毛非凡 陳 剛 馬 騫 周啟苓 施 鋼 黃建盛 鄺杰華

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東 湛江 524025)

骨骼是魚(yú)類支持身體、保護(hù)柔軟器官的重要結(jié)構(gòu)，在海水魚(yú)類從初孵仔魚(yú)發(fā)育至成魚(yú)的過(guò)程中，骨骼發(fā)育起到至關(guān)重要的作用，遺傳因素、環(huán)境因素以及營(yíng)養(yǎng)因素等均可影響骨骼發(fā)育導(dǎo)致骨骼畸形(Cahu et al, 2003)。骨骼畸形會(huì)導(dǎo)致仔、稚魚(yú)攝食能力低，運(yùn)動(dòng)能力弱，生長(zhǎng)緩慢，成活率低等問(wèn)題(Gapasin et al,2001)。在人工繁育過(guò)程中，畸形魚(yú)苗成長(zhǎng)至商品魚(yú)規(guī)格后，也會(huì)因?yàn)槠废嗖患褵o(wú)法銷售帶來(lái)直接經(jīng)濟(jì)損失(Cobcroft et al, 2012)。目前，對(duì)魚(yú)類骨骼畸形的研究多集中在鱸形目(Perciformes) (Ma et al, 2016; Cobcroft et al, 2004; Wang et al, 2000; 溫久福等, 2020; Fraser et al, 2005; Nagano et al, 2007; 李遠(yuǎn)友等, 2019)、鰈形目(Pleuronectiformes) (Hosoya et al, 1998; Martinez et al, 2003; Lewis et al, 2004; Gavaia et al, 2002; 馬慧等, 2011)、鯉形目(Cypriniformes) (Ferreri et al, 2000)和鮭形目(Salmoniformes) (Witten et al, 2016)中的部分經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，研究?jī)?nèi)容主要包括骨骼畸形類型的鑒定和發(fā)生過(guò)程(Ferreri et al, 2000)，以及遺傳、環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)等因素對(duì)魚(yú)類畸形率及死亡率的影響(Alix et al,2017; Fraser et al, 2019; Kuroki et al, 2016)，其中，闡明骨骼畸形的類型及發(fā)生過(guò)程是研究基礎(chǔ)和關(guān)鍵內(nèi)容。

軍曹魚(yú)(Rachycentron canadum)隸屬于鱸形目、鱸亞目(Percoidei)、軍曹魚(yú)科(Rachycentridae)、軍曹魚(yú)屬(Rachycentron)，為外海暖水性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，主要分布于大西洋、印度洋、太平洋(東太平洋除外)等熱帶水域，在中國(guó)南海部分海域亦有少量分布。軍曹魚(yú)生長(zhǎng)速度快，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，養(yǎng)殖周期短，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，近年在南方沿海的人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大(陳剛等, 2004; 陳浩如等, 2006)。本研究團(tuán)隊(duì)在開(kāi)展軍曹魚(yú)人工繁育研究中，觀察到15%～20%的魚(yú)苗存在畸形。軍曹魚(yú)作為極具潛力的養(yǎng)殖品種，控制畸形率是保障養(yǎng)殖利潤(rùn)的前提之一，但有關(guān)軍曹魚(yú)的骨骼發(fā)育的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

硬骨魚(yú)類中，嚴(yán)重骨骼畸形的個(gè)體通常不能正常發(fā)育乃至存活，稚幼魚(yú)在骨骼數(shù)量和形態(tài)等方面均已接近成魚(yú)，骨骼已趨于完全骨化狀態(tài)，這一發(fā)育階段的骨骼畸形類型可能會(huì)在成魚(yú)中延續(xù)。故本研究選取同一批次孵化的 25日齡(days post hatching, dph)軍曹魚(yú)稚魚(yú)，通過(guò)采取軟骨—硬骨雙染色方法進(jìn)行全骨骼染色，對(duì)其骨骼畸形發(fā)生部位、畸形種類和畸形率進(jìn)行研究，為研究軍曹魚(yú)骨骼畸形的成因，降低畸形率及軍曹魚(yú)人工養(yǎng)殖的推廣提供參考資料。

