高 尚，徐高原，周明光，張華偉，郝根喜，陳 波，顧 強(qiáng)，向文杰

(武漢科前生物股份有限公司，湖北 武漢 430000)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)屬革蘭陰性菌，可通過消化道和呼吸道等傳播方式感染多種畜禽。Pm在世界范圍內(nèi)多呈急性流行，能夠引起感染動物多種癥狀，包括食欲下降、體重減輕、水腫和腹瀉，最終可能導(dǎo)致患病動物死亡[1]。預(yù)防多殺性巴氏桿菌主要采用疫苗手段，但Pm具有多種血清型，且不同血清型均能夠引起不同性質(zhì)的疾病[2]，交叉保護(hù)能力弱，而抗生素的使用又容易產(chǎn)生耐藥菌株，所以該病還未能得到有效控制。

研究數(shù)據(jù)表明，我國牛群多感染A、B型巴氏桿菌，引起嚴(yán)重的纖維素性肺炎及出血性敗血癥[3]。其中，A型巴氏桿菌主要能夠引起犢牛的肺炎，而B型巴氏桿菌主要引起成年牛的出血性敗血癥[3]。本試驗從廣州一養(yǎng)殖場患有呼吸道疾病的病死犢牛中分離出2株莢膜A型多殺性巴氏桿菌，并對其分子生物學(xué)特點進(jìn)行研究，旨在為臨床診治該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 廣州一規(guī)?；B(yǎng)牛場病死犢牛，剖檢發(fā)現(xiàn)肺臟嚴(yán)重出血，呼吸道伴有黏液滲出，肝臟出血淤血。采集肺臟及肝臟組織進(jìn)行病原分離。

1.2 主要試劑 TSA(Tryptic soy agar)和TSB(Tryptic soy broth)培養(yǎng)基，均購自DB Biotech生物科技有限公司；新生牛血清，購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；藥敏試紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；革蘭染液和瑞士染液，均購自南京建成科技有限公司；引物合成及基因測序由擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 實驗動物 SPF級雄性昆明小鼠55只，4～6周齡，體重(18±2)g，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心。

1.4 細(xì)菌分離 無菌挑取病死牛的肺臟及肝臟組織，均勻涂劃在兩組5%新生牛血清的TSA平板中。分別置于有氧及無氧條件下，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。24 h后于無菌條件下挑取平板上的菌落三區(qū)劃線接種于5%新生牛血清的TSA平板上，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，再挑取單個菌落進(jìn)行革蘭染色和瑞士染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 細(xì)菌鑒定 采用高溫裂解法提取細(xì)菌DNA。以16S rRNA作為鑒定引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，序列為F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，預(yù)期目的條帶大小為1 475 bp。

切取目的條帶，采用Hingene瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收DNA，將回收純凈的DNA連接至pMD 18-T載體上并轉(zhuǎn)入至DH10B感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，加入1 mL無抗LB搖菌30 min后，吸取100 μL菌液在Amp抗性的LB平板中培養(yǎng)過夜。挑取LB平板上5個不同的單菌落，分別置于5個裝有LB的EP管中進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，6 h后吸取部分菌液進(jìn)行16S rRNA PCR鑒定，將出現(xiàn)陽性條帶的對應(yīng)菌液送檢測序。

通過16S rRNA測序結(jié)果可知2株分離菌均為多殺性巴氏桿菌，命名為KQ-Pm-A1和KQ-Pm-A2,設(shè)計分型引物進(jìn)一步對菌株進(jìn)行分型，見表1。

