杜雨生，張 釗，何 新，3，陳乃宏

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是以黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元進(jìn)行性退變?yōu)橹饕±硖卣鞯纳窠?jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為震顫和肌強(qiáng)直等運(yùn)動(dòng)癥狀以及嗅覺減退和睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀，尚無理想的治療方法，給患者及家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)［1］。年齡因素是PD患病的重要的危險(xiǎn)因素，65歲以上人群PD患病率隨年齡的增加而上升［2］。隨著我國人口老齡化的到來，PD患者會(huì)持續(xù)增加，必將對(duì)社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

天麻（Gastrodiae Rhizoma）為我國傳統(tǒng)中藥，可用于治療頭痛眩暈、驚厥抽搐、手足不遂等病癥。在治療PD的常用中藥復(fù)方中，天麻常作為復(fù)方的核心藥物［3］?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天麻能夠改善PD模型動(dòng)物黑質(zhì)和紋狀體病理損傷及行為學(xué)障礙［4］。天麻活性成分20C（簡稱20C）是天麻中的一種聯(lián)芐類化合物。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，20C能夠改善魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡［5-6］，改善衣霉素誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷［7］，并可對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥模型產(chǎn)生抗炎作用［8］，顯示出很好的神經(jīng)保護(hù)作用。20C能夠改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）小鼠模型黑質(zhì)和紋狀體的病理損傷及行為異常，減少異常α突觸核蛋白的聚集及炎癥反應(yīng)［9］。但20C對(duì)PD軸突逆行性損傷是否具有改善作用尚未見報(bào)道。6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）可通過DA轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入DA能神經(jīng)元，在胞質(zhì)中引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［10］。本研究應(yīng)用6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷，并采用小鼠單側(cè)紋狀體腦立體定位注射6-OHDA的方法制備小鼠PD模型，分別檢測20C對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷和PD模型小鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

20C（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所植化室合成，純度98%，溶于二甲亞砜，母液濃度為 10 μmol·L-1；左旋多巴（levodopa，L-dopa）片（每片0.25 g，批號(hào)161201），北京曙光藥業(yè)有限責(zé)任公司；RPMI Medium 1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司；6-OHDA（162957-50 MG）、抗壞血酸（A4544-25G）、二甲亞砜、MTT和小鼠抗合成β肌動(dòng)蛋白N端肽單克隆抗體（F3022）均購自美國Sigma公司；牛血清白蛋白，瑞士Roche公司；小鼠抗人源酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）單克隆抗體（sc-25269），美國Santa Cruz公司；小鼠抗8-羥基鳥苷-牛血清白蛋白-酪蛋白偶聯(lián)物單克隆抗體（ab62623），美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗），美國KPL公司；DAB顯色劑，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑和ECL發(fā)光液，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Hoechst 33342，日本DojinDo Labo?ratories公司；綠色熒光標(biāo)記驢抗小鼠IgG抗體（二抗），美國Life Technologies公司。

Fig.1 Chemical structure of 20C

超純水儀（型號(hào)Direct Q-8），美國Millipore公司；超低溫保存箱（型號(hào)DW-86L388A），中國Haier公司；電子天平（型號(hào)ME104），瑞士Mettmer Toledo公司；冷凍離心機(jī)（型號(hào)2-16PK），美國Sigma公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)1510），美國Thermo Fisher Sci?entific公司；顯微鏡（型號(hào)BX51），日本Olympus公司；激光共聚焦顯微鏡（型號(hào)LSM 710），德國Zeiss公司；倒置相差顯微鏡（型號(hào)Eclipse Ti-U），日本Nikon公司；腦立體定位儀（型號(hào)SA301），中國瑞沃德生命科技有限公司；冰凍切片機(jī)（型號(hào)CM3050S），德國Leica公司；化學(xué)發(fā)光成像分析儀（型號(hào)LAS 4000），美國GE公司；透射電子顯微鏡（型號(hào)H-7650），日本Hitachi公司。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12細(xì)胞），購自美國Type Culture Collection公司。PC12細(xì)胞使用含5%胎牛血清和10%馬血清的1640培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d傳代1次。

