劉艷麗 申峻涵 杜姍姍 劉景 申春艷 肖小帥 管一春

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心（鄭州450000）

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增高且呈年輕化，其中70%腫瘤患者有生育需求［1］。醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步和治療方案的改進(jìn)使腫瘤患者生存率得到明顯提高，但腫瘤的化、放療及手術(shù)治療對(duì)患者的生育力帶來不可逆轉(zhuǎn)的損傷，造成女性卵巢早衰、閉經(jīng)甚至生育力喪失，嚴(yán)重影響其生殖功能和生存質(zhì)量［2］。因此，生育力保存成為亟待解決的熱點(diǎn)問題。

女性生育力保存方法包括卵子冷凍、胚胎冷凍和卵巢組織冷凍［3］。卵子/胚胎冷凍保存技術(shù)是一項(xiàng)非常成熟的技術(shù)，但需控制促排卵過程，可能會(huì)延遲疾病的治療，對(duì)青春期前女性、兒童和激素依賴性腫瘤患者進(jìn)行超促排卵亦為禁忌。卵巢組織冷凍技術(shù)可一次性將數(shù)百甚至上千個(gè)竇前卵泡保存起來，不僅保存了生育能力，還能恢復(fù)生殖內(nèi)分泌功能。卵巢組織冷凍適合于青春期前HPO 軸未成熟、沒有足夠時(shí)間進(jìn)行超促排卵和激素敏感性腫瘤患者［4］，成為保存女性生育力最具潛力的選擇。卵巢組織冷凍常用的方法有玻璃化冷凍法和程序化冷凍法，不同的學(xué)者對(duì)兩種方法效果孰優(yōu)孰劣存在著爭(zhēng)議，尚未定論。因此，本文針對(duì)這一問題，從組織學(xué)、單個(gè)卵泡的分離計(jì)數(shù)和卵巢組織體外培養(yǎng)等方面對(duì)不同卵巢組織冷凍方案冷凍效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床開展卵巢組織冷凍工作提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 卵巢組織來源收集2020年1-12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院12 例因卵巢疾病患者需手術(shù)切除的卵巢組織標(biāo)本?；颊吣挲g28 ～ 37 歲，其中卵巢漿液性乳頭狀囊腺瘤2 例，宮頸癌行附件切除術(shù)3 例，畸胎瘤2 例，卵巢巧克力囊腫5 例?；颊呓? 個(gè)月無服用激素藥物史，術(shù)前3 個(gè)月未進(jìn)行放化療。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 卵巢皮質(zhì)的制備將手術(shù)切除的卵巢組織用生理鹽水沖洗干凈，去除血跡。在超凈工作站內(nèi)處理卵巢組織。若卵巢組織表面有肉眼可見的卵泡，用注射器抽取卵泡液，用眼科剪小心去除卵巢髓質(zhì)，將卵巢皮質(zhì)處理至1 mm 厚度。用手術(shù)刀將處理好的卵巢皮質(zhì)剪成10 mm×10 mm×1 mm 的組織塊，并隨機(jī)分為新鮮對(duì)照組、程序化冷凍組和玻璃化冷凍組，每組6 塊進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，其中新鮮對(duì)照組未經(jīng)過冷凍處理。

1.3 卵巢組織的玻璃化冷凍及復(fù)蘇采用商品化的試劑盒（KITAZATO VT301S/VT302S）。在室溫條件下，將卵巢皮質(zhì)片放入冷凍液1（cryo1）和冷凍液2（cryo2）中各5 min，然后在玻璃化液3（cryo3）中15 min 進(jìn)行組織的透化脫水，最后放在冷凍載桿上，投入液氮中冷凍保存。復(fù)蘇時(shí)取出待解凍的卵巢組織片，迅速投入37 ℃的解凍液1 中，1 min后于室溫下依次放在解凍液2 中3 min 和解凍液3中5 min。

