邴鐘興 鄭志博 張家齊

非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌組織學類型的80%～85%，預后差，尋找靶向治療NSCLC的新靶點分子意義深遠。相關研究表明，驅(qū)動蛋白超家族成員2A(KIF2A)在胃癌等惡性腫瘤組織中表達異常[1]。真核起始因子(eIFs)參與真核翻譯起始過程的大多數(shù)反應，種類多且復雜，其中eIF3b結(jié)構特殊，參與調(diào)節(jié)多種典型的生物過程，如細胞周期、細胞凋亡、侵襲和遷移等[2]。本研究通過檢測NSCLC癌組織中KIF2A、eIF3b mRNA表達，分析KIF2A、eIF3b mRNA表達間的相關性，探討兩者在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。

對象與方法

一、對象

2015年1月～2016年12月于我院診治的NSCLC病人90例。納入標準：(1)手術達到R0切除，癌組織及癌旁正常組織(距癌周>2 cm)均經(jīng)明確的細胞學和組織病理學診斷；(2)初次診治；(3)未接受抗腫瘤治療；(4)臨床病理資料完整，簽署知情同意書；(5)術前全身評估無手術禁忌證。排除標準：呼吸道感染等疾病；其他惡性腫瘤；嚴重的心、肝、肺、腎等臟器功能不全。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準。

二、方法

1.收集病人一般資料，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤部位、病理類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期。

2.實時熒光定量PCR：取液氮速凍且-80 ℃冰箱保存的組織樣本約30 mg，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取組織總RNA；PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，反應條件如下：42 ℃逆轉(zhuǎn)錄反應20分鐘，85 ℃滅活5分鐘，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃冰箱保存；實時熒光定量PCR儀(美國伯樂，BIO-RAD CFX96型)，SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本TaKaRa公司)，引物(上海啟因生物科技有限公司)序列如下，KIF2A正向引物5′-CCTGACCTTGTTCCTGATGAAG-3′，KIF2A反向引物5′-TGCTGAACCAACCACTCTATTATC-3′，eIF3b正向引物5′-CGGTGCCTTAGCGTTTGTG-3′，eIF3b反向引物5′-CGGTCCTTGTTGTTCTTCTGC-3′，內(nèi)參GAPDH正向引物5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，內(nèi)參GAPDH反向引物5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3′。反應條件如下：95 ℃預變性3分鐘，40個循環(huán)；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1分鐘，72 ℃延伸30 s。每個樣本重復實驗3次，相對循環(huán)數(shù)(Ct)值方法進行數(shù)據(jù)分析，2-△△Ct計算KIF2A、eIF3b mRNA相對表達量。

3.隨訪：病人出院為起始，門診復查或電話方式，隨訪至病人死亡或隨訪終止時間，隨訪截止時間2020年12月。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié)果

1.KIF2A、eIF3b表達情況：NSCLC癌組織中KIF2A mRNA相對表達量(3.747±1.388)高于癌旁正常組織(1.424±0.565)(t=14.706，P=0.000)；NSCLC癌組織中eIF3b mRNA相對表達量(4.188±1.520)高于癌旁正常組織(1.424±0.565)(t=14.532，P=0.000)。

2.KIF2A、eIF3b表達與病人臨床病理特征的關系：NSCLC癌組織中，KIF2A、eIF3b mRNA表達均與病人性別、年齡、吸煙史、腫瘤部位、病理類型無關(P>0.05)；KIF2A mRNA表達與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(P<0.05)，與腫瘤大小無關(P>0.05)；eIF3b mRNA表達與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(P<0.05)，與分化程度無關(P>0.05)。見表1。

表1 KIF2A、eIF3b表達與病人臨床病理特征關系

3.KIF2A、eIF3b表達相關性：Pearson相關系數(shù)分析結(jié)果，NSCLC癌組織KIF2A mRNA、eIF3b mRNA表達呈正相關(r=0.412，PP<0.05)。

4.KIF2A、eIF3b表達與病人預后的關系：隨訪期間共有7例病人失訪。以KIF2A mRNA相對表達量的均值(3.747)為界，分為KIF2A高表達組(42例)與KIF2A低表達組(41例)。KIF2A高表達組術后5年總生存率為23.81%(10/42)，低于KIF2A低表達組60.98%(25/41)(χ2=11.752，PP<0.05)。以eIF3b mRNA相對表達量的均值(4.188)為界，分為eIF3b高表達組(41例)與eIF3b低表達組(42例)。eIF3b高表達組術后5年總生存率為26.83%(11/41)，低于eIF3b低表達組57.14%(24/42)(χ2=7.818，PP<0.05)。KIF2A表達與病人預后的關系見圖1。eIF3b表達與病人預后的關系見圖2。