1 材料方法

1.1 仔稚魚(yú)的培育

2020年4月，在廣東海洋大學(xué)生物研究基地(東海島)進(jìn)行了軍曹魚(yú)人工繁育。受精卵收集分離篩選后置于500 L圓形孵化桶中充氣孵化。仔魚(yú)孵出后，將其從孵化桶轉(zhuǎn)移至室內(nèi)水泥池(5 m×3.5 m×1.5 m)進(jìn)行培育。種苗培育過(guò)程投喂餌料和飼料：3～10 dph投喂輪蟲(chóng)(Rotifer)，投喂量保持在 1～4 ind./mL；8～19 dph投喂橈足類(Copepods)，投喂量保持在1～3 ind./mL；10～23 dph投喂鹵蟲(chóng)(Artemia saline)幼體，投喂量保持在 1～3 ind./mL；17～30 dph 投喂越群小苗 3#～6#料(成分組成：蛋白質(zhì)55.2%、粗脂肪12.7%、粗纖維1.0%、粗灰分12.2%、水分6.1%、賴氨酸3.5%)，投喂量保持在體重的8%～10%，3～17 dph投喂 3～4次/d，17～30 dph 投喂 2～3次/d。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品采集

選取同一孵化批次、25 dph軍曹魚(yú)稚魚(yú)為研究對(duì)象，取樣前一天停止投喂。稚魚(yú)經(jīng)丁香酚麻醉后，再置于 4%多聚甲醛固定液中于4℃充分固定，之后轉(zhuǎn)至70%酒精溶液中(-20℃)保存。

1.3 骨骼染色

通過(guò)對(duì)Guido等(1977)的軟骨—硬骨雙染色方法并加以改進(jìn)，采用1% KOH溶液對(duì)樣品進(jìn)行漂白脫色，對(duì)軍曹魚(yú)稚魚(yú)全骨骼進(jìn)行染色，骨骼染色具體步驟如下：

清洗：將經(jīng)4%多聚甲醛固定的稚魚(yú)放入ddH2O中浸泡 1～2 d。

軟骨染色：將清洗過(guò)的標(biāo)本置于0.02%阿爾新蘭染液中12 h，直至觀察到鰭基部有明顯藍(lán)色。

梯度脫水：將標(biāo)本依次放入95%、75%、40%、15%的酒精溶液和ddH2O中進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)梯度2 h。

透明化：將標(biāo)本放入 1% KOH溶液中進(jìn)行透明化，直至標(biāo)本完全透明。

硬骨染色：將標(biāo)本放入0.1%茜素紅染液中約45 min，直至硬骨染上紅色。

保存：將標(biāo)本依次移入0.5% KOH和甘油體積比為(3∶1、1∶1和1∶3)的混合液中，脫去多余顏色，最終移入甘油中，并加入3～4粒廖香草酚保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的觀察

采用游標(biāo)卡尺測(cè)量透明樣本全長(zhǎng)，用Leica M205 FCA體視顯微鏡對(duì)透明標(biāo)本進(jìn)行觀察拍照，記錄骨骼畸形的發(fā)生部位和形態(tài)特征，最后進(jìn)行資料整理歸類。骨骼命名參照Harder (1975)，骨骼畸形的歸類參照Favaloro等(2006)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對(duì)骨骼正常組與骨骼畸形組魚(yú)體全長(zhǎng)(TL)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，分析骨骼正常組與骨骼畸形組之間魚(yú)體全長(zhǎng)的差異水平；利用單因素方差分析和Duncan’s多重比較，分析骨骼正常組、各不同畸形部位組之間魚(yú)體全長(zhǎng)的差異水平?；温视?jì)算公式：

畸形率=(畸形數(shù)/總數(shù))×100%

2 結(jié)果

180個(gè)軍曹魚(yú)稚魚(yú)骨骼樣本的總畸形率為40.00%，共存在22種骨骼畸形類型。骨骼畸形發(fā)生部位主要為顱骨(cranium)、脊柱(vertebral)、背鰭(dorsal fin)、臀鰭(anal fin)、尾鰭(caudal fin)。具體骨骼畸形的發(fā)生部位、畸形類型和畸形率見(jiàn)表1。其中，62個(gè)樣本存在1種骨骼畸形，10個(gè)樣本存在1種以上的骨骼畸形。

