wú)線遙測(cè)技術(shù)可最大程度地減少實(shí)驗(yàn)環(huán)境的干擾，還原機(jī)體真實(shí)的生理體征變化，現(xiàn)已被應(yīng)用于多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行血壓［7］、心率、心電圖（electrocardiogram，ECG）、腦電圖（electroencephalogram，EEG）［8］和體溫等數(shù)據(jù)的采集。因而，建立模擬N2O動(dòng)態(tài)吸入暴露的裝置，并實(shí)現(xiàn)與損傷效應(yīng)實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)（如電生理遙測(cè)）技術(shù)的聯(lián)用，是探討吸入N2O對(duì)大鼠產(chǎn)生影響的一種有效手段。

目前，對(duì)于吸入N2O如何致大鼠電生理指標(biāo)變化仍不清楚，大多是基于N2O與其他鎮(zhèn)靜和麻醉藥物同時(shí)使用情況下的研究［9］，可能改變或混淆N2O特有的生理學(xué)特征。本研究通過(guò)建立全身暴露動(dòng)態(tài)吸入N2O裝置并與電生理遙測(cè)技術(shù)聯(lián)用，對(duì)清醒自由活動(dòng)大鼠血壓、體溫、心電以及腦電進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，考察吸入N2O對(duì)大鼠電生理指標(biāo)的影響，探討N2O致傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

SD大鼠，雄性，體重200～220 g，購(gòu)自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)在恒溫動(dòng)物房中（約25℃），12/12 h光黑交替，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水。手術(shù)前12 h禁食，麻醉后進(jìn)行遙測(cè)植入子的植入手術(shù)，手術(shù)后單籠飼養(yǎng)，待其恢復(fù)后進(jìn)行N2O吸入實(shí)驗(yàn)。本研究涉及與動(dòng)物相關(guān)的內(nèi)容和程序都遵循軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定（編號(hào)：IACUC-2020-108）。N2O（純度：99.999%），北京北氧聯(lián)合氣體有限公司；O2（純度：99.999%），北京環(huán)宇京輝京城氣體科技有限公司；注射用青霉素鈉（批號(hào)：0171909304），中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司；戊巴比妥鈉（批號(hào)：140828），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.9%氯化鈉注射液（批號(hào)：2006103205），石家莊四藥集團(tuán)有限公司；碘伏（批號(hào)：200621），山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司。單臂數(shù)顯腦立體定位儀（ZS-FD），北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；DSI植入式生理信號(hào)無(wú)線遙測(cè)系統(tǒng)〔包括TL11M2-C50-PXT型植入子、TL10M3-F50-EEE型植入子、RPC信號(hào)接收器（RPC-1）、環(huán)境壓力參考裝置（APR-1）、數(shù)據(jù)交換矩陣（DEM 6607）、Ponemah Physiology Platform電生理數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)以及Neuroscore腦電信號(hào)分析系統(tǒng)〕，美國(guó)DSI公司；流量控制器（Red-y smart）和GET RED-y 5氣體流速控制系統(tǒng)，瑞士福特林公司；DACO控制軟件和空氣壓縮機(jī)（GX4 FF），德國(guó)TSE公司。

1.2 大鼠全身暴露動(dòng)態(tài)吸入裝置的構(gòu)建

首先建立全身暴露動(dòng)態(tài)吸入N2O裝置（圖1），包括氣體供給單元、動(dòng)物暴露單元、氣體過(guò)濾處理單元和控制單元等。氣體供給單元包括空氣壓縮機(jī)、N2O氣體鋼瓶和O2氣體鋼瓶等。動(dòng)物暴露單元是指用于動(dòng)物吸入及氣體濃度監(jiān)測(cè)的暴露艙，其采用符合空氣動(dòng)力學(xué)原理的圓錐體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，能夠使氣體得到均勻的釋放，且整個(gè)暴露艙體積約為15 L，可使氣體快速達(dá)到平衡；暴露艙上端設(shè)有進(jìn)氣口、采樣口、傳感檢測(cè)器接口等，下端設(shè)有出氣口，并預(yù)留電生理遙測(cè)接收器所需空間，暴露艙采用電生理遙測(cè)信號(hào)能夠穿透的有機(jī)玻璃（聚甲基丙烯酸甲酯）構(gòu)建，保證了與電生理遙測(cè)儀的聯(lián)用。氣體過(guò)濾處理單元包括真空泵及廢氣吸附與凈化器等，其中真空泵用于將暴露艙內(nèi)氣體抽出，以形成動(dòng)態(tài)的氣體吸入（給藥）環(huán)境，廢氣吸附與凈化器用于氣體凈化。控制單元包括流量控制器及多通轉(zhuǎn)接頭等，用于氣體流速和流量精準(zhǔn)控制。

Fig.1 Schematic diagram of nitrous oxide（N2O）whole-body dynamic inhalation exposure device for rats.