1.4 卵巢組織的程序化冷凍及復(fù)蘇冷凍液是含有10%白蛋白的PBS 基礎(chǔ)液，將處理好卵巢皮質(zhì)塊切片放置預(yù)先加入0.8 mL 冷凍保護(hù)液（1.5 mol/L DMSO、0.1 mol/L 蔗糖）的冷凍管中，4 ℃平衡25 min后放入可編程冷凍儀中，按以下程序進(jìn)行冷凍：從20 ℃開始以2 ℃/min 降至-8 ℃，植冰，保持10 min，再以0.3 ℃/min 降至-30 ℃，以30 ℃/min 降至-197 ℃，直接投至液氮中冷凍保存。復(fù)蘇時(shí)從液氮罐中取出冷凍管，室溫2 min，37 ℃水浴箱中水浴2 min，肉眼可見冰晶完全溶解后，取出卵巢組織置于培養(yǎng)液中。

1.5 卵巢組織的形態(tài)學(xué)分析將新鮮組、玻璃化冷凍組和程序化冷凍組的卵巢組織各兩片置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，以4 μm 厚度連續(xù)切片，蘇木精和伊紅染色（hematoxylin and eosin，HE）進(jìn)行染色。所有組織均進(jìn)行連續(xù)切片，在高倍顯微鏡下隨機(jī)選擇含有卵泡的10 個(gè)視野進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。根據(jù)國(guó)際認(rèn)可的Gougeon 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行卵泡分級(jí)，完整的卵泡形態(tài)有完好的細(xì)胞核，核內(nèi)核仁清晰，卵泡基底膜完整，卵泡周圍的顆粒細(xì)胞分布均勻。若出現(xiàn)卵母細(xì)胞皺縮或核固縮、顆粒細(xì)胞排列紊亂、顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離或與卵泡周圍的基膜分離及基底膜不完整中任一項(xiàng)，視為異常卵泡。卵泡的完整率=計(jì)數(shù)的完整卵泡數(shù)/計(jì)數(shù)的所有卵泡數(shù)。另根據(jù)組織學(xué)分析結(jié)果篩選出8 例患者卵巢組織中富含各級(jí)卵泡，用于后續(xù)的卵泡計(jì)數(shù)和卵巢皮質(zhì)培養(yǎng)。

1.6 卵巢組織中卵泡的計(jì)數(shù)將新鮮對(duì)照組、玻璃化冷凍組和程序化冷凍組的卵巢組織塊，采用機(jī)械法和酶法進(jìn)行消化，將卵巢組織放入1.5 mL的EP 管中，用眼科剪將卵巢組織剪碎，加入1 mL Liberase DH 酶于37 ℃恒溫水浴箱消化，消化完全后加入終止液，離心后留取0.5 mL 混懸液倒入培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用170 μm 的剝卵針挑取各級(jí)竇前卵泡并分類計(jì)數(shù)，卵泡分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照Gougeon 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 卵巢皮質(zhì)的體外培養(yǎng)E2水平可以反映卵巢組織的內(nèi)分泌功能和卵泡的活性的主要指標(biāo)。分別取新鮮對(duì)照組、玻璃化冷凍組和程序化冷凍組的卵巢組織塊放在四孔培養(yǎng)皿中，每孔加入0.6 mL 培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，每48 小時(shí)進(jìn)行半量換液，收集體外培養(yǎng)卵巢組織的培養(yǎng)液，采用電化學(xué)光法檢測(cè)培養(yǎng)液中E2水平（儀器和試劑均為羅氏），判斷不同冷凍方法對(duì)卵巢組織中卵泡內(nèi)分泌功能的影響。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示；根據(jù)分組方法，計(jì)量資料采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析；分類變量采用Cochran′s 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織形態(tài)學(xué)改變與新鮮卵巢組織相比，玻璃化冷凍組始基卵泡和竇前卵泡形態(tài)學(xué)上無明顯差異，結(jié)構(gòu)完整，顆粒細(xì)胞分布均勻，基質(zhì)緊密，僅少數(shù)次級(jí)卵泡出現(xiàn)僅卵母細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，核濃縮；程序化冷凍組卵巢組織次級(jí)卵泡皺縮現(xiàn)象明顯增多，顆粒細(xì)胞排列紊亂、缺失、塌陷等損傷表現(xiàn)，間質(zhì)疏松；程序化冷凍組次級(jí)卵泡形態(tài)學(xué)上損傷高于玻璃化冷凍組，見圖1。