表1 軍曹魚(yú)稚魚(yú)骨骼畸形種類與畸形率Tab.1 Type and incidence of deformities in juvenile R. canadum

軍曹魚(yú)稚魚(yú)顱骨畸形個(gè)體 TL=(43.14±7.13) mm，畸形率為17.22%，共發(fā)現(xiàn)米克爾氏軟骨畸形(MCD,圖1A)、基舌骨畸形(BD, 圖1B)、基舌骨異位(BA,圖1C)和舌弓下沉(LHA, 圖1D) 4種骨骼畸形類型，畸形率分別為12.22%、2.78%%、3.89%和1.11%。4種顱骨骨骼畸形均未表現(xiàn)出顯著可見(jiàn)的外部形態(tài)變化。

圖1 軍曹魚(yú)稚魚(yú)顱骨骨骼畸形Fig.1 Cranium deformities in juvenile R. canadum

軍曹魚(yú)稚魚(yú)脊柱畸形個(gè)體TL=(46.67±6.34) mm，畸形率為10.56%，共發(fā)現(xiàn) 6種骨骼畸形種類，分別為脊柱前凸(LO, 圖 2A)、椎骨畸形(VD, 圖 2B)、神經(jīng)棘分叉(BNS, 圖 2C)、脈棘分叉(BHS, 圖 2D)、脈棘融合(HSF, 圖 2E)、軟骨冗余(CR, 圖 2E、圖 2F)。脈棘分叉和神經(jīng)棘分叉的發(fā)生率最高，分別為4.44%和3.33%。在脊柱周圍與脈棘之間發(fā)現(xiàn)有冗余的軟骨存在。6種骨骼畸形均未表現(xiàn)出顯著可見(jiàn)的外部形態(tài)變化。

圖2 軍曹魚(yú)稚魚(yú)脊柱骨骼畸形Fig.2 Vertebral column deformities in juvenile R. canadum

軍曹魚(yú)稚魚(yú)尾鰭骨骼畸形個(gè)體TL=(43.36±8.27) mm，畸形率為15.56%，共發(fā)現(xiàn)尾上骨缺失(ED, 圖3A)、尾上骨融合(EF, 圖3B)、尾上骨畸形(EDM, 圖3C)、尾下骨缺失(HYD, 圖3D)、尾下骨與側(cè)尾下骨愈合(HAHF, 圖 3E)、尾下骨畸形(HYDE, 圖 3F)等 6種骨骼畸形種類。尾上骨缺失和尾上骨融合的發(fā)生率最高，分別為 7.78%和3.89%。6種骨骼畸形均未表現(xiàn)出顯著可見(jiàn)的外部形態(tài)變化。

圖3 軍曹魚(yú)稚魚(yú)尾鰭骨骼畸形Fig.3 Caudal fin deformities in juvenile R. canadum

軍曹魚(yú)稚魚(yú)背鰭和臀鰭骨骼畸形個(gè)體 TL=(51.88± 7.12) mm，畸形率為5.56%，共發(fā)現(xiàn)支鰭骨分叉(BPT,圖4A)、支鰭骨畸形(PTD, 圖4A)、支鰭骨冗余(PTR,圖4B)、支鰭骨異位(PTA, 圖4C)、臀鰭條冗余(AFR,圖4D)、背鰭棘缺失(DSD, 圖2A)等6種骨骼畸形種類，骨骼畸形主要與支鰭骨相關(guān)。6種骨骼畸形均未表現(xiàn)出顯著可見(jiàn)的外部形態(tài)變化。

圖4 軍曹魚(yú)稚魚(yú)背鰭和臀鰭的骨骼畸形Fig.4 Dorsal and anal fin deformities in juvenile R. canadum