1.2.2 MTT法檢測PC12細(xì)胞存活率

PC12細(xì)胞以1.5×108L-1的密度接種于96孔板，每孔100 μL，24 h后單獨(dú)加入6-OHDA 100 μmol·L-1（模型組）或同時(shí)加入 6-OHDA 100 μmol·L-1和20C（0.01，0.10 或1.00 μmol·L-1，模型+20C 組），孵育6 h后小心吸去培養(yǎng)基，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μL，同時(shí)每孔加入5 g·L-1的MTT 10 μL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱，4 h后，每孔加三聯(lián)液（十二烷基磺酸鈉0.1 kg·L-1，HCl 0.01 mol·L-1，5% 異丙醇）100 μL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱，次日，在酶標(biāo)儀570 nm波長下檢測吸光度值（A570nm）。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，每組每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。存活率（%）=各組平均吸光度值/細(xì)胞對(duì)照組平均吸光度。

1.2.3 免疫熒光染色檢測細(xì)胞DNA和RNA氧化損傷

將圓形玻璃蓋玻片放入24孔板中，每孔加入PC12細(xì)胞懸液500 μL，細(xì)胞密度1.5×108L-1；培養(yǎng)24 h后加6-OHDA 100 μmol·L-1（模型組），或同時(shí)給予 6-OHDA 100 μmol·L-1和 20C 1.00 μmol·L-1（模型+20C組）每組3復(fù)孔，孵育6 h后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗；4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗；0.5%曲拉通X-100透化7 min，PBS清洗；5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉30 min；小鼠抗8-羥基鳥苷-牛血清白蛋白-酪蛋白偶聯(lián)物單克隆抗體（1∶200）4℃孵育過夜，PBS清洗；用熒光素標(biāo)記綠色熒光標(biāo)記驢抗小鼠 IgG抗體（二抗）孵育2 h，Hoechst 33342染細(xì)胞核，PBS清洗后封片。使用激光共聚焦顯微鏡獲得熒光圖片，Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，反映細(xì)胞DNA和RNA氧化損傷程度。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體重24～26 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于12 h：12 h晝夜交替空調(diào)房內(nèi)，室溫23～25℃，濕度50%～60%，自由進(jìn)食飲水，動(dòng)物適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)遵循中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與動(dòng)物福利倫理委員會(huì)規(guī)定（編號(hào)：00005246）。

1.3.2 小鼠單側(cè)紋狀體雙位點(diǎn)腦立體定位注射

腦定位注射參考Cheng等［11］的方法，注射位點(diǎn)的確定參考小鼠腦立體定位圖譜［12］。小鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，6-OHDA溶液濃度為3 g·L-1（使用0.02%抗壞血酸生理鹽水溶解），左側(cè)紋狀體注射位點(diǎn)1：前囟前1.0 mm，中線左旁開2.1 mm，硬膜下2.9 mm；注射位點(diǎn)2：前囟后0.3 mm，中線左，旁開2.3 mm，硬膜下2.9 mm。每位點(diǎn)注射2 μL，注射速度為0.5 μL·min-1，留針4 min。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組和給藥

小鼠腦定位注射后休息3周，第4周開始分組給藥。小鼠分為正常對(duì)照組（按照1.3.2方法注射等體積生理鹽水）、模型組（按照1.3.2方法注射6-OHDA造模）、模型+L-dopa組（造模后第4周開始ig給予L-dopa 40 mg·kg-1）和模型+20C組（造模后第4周開始ig給予20C 100 mg·kg-1［9］），每組8只。L-dopa和20C均以0.5%羧甲纖維素鈉配制成均一混懸液，給藥容積為0.01 mL·g-1；正常對(duì)照組和模型組ig給予同體積溶劑。每天相同時(shí)間給藥1次，連續(xù)給藥4周。

1.3.4 免疫組化染色法觀察紋狀體和黑質(zhì)區(qū)TH表達(dá)