表1 多殺性巴氏桿菌分型引物Table 1 Typing primer of Pasteurella multocida

1.6 16S rRNA進(jìn)化樹分析 根據(jù)測序結(jié)果，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，選取不同國家、不同地區(qū)的多殺性巴氏桿菌16S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。采用Clustal W多序列比對處理序列，并用MEGA 7軟件以最大似然法(Maximum likelihod)構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.7 藥敏試驗 采用瓊脂擴(kuò)散方法進(jìn)行藥敏試驗，將新霉素、美洛西林、多西環(huán)素等16種常規(guī)藥敏紙片置于細(xì)菌平板上培養(yǎng)，24 h后量取抑菌圈直徑。藥敏結(jié)果判定按照杭州濱和微生物試劑有限公司發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.8 生長曲線的繪制 于無菌操作臺內(nèi)使用接種環(huán)挑取純化后的單個菌落混入裝有5 mL 5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)液中，另做一組空白對照。37 ℃條件下，1 600 r/min培養(yǎng)18 h，作為種子液。取3瓶裝有無菌100 mL 5%新生牛血清TSB培養(yǎng)液的錐形瓶，將種子液按照1%的量加入至2瓶錐形瓶中，另1瓶作為對照。37 ℃條件下，1 600 r/min 搖瓶培養(yǎng)32 h， 并在第2、4、6、8、10、12、24、32小時取少量菌液測定不同時間段菌液OD600 nm值及梯度檢驗活菌數(shù)。每個濃度均做3個重復(fù)，取平均值繪制曲線。

1.9 小鼠攻毒試驗 采用半數(shù)致死量(LD50)評價2株分離菌的致病性。取50只雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為10組，每組5只。調(diào)整KQ-Pm-A1初始濃度為1.2×109CFU/mL，KQ-Pm-A2初始濃度為1.01×109CFU/mL。每株分離菌均10倍倍比稀釋為10-5～10-9共5個 梯度，每個梯度攻毒一組小鼠，腹腔注射菌液0.2 mL，另取5只小鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水作為對照。連續(xù)觀察14 d、記錄各組死亡情況，對死亡小鼠立即剖檢，觀察病理變化并對各臟器進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定，根據(jù)Reed-Muench累加法計算分離菌株的半數(shù)致死量(LD50)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離 兩組平板中均長出散在的菌落，說明分離菌兼性厭氧。經(jīng)過純化培養(yǎng)后，可見平皿上長出圓潤光滑、半透明、灰白色的菌落。通過革蘭染色和瑞士染色，鏡檢可見菌株為革蘭陰性短小桿菌，菌體呈現(xiàn)兩端濃染的現(xiàn)象，見圖1、2。

圖1 革蘭染色結(jié)果(1 000×)Fig.1 The result of Gram staining

圖2 瑞士染色結(jié)果(1 000×)Fig.2 The result of Wrightm staining

2.2 細(xì)菌的鑒定 對分離得到的2株分離菌進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)2株分離菌均在1 475 bp產(chǎn)生與陽性對照一致的條帶，見圖3。同時，進(jìn)行多殺性巴氏桿菌分型PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)2株分離菌均在1 044 bp處產(chǎn)生與A型陽性對照相同的條帶，證明2株分離株為A型多殺性巴氏桿菌，命名為KQ-Pm-A1及KQ-Pm-A2，見圖4。通過對16S rRNA切膠回收測序發(fā)現(xiàn)，KQ-Pm-A1與GenBank上CP033597.1株同源性達(dá)99.80%；KQ-Pm-A2與GenBank上CP015573.1株同源性達(dá)99.93%。

圖3 16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification of 16S rRNA gene by PCR

圖4 莢膜A型PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification of capsule type A gene by PCR

2.3 16S rRNA進(jìn)化樹分析 根據(jù)16S rRNA的序列，選取GenBank中已發(fā)表的國內(nèi)外多地區(qū)多殺性巴氏桿菌16S rRNA序列，利用MEGA 7軟件成功構(gòu)建出有根，基于單個基因建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖5?？梢奒Q-Pm-A1與KQ-Pm-A2同屬一個分支，與國內(nèi)菌株相比，分離株與海南株同源關(guān)系較近，與湖南株、湖北株、湘潭株同源關(guān)系較遠(yuǎn)。同國外菌株相比，2株分離菌與丹麥、德國、日本、美國、埃及、馬來西亞分離株同源性關(guān)系較遠(yuǎn)。其中，莢膜A型多殺性巴氏桿菌長沙分離株與莢膜A型多殺性巴氏桿菌美國蒙哥馬利分離株被歸屬同一支，英國分離株同埃及分離株同源關(guān)系較近、日本分離株與湖南分離株也有較近的同源性，這些結(jié)果提示菌株可能存在相近的遺傳進(jìn)化關(guān)系，表明了多殺性巴氏桿菌的全球流行趨勢。