1.3 遙測(cè)模型的制備

1.3.1 心電和血壓遙測(cè)模型

使用TL11M2-C50-PXT型植入子，在潔凈保溫?zé)o菌環(huán)境下，大鼠ip給予2%戊巴比妥鈉60 mg·kg-1麻醉，切開(kāi)腹部皮膚和肌肉，分離腹主動(dòng)脈，將血壓導(dǎo)管插入腹主動(dòng)脈內(nèi)，將2根心電電極的正極置于大鼠劍狀軟骨左側(cè)1.5～2.0 cm處的肌肉表面，負(fù)極置于大鼠右側(cè)胸肌部位肌肉表面，調(diào)整心電電極線長(zhǎng)度，用結(jié)扎線固定于相應(yīng)位置?？p合皮膚，碘伏消毒。

1.3.2 腦電遙測(cè)模型

使用TL10M3-F50-EEE型植入子，大鼠采用1.3.1方法麻醉大鼠后固定于腦立體定位儀上，切開(kāi)背部皮膚，將腦電植入子固定于皮下；切開(kāi)頭部皮膚，在矢狀縫左側(cè)約2 mm，分別距前鹵下方、后鹵上方各約2 mm處將1導(dǎo)聯(lián)的1對(duì)電極彎曲放置在左鉆孔內(nèi)；在矢狀縫右側(cè)約2 mm，分別距前鹵上方約2 mm和距冠狀縫和人字縫中點(diǎn)位置，將2導(dǎo)聯(lián)1對(duì)電極彎曲放置在右側(cè)鉆孔內(nèi)；調(diào)整3導(dǎo)聯(lián)的1對(duì)電極線長(zhǎng)度，用結(jié)扎線固定于頭夾肌相應(yīng)位置。縫合皮膚，碘伏消毒。

1.3.3 術(shù)后恢復(fù)

手術(shù)后，置大鼠于保溫狀態(tài)下直至完全蘇醒。所有大鼠均單獨(dú)飼養(yǎng)，并ip給予青霉素鈉（用氯化鈉注射液配成母液2×108U·L-1）4×105U·kg-1，每天1次，連續(xù)3 d，待存活大鼠恢復(fù)正常狀態(tài)（一般在術(shù)后1周）、初步測(cè)試可獲取相應(yīng)信號(hào)后，分組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 全身暴露動(dòng)態(tài)吸入N2O

將心電、血壓模型大鼠和腦電模型大鼠各分為4組，分別為空氣對(duì)照組及30%，50%和70% N2O組，每組5只，染毒流速設(shè)置見(jiàn)表1。將模型大鼠置于染毒暴露艙中，通入空氣使其適應(yīng)環(huán)境，監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)變化，待大鼠各生理指標(biāo)處于正常穩(wěn)定狀態(tài)后，以每分種采集1次的頻率，連續(xù)采集6 h（吸入前2 h、吸入2 h、吸入后2 h）的行為狀態(tài)及血壓、體溫、心電和腦電參數(shù)等生理數(shù)據(jù)。

核電站址資源豐富，開(kāi)發(fā)潛力大，是廣東省未來(lái)能源需求的重要來(lái)源?？紤]目前已明確核電項(xiàng)目廠址按照每個(gè)廠址6臺(tái)機(jī)組規(guī)模，后續(xù)新增核電暫按單機(jī)1 250 MW，以上廠址可裝機(jī)36 GW。另外，廣東省還儲(chǔ)備了一批核電廠址，按照每個(gè)廠址4臺(tái)機(jī)組規(guī)模，后續(xù)新增核電暫按單機(jī)1 250 MW，以上廠址可裝機(jī)20 GW。