骨骼正常組[TL=(50.03±10.06) mm]與骨骼畸形組[TL=(44.56±7.79) mm]在全長(zhǎng)上存在極顯著差異(P＜0.01)；骨骼正常組分別與顱骨畸形組[TL=(43.14±7.13) mm] (P=0.003＜0.01)及尾鰭畸形組[TL=(43.36±8.27) mm] (P=0.001＜0.01)在全長(zhǎng)上存在極顯著差異，背、臀鰭畸形組[TL=(44.39±1.98) mm]分別與顱骨畸形組(P=0.033＜0.05)和尾鰭畸形組(P=0.021＜0.05)在全長(zhǎng)上存在顯著差異(圖5)。

圖5 骨骼正常組與各骨骼畸形組軍曹魚(yú)全長(zhǎng)比較Fig.5 Total length of normal and skeletal deformed groups juvenile R. canadum

3 討論

本研究首次報(bào)道了軍曹魚(yú)骨骼發(fā)育異常的形態(tài)特征。在 25 dph軍曹魚(yú)稚魚(yú)的所有畸形種類中，顱骨畸形發(fā)生率最高，主要表現(xiàn)為米克爾氏軟骨畸形、基舌骨畸形、基舌骨異位、舌弓下沉等，與鄭攀龍(2015)研究發(fā)現(xiàn)的卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)仔、稚魚(yú)的顱骨畸形類型一致，推測(cè)是由于二者發(fā)育階段相似。米克爾氏軟骨畸形是一種較為常見(jiàn)的魚(yú)類骨骼畸形類型，黃尾(Seriola lalandi) (Cobcroft et al, 2004)、尖吻鱸(Lates calcarifer) (Fraser et al, 2005)、大西洋鮭(Salmo salar) (Witten et al, 2016)的仔稚魚(yú)中均發(fā)現(xiàn)米克爾氏軟骨畸形的存在。卵形鯧鲹中度和嚴(yán)重的米克爾氏軟骨畸形可導(dǎo)致下頜變形(鄭攀龍, 2015)。本研究中，軍曹魚(yú)米克爾氏軟骨畸形屬輕度畸形，魚(yú)體未表現(xiàn)出明顯的外部形態(tài)變化。此外，軍曹魚(yú)稚魚(yú)中也未發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖2齡赤點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelus akaara)中所報(bào)道的鰓蓋畸形或缺失現(xiàn)象(孔祥迪等, 2016)，可能是由于發(fā)育日齡差異過(guò)大導(dǎo)致。軍曹魚(yú)顱骨畸形部位主要集中在與攝食相關(guān)的頜弓、舌弓，推測(cè)其原因可能與其攝食兇猛，攝食過(guò)程存在搶食現(xiàn)象有關(guān)(羅杰等, 2007)。此外，顱骨畸形個(gè)體全長(zhǎng)指標(biāo)極顯著低于正常個(gè)體，可能這些畸形類型對(duì)攝食造成影響，并進(jìn)一步對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育造成影響。

本研究中，軍曹魚(yú)尾鰭畸形率僅次于顱骨畸形率，尾鰭畸形個(gè)體全長(zhǎng)指標(biāo)極顯著低于正常個(gè)體。種苗密度大會(huì)導(dǎo)致金頭鯛(Sparusaurata)仔稚魚(yú)尾鰭發(fā)生畸形(Koumoundouros et al, 1997)。本研究中，尾鰭畸形可能是由于飼養(yǎng)密度大，對(duì)魚(yú)類生長(zhǎng)速率產(chǎn)生影響，從而影響全長(zhǎng)。此外，尾鰭骨骼畸形類型在不同魚(yú)類間存在一定差異，軍曹魚(yú)的尾鰭畸形主要是尾上骨缺失和尾上骨融合；青石斑魚(yú)(Epinephelus awoara)的尾鰭畸形主要是尾上骨的缺失(王秋榮等, 2012)；大菱鲆(Scophthalmus maximus)中尾鰭畸形主要是鰭條畸形和尾桿骨畸形(呂雪嬌, 2018)；卵形鯧鲹主要是尾上骨和尾下骨的畸形(鄭攀龍, 2015)。