圖1 各組卵巢組織中的卵泡形態(tài)（HE×400）Fig.1 Follicular morphology in ovarian tissues of each group（HE×400）

計(jì)數(shù)新鮮對(duì)照組、玻璃化冷凍組和程序化冷凍組卵巢組織各級(jí)卵泡，玻璃化冷凍組和程序化冷凍組始基卵泡的完整率均明顯低于新鮮對(duì)照組（P＜0.001）；程序化冷凍組的次級(jí)卵泡完整率明顯低于新鮮對(duì)照組（P＜0.05）。見表1。

表1 不同冷凍方案各級(jí)卵泡的完整率Tab.1 The follicle integrity rate in all levels with different freezing methods 例（%）

2.2 卵巢組織混懸液中不同級(jí)別卵泡的計(jì)數(shù)程序化冷凍組卵巢組織混懸液始基卵泡、初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的密度均明顯低于新鮮對(duì)照組（P＜0.05）；玻璃化冷凍組卵巢組織混懸液中初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡密度和新鮮對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。卵巢組織混懸液中各級(jí)卵泡的形態(tài)見圖2。

圖2 卵巢組織混懸液中分離出的各級(jí)卵泡（×400）Fig.2 All levels of Follicles isolated from ovarian tissue suspension（×400）

表2 不同冷凍方案卵巢組織混懸液中各級(jí)卵泡的計(jì)數(shù)Tab.2 The number of follicles in ovarian tissue suspension with different Freezing methods±s，個(gè)/100 μL 混懸液

表2 不同冷凍方案卵巢組織混懸液中各級(jí)卵泡的計(jì)數(shù)Tab.2 The number of follicles in ovarian tissue suspension with different Freezing methods±s，個(gè)/100 μL 混懸液

注：與新鮮對(duì)照組相比，*P＜0.05

分組玻璃化冷凍組程序化冷凍組新鮮對(duì)照組F值P值始基卵泡76.50±8.91*79.67±10.40*91.50±8.70 9.214 0.001初級(jí)卵泡24.72±3.70 22.83±3.74*27.33±3.02 5.028 0.016次級(jí)卵泡10.33±3.05 9.50±3.46*12.55±3.25 3.872 0.037

2.3 卵巢組織體外培養(yǎng)上清液中E2 水平卵巢皮質(zhì)體外培養(yǎng)初期階段（D2?D6），玻璃化冷凍組和程序化冷凍組卵巢皮質(zhì)體外培養(yǎng)的雌二醇水平均低于新鮮卵巢組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)培養(yǎng)至D8，程序化冷凍組E2水平明顯低于新鮮對(duì)照組，D10?D14，兩冷凍組E2水平與新鮮對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 體外培養(yǎng)各組卵巢皮質(zhì)中E2濃度Fig.3 The concentration of E2 in the ovarian cortex of each group cultured in vitro

3 討論

2004年，DONNEZ 等［5］首次報(bào)道人類卵巢組織凍融和移植取得成功；2014年，MACKLON 等［6］報(bào)道了患者進(jìn)行凍融卵巢組織移植5年后獲得了活產(chǎn)嬰兒，為凍融卵巢組織移植術(shù)后的長(zhǎng)期時(shí)效增加了證據(jù)支持。卵巢組織冷凍不僅保存了一定數(shù)量的卵泡，還可恢復(fù)女性的生殖內(nèi)分泌功能，是激素敏感型腫瘤的最佳生育力保存方法。人卵巢組織冷凍和自體移植后活產(chǎn)率為25.4% ～ 30.6%，已被證實(shí)為生育力保存的有效方法［7］。美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)指出對(duì)于希望保留生育能力的年輕癌癥患者，卵巢組織冷凍和移植不再是試驗(yàn)性的方法［8］。