小鼠分組給藥（同1.3.3）后麻醉，灌流，取腦，在冰凍切片機(jī)上將紋狀體和黑質(zhì)部位切取厚度為20 μm的組織切片。使用枸櫞酸鹽緩沖液對(duì)紋狀體和黑質(zhì)組織冰凍切片進(jìn)行高溫抗原修復(fù)10 min，冷卻至室溫，PBS清洗3次；0.5%曲拉通X-100透化15 min，PBS清洗3次；3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，PBS清洗3次；5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉30 min，加抗TH抗體（1∶500）4℃孵育過夜；含0.1%吐溫20的PBS（PBS-T）溶液清洗3次；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（二抗）（稀釋比例1∶400）室溫孵育2 h，PBS-T溶液清洗3次；DAB顯色，自來水終止顯色，梯度脫水、中性樹脂封片。使用Olympus BX51顯微照相系統(tǒng)拍照。

1.3.5 Western印跡法檢測黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)水平

取分組給藥（同1.3.3）后的小鼠注射側(cè)的黑質(zhì)組織，稱重，組織勻漿機(jī)勻漿，組織裂解液冰浴裂解30 min，冷凍離心機(jī)4℃，12 000×g離心30 min，吸取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。剩余上清液中加入上樣緩沖液，100℃水浴變性10 min，-20℃保存。10% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，之后蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，用3%牛血清白蛋白溶液室溫封閉2 h，加入一抗〔TH（1∶500）、β-肌動(dòng)蛋白（1∶5000）〕，4℃孵育過夜。用TBS-T溶液洗滌3次，每次10 min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（二抗）（1∶5000）室溫孵育2 h，TBS-T溶液洗滌3次，每次10 min；化學(xué)發(fā)光成像分析儀顯示蛋白條帶；Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度值。

1.3.6 透射電鏡檢測黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷

小鼠分組給藥（同1.3.3）后麻醉，灌流，取腦，在黑質(zhì)部位切取1 mm3立方體，用2.5%戊二醛固定2 h；用PBS溶液洗滌，1%四氧化鋨浸泡2 h；多次水洗后，在乙醇梯度下脫水，嵌入Epon樹脂中；切成半薄切片，美藍(lán)-天青染色，在光學(xué)顯微鏡下選取電鏡所要觀察的位置，并將其切成50～60 nm的超薄切片；超薄切片經(jīng)乙酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 20C對(duì)6-OHDA處理的PC12細(xì)胞存活率的影響

MTT法檢測結(jié)果（表1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.01）；模型+20C 0.10 和 1.00 μmol·L-1組細(xì)胞存活率顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Effect of 20C，an active ingredient of Gastrodiae Rhizoma，on cell viability of PC12 cells treated with 6-hydroxydopamine（6-OHDA）by MTT assay

2.2 20C對(duì)6-OHDA處理的PC12細(xì)胞DNA和RNA氧化損傷的影響

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果（圖2）顯示，PC12細(xì)胞6-OHDA造模6 h后，模型組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度顯著高于細(xì)胞對(duì)照組（P＜0.01），提示細(xì)胞DNA和RNA氧化損傷明顯；與模型組比較，模型+20C 1.00 μmol·L-1組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05），提示細(xì)胞DNA和RNA氧化損傷明顯緩解。

Fig.2 Effect of 20C on DNA and RNA oxidative damage of PC12 cells treated with 6-OHDA by immunofluorescence assay.PC12 cells were exposed to 6-OHDA 100 μmol·L-1and simultaneously given 20C 1.00 μmol·L-1for 6 h.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.3 20C對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型小鼠黑質(zhì)和紋狀體TH表達(dá)的影響

免疫組化染色結(jié)果（圖3）顯示，TH陽性表達(dá)區(qū)域呈棕色。模型組小鼠注射側(cè)黑質(zhì)和紋狀體TH陽性區(qū)域減少；而模型+20C組和模型+L-dopa組TH陽性區(qū)域增加，提示20C能夠緩解6-OHDA引起的小鼠黑質(zhì)和紋狀體病理損傷。