軍曹魚(yú)神經(jīng)棘及脈棘畸形發(fā)生的頻率較高，這與大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus) (張?jiān)讫? 2016)早期骨骼發(fā)育特征的結(jié)果相似，可能是由于二者體型相似。此外，軍曹魚(yú)軟骨冗余主要發(fā)生在脈棘之間，但青石斑魚(yú)中的軟骨冗余發(fā)生部位為支鰭骨之間(王秋榮等, 2012)，紅鰭笛鯛(Lutjanus erythropterus)發(fā)育過(guò)程中相鄰神經(jīng)棘之間也存在增生軟骨(程大川,2016)，表明軟骨冗余發(fā)生位置可能存在物種間差異。據(jù)報(bào)道，七帶石斑魚(yú)(Epinephelus septemfasciatus)(Nagano et al, 2007)、黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)(Huang et al, 2016)等在仔、稚魚(yú)階段即存在著較高的椎骨畸形率。卵形鯧鲹在11 dph即可觀察到嚴(yán)重的椎骨畸形(鄭攀龍等, 2014)。但在養(yǎng)殖軍曹魚(yú)稚魚(yú)中僅發(fā)現(xiàn)極個(gè)別椎骨畸形個(gè)體。推測(cè)其原因，可能是由于脊柱畸形發(fā)生在發(fā)育早期，且這一畸形類型嚴(yán)重影響仔稚魚(yú)的生存，因此，在存活的稚幼魚(yú)個(gè)體中較少觀察到這一畸形類型。

軍曹魚(yú)背鰭和臀鰭的畸形主要有鰭條冗余、支鰭骨分叉、支鰭骨畸形、支鰭骨彎曲、支鰭骨冗余和臀鰭條缺失等，類似的骨骼畸形在青石斑魚(yú)和大菱鲆中均有報(bào)道(王秋榮等, 2012; 呂雪嬌, 2018)，但如大菱鲆和塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)中鰭條的缺失、融合和分叉等畸形(呂雪嬌, 2018; Gavaia et al, 2002)在軍曹魚(yú)中尚未發(fā)現(xiàn)。本研究中，軍曹魚(yú)樣品背鰭和臀鰭的畸形主要集中在支鰭骨部位，推測(cè)其原因，可能是這一階段稚魚(yú)鰭條已經(jīng)骨化完全，但支鰭骨仍處于骨化過(guò)程中，因此，鰭部骨骼畸形的發(fā)生可能與支鰭骨的骨化進(jìn)程有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，軍曹魚(yú)稚魚(yú)骨骼畸形率與36 dph紅鰭笛鯛的骨骼畸形率(39.50%)(程大川, 2016)相近，略高于相同發(fā)育階段的卵形鯧鲹(22.00%～44.00%)(鄭攀龍, 2015)，但顯著低于鞍帶石斑魚(yú)(Epinephelus lanceolatus)仔稚魚(yú)(96.00%)(呂雪嬌, 2018)、金頭鯛稚魚(yú)(43.20%～100%)(Boglione et al, 2001; Prestinicola et al,2013)、緋海鯛(Pagellus erythrinus)稚魚(yú)(66.70%～80.00%)(Boglione et al, 2003)及舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)稚魚(yú)(＞90.00%)(Barahona-Fernandes, 1982)的相應(yīng)數(shù)值。本批次繁育的稚魚(yú)畸形率低于其他鱸形目海水魚(yú)，魚(yú)體外表未見(jiàn)顯著改變，可能是由于其培育環(huán)境優(yōu)良。

常規(guī)養(yǎng)殖條件下，軍曹魚(yú)稚魚(yú)骨骼畸形率最高部位為顱骨和尾鰭，這些骨骼畸形會(huì)直接影響魚(yú)體攝食和游泳，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)乃至存活(Koumoundouros et al, 1997)。加之骨骼畸形個(gè)體全長(zhǎng)極顯著低于正常個(gè)體，表明早期生長(zhǎng)發(fā)育已受到骨骼畸形影響，由此可見(jiàn)，降低骨骼畸形率對(duì)軍曹魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的意義重大。本研究通過(guò)鑒別常規(guī)養(yǎng)殖條件下軍曹魚(yú)稚魚(yú)骨骼畸形的類型及其發(fā)生部位，為研究軍曹魚(yú)骨骼畸形的發(fā)生過(guò)程和原因、減少畸形率和優(yōu)化苗種培育養(yǎng)殖條件提供理論基礎(chǔ)。