程序化冷凍和玻璃化冷凍均為保存卵巢組織常用的方法。程序化冷凍采用低濃度的冷凍保護(hù)劑，對(duì)細(xì)胞毒性小，是目前公認(rèn)的是卵巢組織冷凍的標(biāo)準(zhǔn)方法，但需昂貴的程序化冷凍儀，步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，易產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶致細(xì)胞損傷。玻璃化冷凍無需任何設(shè)備，簡(jiǎn)便易行，使細(xì)胞內(nèi)外的液體物質(zhì)迅速通過冷凍敏感區(qū)，最大限度避免細(xì)胞內(nèi)冰晶形成和降低細(xì)胞的損傷，亦被認(rèn)為是保存卵巢組織有效的方法［9-10］，但采用濃度相對(duì)較高的冷凍保護(hù)劑對(duì)卵巢組織的毒性尚不明確。LEE 等［11-12］認(rèn)為程序化冷凍能更好地保存人卵巢組織中卵泡活性和細(xì)胞增殖能力，玻璃化冷凍技術(shù)對(duì)始基卵泡的形態(tài)上造成較嚴(yán)重的損傷；SILBER 等［13-14］認(rèn)為相對(duì)于程序化冷凍而言，玻璃化冷凍技術(shù)可能更適合冷凍卵巢組織，尤其是卵巢基質(zhì)細(xì)胞。TERRACIANO 等［15］等認(rèn)為玻璃化方案可以更好地保存卵巢干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)卵泡的自我更新和再生，適用于卵巢早衰導(dǎo)致的不孕。SUGISHITA等［16］發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍和程序化冷凍法復(fù)蘇的卵巢組織卵泡分布的密度、形態(tài)學(xué)差異及DNA 碎片率無顯著差異；盡管卵巢組織冷凍已進(jìn)行了大量的研究，但關(guān)于兩種冷凍方法的優(yōu)劣尚未定論。

本文從卵巢組織冷凍前后卵泡形態(tài)學(xué)改變、卵巢組織混懸液中卵泡密度和卵巢組織體外培養(yǎng)液中的E2變化方面進(jìn)行研究，分析玻璃化冷凍法和程序化冷凍法的冷凍效果。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示兩種方法凍存卵巢組織中始基卵泡的效果相似，始基卵泡的完整率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩冷凍組始基卵泡的完整率均明顯低于新鮮對(duì)照組，說明冷凍過程對(duì)卵泡有一定的損傷；程序化冷凍組卵巢組織次級(jí)卵泡完整率與新鮮對(duì)照組相比有明顯差異，且低于玻璃化冷凍組，說明程序化冷凍對(duì)次級(jí)卵泡的保存效果較差。KLOCKE 等［17-18］認(rèn)為兩種方法在保存卵泡活性上相當(dāng)，但玻璃化冷凍對(duì)于卵巢基質(zhì)保存效果更好；LABRUNE 等［19］認(rèn)為玻璃化冷凍保存卵泡形態(tài)優(yōu)于程序化冷凍組，這均與本文的結(jié)果一致。DALMAN 等［14］認(rèn)為程序化冷凍比玻璃化冷凍對(duì)次級(jí)卵泡保存效果好，可能是因?yàn)槌绦蚧禍厮俣群筒ＡЩ鋬龇桨复嬖诓町悺?/p>

卵泡是女性最基本的生殖單位，卵巢組織冷凍過程中卵泡的完好是冷凍成功的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)中竇狀卵泡數(shù)量太少，因此未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。本研究?jī)衫鋬鼋M卵巢組織混懸液的始基卵泡密度均明顯低于新鮮對(duì)照組（P= 0.001），說明冷凍保存過程中卵泡有損傷；程序化冷凍組卵巢組織混懸液中初級(jí)和次級(jí)卵泡密度均明顯低于新鮮對(duì)照組，玻璃化冷凍組和新鮮對(duì)照組相比無明顯差異，說明玻璃化冷凍法對(duì)初級(jí)和次級(jí)卵泡的保存效果優(yōu)于程序化冷凍法。DESAI 等［20］認(rèn)為玻璃化冷凍組單個(gè)卵泡的損傷較??；SANFILIPPO 等［21］認(rèn)為玻璃化冷凍組卵巢皮質(zhì)中卵泡的密度0.6 個(gè)/mm2高于程序化冷凍組0.5 個(gè)/mm2；HERRAIZ 等［22］認(rèn)為玻璃化冷凍后卵巢組織始基卵泡密度大于程序化冷凍組；雖然后兩者分析卵巢組織切片中卵泡的密度，但對(duì)于單個(gè)卵泡的保存效果有一定的提示作用。