圖5 多殺性巴氏桿菌16S rRNA遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Genetic tree of 16S rRNA gene in Pasteurella multocida?: 本試驗分離菌?: Isolated bacteria in this experiment

2.4 生長曲線繪制 將KQ-Pm-A1與KQ-Pm-A2兩株菌均以1∶100轉(zhuǎn)接至5%新生牛血清TSB培養(yǎng)液中，定時取出菌液進(jìn)行OD600 nm值測定及活菌計數(shù)，繪制曲線，見圖6。結(jié)果顯示，2株分離菌生長趨勢大致相同，約在6 h進(jìn)入平臺期，12 h后進(jìn)入衰退期。

圖6 2株多殺性巴氏桿菌生長曲線Fig.6 Growth curve of two strains of Pasteurella multocida

表2 2株多殺性巴氏桿菌的藥敏結(jié)果Table 2 Results of drug sensitivity of two strains of Pasteurella multocida

2.6 小鼠攻毒試驗 昆明小鼠腹腔注射不同濃度的KQ-Pm-A1及KQ-Pm-A2后，均表現(xiàn)出被毛逆亂、精神沉郁、食欲廢絕、畏寒等癥狀，而對照組精神狀態(tài)表現(xiàn)正常。

2.6.1 病理學(xué)觀察 腹腔注射KQ-Pm-A1及KQ-Pm-A2后，高劑量急性死亡小鼠均表現(xiàn)出嚴(yán)重的出血癥狀，包括鼻腔、腳部、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟，腹腔粘連，腸黏膜脫落并伴有出血斑，見圖7。中、低劑量慢性死亡小鼠主要出現(xiàn)心臟及肺臟包裹炎癥滲出物，肝臟大面積淤血，脾臟腫大等癥狀，見圖8。低劑量攻毒后14 d未死亡小鼠及對照組小鼠，剖檢未見病理變化。

圖7 急性死亡小鼠病理學(xué)觀察Fig.7 Pathological observation of acute dead miceA：腸黏膜脫落、出血; B：腹腔積液; C：腳部出血; D：鼻腔出血; E：各臟器出血A:Intestinal mucosa shedding and bleeding; B:Abdominal effusion; C:Foot bleeding; D:Nasal bleeding; E:Bleeding from various organs

圖8 慢性死亡小鼠病理學(xué)觀察Fig.8 Pathological observation of chronic dead miceA：心包炎; B：各臟器充血病變A:Pericarditis; B:Congestive lesions of various organs

2.6.2 臟器細(xì)菌分離 剖檢死亡小鼠，取各臟器在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌分離。結(jié)果顯示，2株多殺性巴氏桿菌攻毒后，死亡小鼠各臟器均能分離出細(xì)菌。對各臟器分離出的細(xì)菌進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)均為A型多殺性巴氏桿菌，見圖9。

圖9 攻毒小鼠各臟器細(xì)菌分離鑒定Fig.9 Isolation and identification of bacteria in various organs of challenged miceA：臟器細(xì)菌分離結(jié)果； B：分離菌PCR鑒定結(jié)果A:Separation results of viscera bacteria; B:PCR identification results of isolated bacteria

2.6.3 LD50的測定 4周齡小鼠腹腔注射不同濃度A型多殺性巴氏桿菌后，總體死亡趨勢隨著攻毒濃度的降低而降低，空白對照組無死亡。累計法計算KQ-Pm-A1的LD50≈2.4×101.16CFU/mL；KQ-Pm-A2的LD50≈2.02×101.84CFU/mL。

3 討論

多殺性巴氏桿菌是引起牛呼吸道綜合征(Bovine respiratory disease complex, BRDC)的主要病原菌，能夠?qū)е屡３霈F(xiàn)出血性敗血癥。據(jù)統(tǒng)計，美國有14.4%的牛在育肥期患有BRDC，而北美每年有14%～24%的牛死于BRDC[4]。國內(nèi)報道自2006年起，多地養(yǎng)牛場出現(xiàn)牛出血性敗血癥，并分離出莢膜A型多殺性巴氏桿菌，此后陸續(xù)在多個省市分離出該血清型病原[5]。由于缺少有效的防疫手段，該病一直流行至今，每年由P.multocida引發(fā)的BRDC在全球范圍內(nèi)引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