Tab.1 Flow rate of nitrous oxide inhalation exposure

1.5 數(shù)據(jù)提取和指標(biāo)分析

基于采集到的電生理數(shù)據(jù)，利用Ponemah Physiology Platform軟件重點(diǎn)對(duì)心電、血壓遙測(cè)模型大鼠的心率（heart rate,HR）、R波、P波、T波、QT間期、QRS間期、PR間期、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）以及體溫（temperature，T）等數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和分析。利用Neuroscore軟件，重點(diǎn)對(duì)腦電遙測(cè)模型大鼠進(jìn)行功率譜分析，首先提取δ波（0.5～4 Hz）、θ波（4～8 Hz）、α波（8～12 Hz）、β波（12～30 Hz）和γ波（30～48 Hz）波段的絕對(duì)功率，而后進(jìn)行相對(duì)功率的分析。相對(duì)功率（%）=各功率帶（δ，θ，α，β和γ）的絕對(duì)功率/功率總和（δ+θ+α+β+γ）×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 吸入N2O對(duì)大鼠行為的影響

吸入N2O后，大鼠變得警覺(jué)、急躁，出現(xiàn)站立攀爬現(xiàn)象，隨后出現(xiàn)后肢無(wú)力，無(wú)法站立、頻繁甩動(dòng)前肢情況；停止通入N2O后約5 min恢復(fù)正常狀態(tài)。

2.2 吸入N2O對(duì)大鼠血壓和體溫的影響

與空氣對(duì)照組相比，30% N2O組大鼠血壓在吸入N2O過(guò)程未出現(xiàn)明顯變化；50%組和70% N2O組吸入開(kāi)始后大鼠SBP（圖2A）、DBP（圖2B）和MAP（圖2C）均上升（P＜0.05），且隨N2O濃度的增加而增加（r分別為0.897，0.932和0.916）。由實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)血壓圖（圖2D）也可看出，與空氣對(duì)照組相比，吸入N2O大鼠血壓隨N2O吸入濃度的增加而增加。

Fig.2 Blood pressure in response to nitrous oxide in rats.Rats were exposed to air,30%,50% and 70% N2O separately，and data were collected once per minute for continuous 6 h.-120-0 min，2 h before inhalation of N2O；0-120 min，inhaled N2O for 2 h；120-240 min，2 h after inalation of N2O.A：systolic blood pressure（SBP）recorded for 6 h.B：diastolic blood pressure（DBP）recorded for 6 h.C：mean arterial pressure（MAP）recorded for 6 h.D：typical graph of blood pressure（BP）changes in 2 sec.1 mmHg=0.133 kPa.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding air control group.

圖3中可以看出，與空氣對(duì)照組相比，30% N2O組大鼠T未出現(xiàn)顯著性差異；50%和70% N2O組T顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），且T隨N2O吸入濃度的增加而降低（r=-0.970）；吸入結(jié)束后，T均逐漸恢復(fù)至正常狀態(tài)。

Fig.3 Effect of nitrous oxide inhalation on body temperature of rats.See Fig.2 for the rat treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding air control group.

2.3 吸入N2O對(duì)大鼠心電指標(biāo)的影響

與空氣對(duì)照組相比，30% N2O組大鼠各心電指標(biāo)在吸入N2O過(guò)程中均無(wú)明顯變化；50%和70% N2O組心率、R波、P波和T波均顯著上升（P＜0.05）（圖4A～D），且隨N2O濃度的增加而增加（r分別為0.955，0.950，0.932和0.908）；QT間期顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）（圖4E），且隨N2O濃度增加而降低（r=-0.949）；QRS間期和PR間期均未出現(xiàn)顯著變化（圖4F和G）。從圖4A可以看出，50%和70% N2O組大鼠心率在吸入開(kāi)始后出現(xiàn)上升；吸入N2O約40 min達(dá)最高值，隨后保持穩(wěn)定；吸入結(jié)束后約10min恢復(fù)正常水平。由大鼠心電圖（圖4H）可見(jiàn)，與空氣對(duì)照組相比，隨N2O濃度的增加，大鼠心率間期縮短、心率加快，同時(shí)R波、P波和T波振幅增加（圖4B～4D）。

Fig.4 Electrocardiogram activity in response to nitrous oxide in rats.See Fig.2 for the rat treatment.A：HR（heart rate）；B：R wave；C：P wave；D：T wave；E：QT interval；F：QRS interval；G：PR interval；H：voltage.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，com?pared with corresponding air control group.