卵巢組織體外培養(yǎng)無需分離單個(gè)卵泡，卵泡的活性不會(huì)因酶解或機(jī)械分離而受損。另外，卵巢組織體外培養(yǎng)保持了卵母細(xì)胞及其與周邊支持細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)［18］。卵巢皮質(zhì)體外培養(yǎng)一方面反映出解凍后卵泡的生長(zhǎng)能力，另一方面也反映出冷凍過程對(duì)各級(jí)卵泡的損傷程度。本研究通過測(cè)定卵巢組織體外培養(yǎng)的卵泡液E2的折線圖看出，在體外培養(yǎng)過程中，卵巢組織能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，并具有一定的內(nèi)分泌功能。培養(yǎng)的初始階段（D2?D6），兩冷凍組卵巢組織分泌的E2水平較低，相對(duì)于新鮮卵巢組織差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能原因：其一，冷凍的卵巢皮質(zhì)復(fù)蘇后可能存在一個(gè)適應(yīng)階段，逐漸恢復(fù)其活性；其二，E2主要靠初級(jí)或次級(jí)卵泡分泌，在冷凍過程中，因初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡體積增大、卵泡液增多，冷凍損傷相對(duì)較大。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)（D8?D14），始基卵泡或初級(jí)卵泡發(fā)育并逐漸成熟，兩冷凍組卵巢皮質(zhì)培養(yǎng)液中E2與新鮮培養(yǎng)組接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這說明玻璃化冷凍和程序化冷凍可較好的保存卵巢組織中卵泡的活性，特別是始基卵泡和初級(jí)卵泡；LOCATELLI 等［23］報(bào)道的體外培養(yǎng)的羊卵巢組織E2的分泌遵循相同的趨勢(shì)，兩種冷凍法卵巢組織的E2在培養(yǎng)的第6 天后顯著增加，在培養(yǎng)的D9 與新鮮組織E2分泌量相近；OKTEM 等［24］研究結(jié)果顯示，人新鮮卵巢組織、程序化冷凍組和玻璃化冷凍組卵巢組培養(yǎng)至D3，新鮮卵巢組織的E2水平明顯高于兩冷凍組。與本研究的結(jié)果相似。

此外，從經(jīng)濟(jì)效益學(xué)分析，程序化冷凍法需要昂貴的程序化冷凍儀和消耗大量的液氮，操作步驟繁瑣，用時(shí)較長(zhǎng)，消耗大量的人力和物力；玻璃化冷凍法無需大型冷凍設(shè)備，簡(jiǎn)便易行，冷凍過程相對(duì)較短（＜30 min），其發(fā)展方向有可能像胚胎的玻璃化一樣普遍。

由于標(biāo)本收集的特殊性，本研究納入的標(biāo)本量相對(duì)較小，存在一定的局限性，結(jié)果可能不完全具有代表性，應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。且本文主要針對(duì)不同冷凍方法對(duì)卵泡活性的研究，對(duì)移植后卵巢皮質(zhì)的基因表達(dá)和激素水平尚需在后續(xù)的研究中進(jìn)一步評(píng)估。

綜上所述，無論采取何種冷凍方案，卵巢組織均能很好的耐受冷凍損傷，保存大部分卵泡活性。相對(duì)于程序化冷凍，玻璃化冷凍卵巢組織起步相對(duì)較晚，但操作簡(jiǎn)便、高效，且對(duì)次級(jí)卵泡的保存效果較好，其臨床應(yīng)用將如同胚胎和卵子玻璃化冷凍一樣普遍。另外，冷凍過程應(yīng)考慮卵巢皮質(zhì)的制備、冷凍保護(hù)劑的高滲透率和低毒性、操作人員的專業(yè)技能等因素，才能達(dá)到最佳的冷凍保存效果。人凍融卵巢組織的發(fā)育潛能尚需大量的異種移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。