本試驗從犢牛體內(nèi)分離出2株莢膜A型多殺性巴氏桿菌，病死牛以犢牛為主，且傳播較快，臨床表現(xiàn)為呼吸困難，這與國外報道一致[6-7]。近年來，越來越多的報道表明，A型多殺性巴氏桿菌正逐漸成為引起B(yǎng)RCD巴氏桿菌中的主要血清型。Dabo等[8]和Christa等[9]的研究顯示，在引起B(yǎng)RCD的巴氏桿菌中，莢膜A型占比分別為80%及92%。

對KQ-Pm-A1及KQ-Pm-A2的16S rRNA進(jìn)行測序，選取不同國家和地區(qū)已發(fā)表的序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)本試驗的分離菌與湖南、湖北等華中地區(qū)的分離株親源性較低，與海南分離株親源性較高。同時還發(fā)現(xiàn)，一些不同國家的分離株有較高的親源性，這些結(jié)果表明，多殺性巴氏桿菌已經(jīng)呈全球流行態(tài)勢。但在曹瑞勇等[13]的研究中，國內(nèi)各省間的分離株具有較高的親源性，與國外分離株親源性較低，與本試驗結(jié)果有差異，可能的原因是選取比對的樣本不同。因此，要加強(qiáng)對各地區(qū)牛源多殺性巴氏桿菌的流行病學(xué)調(diào)查，以期獲得更加全面的樣本。

采用活菌計數(shù)法對KQ-Pm-A1和KQ-Pm-A2進(jìn)行生長曲線的繪制，結(jié)果顯示，2株分離菌在相同的培養(yǎng)條件下，生長規(guī)律大致相同。0～6 h時2株菌均在生長期，6～12 h在平臺期，隨后進(jìn)入衰退期。本試驗繪制的生長曲線與一些已有報道存在差異，朱玲[14]的研究顯示，分離株在8 h進(jìn)入平臺期，16 h進(jìn)入衰退期；而謝倩茹等[15]的研究顯示，分離株在2 h后進(jìn)入平臺期，16 h后開始衰退，這些結(jié)果的差異可能與培養(yǎng)細(xì)菌的環(huán)境有關(guān)。在Oslan等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)，高活細(xì)胞數(shù)在很大程度上受到微量營養(yǎng)素成分和大量營養(yǎng)素供應(yīng)的影響，其中組氨酸對于生長是必不可少的，而核黃素也對細(xì)菌活力有重要影響。

通過腹腔注射的方式攻毒小鼠，發(fā)現(xiàn)2株分離菌均能夠引起小鼠死亡。高劑量攻毒小鼠死亡較快，剖檢可見臟器出血、淤血，中、低劑量攻毒小鼠死亡較慢，剖檢發(fā)現(xiàn)胸腹腔均有不同程度的炎性反應(yīng)，結(jié)果符合預(yù)期。對攻毒死亡小鼠各臟器進(jìn)行細(xì)菌分離，經(jīng)鑒定與所攻毒株相同，表明小鼠死亡原因是由所攻菌株引起。測定半數(shù)致死量發(fā)現(xiàn)，KQ-Pm-A1為2.4×101.16CFU/mL，而KQ-Pm-A2為2.02×101.84CFU/mL，在菌株致病力方面，KQ-Pm-A1要強(qiáng)于KQ-Pm-A2。根據(jù)Liu等[17]對多殺性巴氏桿菌毒力的判定標(biāo)準(zhǔn)，小于100 CFU/mL為強(qiáng)毒菌株，可知KQ-Pm-A1為強(qiáng)毒菌株，KQ-Pm-A2為中強(qiáng)毒菌株。

綜上所述，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法及分子生物學(xué)法分離鑒定的莢膜A型多殺性巴氏桿菌是造成廣東某養(yǎng)殖場犢牛死亡的主要原因。本試驗可為臨床治療該病及牛源多殺性巴氏桿菌的流行病學(xué)調(diào)查提供理論依據(jù)。