2.4 吸入N2O對(duì)大鼠腦電指標(biāo)的影響

Fig.5 Electroencephalogram activity in response to nitrous oxide in rats.See Fig.2 for the rat treatment.A1-E1：repre?sentative waveforms of δ，θ，α，β and γ wave，respectively.A2-E2:absolute power values of waves in A1-E1.Relative power（%）=P（δ，θ，α，β，γ）/P（δ+θ+α+β+γ）×100%.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding air control group.

3 討論

本研究基于空氣動(dòng)力學(xué)原理、采用可被電生理遙測(cè)信號(hào)穿透的有機(jī)玻璃，成功建立了大鼠全身暴露動(dòng)態(tài)吸入N2O模型與電生理遙測(cè)的聯(lián)用系統(tǒng)，為吸入N2O致傷機(jī)制提供了技術(shù)平臺(tái)和支撐。另外，本研究考慮到雌性大鼠有發(fā)情周期，激素的周期性變化可能會(huì)對(duì)電生理指標(biāo)產(chǎn)生影響，為保證單一變量并排除無(wú)關(guān)因素的影響，本研究選擇雄性大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

N2O致心率和血壓升高現(xiàn)象可能是因?yàn)镹2O作為N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體拮抗劑，可以抑制γ-氨基丁酸（γ-amino?butyric acid，GABA）能神經(jīng)元上的NMDA受體，使GABA能抑制作用下調(diào)［10］，激活多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元興奮性信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而激活腦內(nèi)獎(jiǎng)賞系統(tǒng)，使中腦邊緣系統(tǒng)DA濃度增加而產(chǎn)生欣快感［11］。腦內(nèi)DA激動(dòng)交感神經(jīng)，使交感神經(jīng)興奮，易引起心率加快、血壓升高［12］，這與本研究結(jié)果相符。另外，QT間期代表心室開(kāi)始興奮去極化至完全復(fù)極化所經(jīng)歷的時(shí)間，QT間期的長(zhǎng)短與心率呈負(fù)相關(guān)，即心率越快，QT間期越短，也進(jìn)一步驗(yàn)證了大鼠吸入N2O使心率加快。而腦內(nèi)DA濃度增加可能也是吸入N2O致成癮的重要生物學(xué)基礎(chǔ)［13］。

吸入N2O后大鼠體溫降低。NMDA受體是谷氨酸受體的一個(gè)亞型，是配體門控受體復(fù)合物，參與學(xué)習(xí)記憶、體溫調(diào)節(jié)［14］、神經(jīng)退行性疾病等許多過(guò)程。NMDA受體與下丘腦中的溫度敏感神經(jīng)元密切相關(guān)，并通過(guò)內(nèi)源性谷氨酸敏感系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)體溫［15］。N2O作為NMDA受體拮抗劑則通過(guò)阻斷NMDA谷氨酸能受體，從而導(dǎo)致體溫的下降。

大腦節(jié)律性神經(jīng)活動(dòng)被認(rèn)為在認(rèn)知中起著基礎(chǔ)性的作用，腦電圖活動(dòng)以特定的頻段與認(rèn)知功能進(jìn)行聯(lián)系［16］。在腦電圖的不同腦電頻段中，θ波段的腦電活動(dòng)與記憶能力的關(guān)系最為密切［17］。本研究結(jié)果表明，大鼠吸入N2O后，θ波出現(xiàn)升高，并隨著N2O濃度的增加而增加，表明大鼠吸入N2O可能對(duì)記憶能力造成影響。α波活動(dòng)與記憶和注意力相關(guān)［18］，并隨著意識(shí)的喪失而出現(xiàn)α波消失現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明，大鼠吸入N2O后，α波隨著N2O濃度的增加而下降，這與Yamamura等［19］報(bào)道的受試者吸入N2O致α波的振幅和頻率降低一致。β波被認(rèn)為在感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能和注意力的維持中發(fā)揮作用［20］，γ波與感覺(jué)和非感覺(jué)區(qū)域的注意力和記憶有關(guān)［21］，且β波和γ波振幅均與學(xué)習(xí)記憶功能呈正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，大鼠吸入N2O后β波和γ波均降低，并隨著N2O濃度的增加而下降，表明吸入N2O可能會(huì)降低大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。因此，大鼠吸入N2O后引起不同腦電頻段的變化可能與吸入N2O致認(rèn)知障礙有關(guān)。

綜上，N2O吸入可致大鼠心率和血壓升高、體溫下降，對(duì)腦電波的節(jié)律性振蕩產(chǎn)生改變，均可能與N2O致成癮性和認(rèn)知障礙密切相關(guān)。