Fig.3 Effect of 20C on tyrosine hydroxylase（TH）positive expresion of substantia nigra(A)and striatum(B)in 6-OHDA-induced Parkinson disease(PD)model mice by immunohistochemical staining.Mice were divided into normal control，model，model+levodopa（L-dopa，40 mg·kg-1）and model+20C（100 mg·kg-1）groups.Mice were double site injected with 6-OHDA into the unilateral striatum to establish the PD model，except for those in normal control group.Three weeks later，L-dopa and 20C groups were ig given once per day for 4 weeks.

2.4 20C對(duì)6-OHDA引起的PD模型小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元逆行損傷的影響

Western印跡結(jié)果（圖4）顯示，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著減少（P＜0.01）；與模型組相比，模型+20C組TH蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），而模型+L-dopa組無明顯變化；與模型+L-dopa組相比，模型+20C組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。提示20C能夠緩解6-OHDA引起的小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元的逆行損傷。

Fig.4Effect of 20C on TH expresion of substantia nigra in 6-OHDA-induced PD model mice by Western blotting.See Fig.2 for the mouse treatment.B was the semiquantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group；ΔP＜0.05，compared with model+L-dopa group.

2.5 20C對(duì)6-OHDA引起的PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷的影響

透射電鏡結(jié)果（圖5）顯示，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元核膜皺縮，電子密度較高，細(xì)胞周圍腫脹；而模型+L-dopa組和模型+20C組小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元核膜較完整，電子密度變化和細(xì)胞周圍腫脹均不明顯，提示20C能夠改善6-OHDA模型小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的損傷。

Fig.5 Effect of 20C on neuron ultrastructural damage of substantia nigra in 6-OHDA-induced PD model mice by transmission electron microscopy.See Fig.3 for the mouse treatment.The nuclear membrane（black arrows）of neurons of model mice appeared shrunken and incomplete，and the surround?ing cells were swollen（red arrows）.

3 討論

氧化應(yīng)激被認(rèn)為與PD發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系［13］。研究發(fā)現(xiàn)，DA在胞內(nèi)蓄積后會(huì)進(jìn)一步氧化產(chǎn)生毒性產(chǎn)物，對(duì)神經(jīng)元造成損害是PD患者DA能神經(jīng)元產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷的最主要原因［14］，并且DA氧化后的毒性產(chǎn)物中存在6-OHDA。本研究通過6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，與模型對(duì)照組比較，20C能夠提高PC12細(xì)胞的存活率，緩解PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，初步驗(yàn)證了20C對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用。

本研究通過單側(cè)紋狀體注射6-OHDA建立PD小鼠模型，模擬臨床PD患者病理進(jìn)程中由紋狀體DA能神經(jīng)末梢向黑質(zhì)DA能神經(jīng)元胞體的逆行性損傷過程，反映PD患者臨床病理改變進(jìn)程［10］。TH為DA合成的限速酶，是檢測DA能神經(jīng)元損傷的標(biāo)志物。小鼠紋狀體損傷檢測結(jié)果表明，PD模型小鼠紋狀體明顯損傷，TH陽性面積縮??；20C能阻止紋狀體TH陽性面積的減少，改善紋狀體損傷。小鼠黑質(zhì)損傷檢測結(jié)果表明，PD模型小鼠黑質(zhì)表現(xiàn)出明顯的逆行性損傷，TH陽性神經(jīng)元丟失；20C能減少黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元的丟失，提高TH蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，20C對(duì)黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)DA能神經(jīng)元逆行性損傷具有改善作用。此外，通過觀察黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，PD模型小鼠部分黑質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，而20C可使黑質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)受損的神經(jīng)元數(shù)量減少，改善6-OHDA導(dǎo)致的黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷。

綜上所述，20C能夠降低6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞死亡率及氧化損傷，并改善6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型小鼠黑質(zhì)和紋狀體的病理損傷，其深入機(jī)制有待進(jìn)一步研究。