圖1 KIF2A表達與病人預后的關系圖2 eIF3b表達與病人預后的關系

5.Cox回歸模型分析病人預后的影響因素：Cox分析結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ期、KIF2A mRNA高表達、eIF3b mRNA高表達是病人預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 病人預后影響因素分析

討論

近年來，NSCLC病人生存率得到一定程度的提高，主要歸功于分子生物靶向治療等臨床治療方法的不斷革新[3]。尋找靶向治療NSCLC的新靶點分子，已成為眾多學者關注和研究的熱點[4]。腫瘤微環(huán)境中微管是構成細胞骨架的主要成分之一，其解聚及減少可導致細胞惡變、激發(fā)腫瘤惡性潛能。驅(qū)動蛋白是微管重要輔助蛋白，是影響腫瘤惡性生物學特性的諸多關鍵因素之一[5]。KIF2A是驅(qū)動蛋白-13家族成員，具有解聚細胞微管的功能，廣泛表達于哺乳動物細胞，參與有絲分裂、胞膜運輸?shù)冗^程[6]。研究提示，KIF2A在癌細胞中異常高表達，參與腫瘤細胞進展、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程[7]。本研究檢測出NSCLC癌組織中KIF2A表達水平升高，KIF2A可能與腫瘤周圍的局部浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移相關，推測KIF2A高表達可能增加微管解聚，造成細胞骨架不穩(wěn)定，從而增強腫瘤細胞的局部浸潤、侵襲特性，如具有抑癌功能的miR-451a靶向降低KIF2A表達，從而抑制肺鱗狀細胞癌細胞的侵襲性特征[8]。KIF2A調(diào)控NSCLC癌細胞侵襲的分子機制，值得深入探究。

腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化過程，可能存在翻譯調(diào)控異常，關于腫瘤發(fā)生發(fā)展與翻譯調(diào)控失常的機制，目前尚未明確[9]，參與基因翻譯進程的關鍵因子，具有作為新抗腫瘤治療靶點的潛能，如eIFs分子參與了蛋白翻譯和細胞周期的調(diào)控及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[10]。目前已鑒定12種eIFs分子(eIF1-12)，其中eIF3分子量最大且結(jié)構最復雜，由13種亞基組成(eIF3a-eIF3m)。研究顯示，eIF3可影響細胞周期、調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，如a、b、e和k亞基均可能參與細胞周期調(diào)控[11]。實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，eIF3b在NSCLC癌組織中呈高表達狀態(tài)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關，揭示eIF3b參與了NSCLC細胞增殖、侵襲及遷移等惡性進展過程。eIF3b是直接參與蛋白合成的關鍵因子，異常高表達可能參與調(diào)控NSCLC細胞增殖、轉(zhuǎn)移過程，此外關于eIF3b調(diào)控腫瘤細胞增殖機制，已有研究者證實eIF3b可能參與調(diào)控缺氧誘導因子(HIF-1)，在膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖發(fā)揮至關重要作用[12]，初步推測eIF3b也可能是調(diào)控HIF-1促進NSCLC癌細胞增殖。深入研究eIF3b分子調(diào)控作用機制，可提供更直接、有效的靶點治療新策略，是下一步研究的方向。

Kaplan-Meier生存分析顯示，KIF2A高表達組、eIF3b高表達組術后5年總生存率較低，腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)及臨床分期等多種因素影響NSCLC病人預后[13]。Cox回歸模型分析結(jié)果表明，KIF2A、eIF3b有望作為預測、判斷NSCLC預后的新靶點分子，具有預測病情進展、預后不良的潛能。本研究納入的病例數(shù)較少、來源單一，仍需進行大量樣本驗證。

Pearson相關分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC癌組織中，KIF2A mRNA、eIF3b mRNA表達呈正相關性，提示兩者在促進NSCLC發(fā)生過程中發(fā)揮協(xié)同促進作用，但因?qū)嶒灄l件有限，本研究未對組織樣本KIF2A、eIF3b蛋白表達進行檢測。后續(xù)仍需要進一步研究KIF2A、eIF3b在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的分子機制，為臨床靶向藥物的開發(fā)提供前瞻性研究。

綜上，KIF2A mRNA、eIF3b mRNA在NSCLC癌組織表達增加，與病人較差臨床病理特征有關，均是影響NSCLC病人預后的危險因素，KIF2A及eIF3b具有作為NSCLC疾病進展及預后評估的新靶點分子的潛力，有望為NSCLC病情進展以及治療提供新途徑。