高效液相色譜法測(cè)定藍(lán)莓提取物中 花色苷含量的測(cè)量不確定度評(píng)定

◎ 胡玉霞

（浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

藍(lán)莓物種名為越橘，杜鵑花科越橘屬植物（Vaccinium），是多年生灌木漿果果樹，20世紀(jì) 80年代由美國(guó)引入，因其果實(shí)為藍(lán)色而得名[1]。目前我國(guó)藍(lán)莓種植省份多達(dá)27個(gè)，產(chǎn)量大于50000 t[2]。藍(lán)莓水果營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，可即食亦可深加工為果醬、果干、果汁等。藍(lán)莓的深藍(lán)色主要是因?yàn)槠淦と庵懈缓ㄉ?，花色苷由花色素和糖以糖苷鍵結(jié)合而成，屬黃酮類物質(zhì)[3-5]，是一種有效的天然自由基清除劑，有抗氧化、抗衰老、抗癌等功效，在食品生產(chǎn)、生物制藥、護(hù)膚品等領(lǐng)域有應(yīng)用前景[6-8]。藍(lán)莓中的花色苷主要集中在深色的皮肉中，然而在實(shí)際加工中，藍(lán)莓渣大多卻被作為廢料處理，浪費(fèi)了資源。要開發(fā)藍(lán)莓渣深加工，變廢為寶，就需要對(duì)藍(lán)莓中花色苷的含量進(jìn)行測(cè)定，而不確定度評(píng)定是衡量檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要指標(biāo)[9]。本文以藍(lán)莓渣的提取物干粉為樣品，應(yīng)用高效液相色譜法，對(duì)其中最為常見的一種花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量進(jìn)行不確定度評(píng)定，為藍(lán)莓提取物中花色苷含量的檢測(cè)方法提供不確定度參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇，HPLC；乙腈，HPLC；甲酸，GR；磷酸，GR；鹽酸，GR；標(biāo)準(zhǔn)品：矢車菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物，純度99.9%；藍(lán)莓提取物干粉（浙江藍(lán)美生物）。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoU3000高效液相色譜儀配二級(jí)陣列檢測(cè) 器；ME203E梅 特 勒 電 子 天 平（0.0001 g）；ZorbaxExtend-C18液相色譜柱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用分析天平稱取花色苷矢車菊素葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品0.08 g，用2%（V/V）鹽酸甲醇溶解，超聲15 min使之完全溶解，定容至20 mL即得400 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)原液（-20 ℃保存7個(gè)月）。用移液管移取標(biāo)準(zhǔn)原液5 mL至25 mL的容量瓶中，用10%（V/V）磷酸水溶液定容即得80 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（-20 ℃保存 30 d）。

1.3.2 樣品處理

用分析天平準(zhǔn)確稱取0.125 g樣品倒入25 mL的容量瓶中，用2%（V/V）鹽酸甲醇約15 mL溶解，超聲處理15 min，置冷后定容。用移液管移取上述溶液5～25 mL的容量瓶中，用10%（V/V）磷酸水溶液定容，過0.45 μm濾膜，待液相色譜分析。

1.3.3 液相色譜條件

選用ZorbaxExtend-C18液相色譜柱，二級(jí)陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)535 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，流動(dòng)相A（10%甲酸水溶液）和流動(dòng)相B（甲酸∶水∶乙腈∶甲醇=40∶160∶90∶90），梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫條件表

1.4 建立數(shù)學(xué)模型

1.4.1 檢測(cè)程序

稱取分析試樣，質(zhì)量用m表示；用一定體積2%鹽酸甲醇溶液超聲處理，定容V1；分取V2，用10%磷酸水溶液稀釋定容至V3；試樣液及標(biāo)準(zhǔn)品過膜經(jīng)HPLC分析測(cè)定，得到樣液中矢車菊素葡萄糖苷含量c；計(jì)算樣品中矢車菊素葡萄糖苷含量x。

1.4.2 數(shù)學(xué)模型

藍(lán)莓提取物樣品中矢車菊素葡萄糖苷含量檢測(cè)的數(shù)學(xué)模型：

式中：x-試樣中矢車菊素葡萄糖苷含量，g·kg-1；c-處理樣液中矢車菊素葡萄糖苷的濃度，μg·mL-1；m-稱取試樣質(zhì)量，g；V1-稱取樣品定容體積，mL；V2-分取體積，mL；V3-分取樣品定容體積，mL；frep-重復(fù)性系數(shù)，由實(shí)驗(yàn)中各種隨機(jī)因素產(chǎn)生，數(shù)值上為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源

由檢測(cè)程序和數(shù)學(xué)模型可知，檢驗(yàn)過程中產(chǎn)生的不確定度主要包括稱樣過程、樣液定容過程、樣液稀釋過程、標(biāo)液配制過程、色譜儀器檢測(cè)過程和樣品平行測(cè)定的不確定度6個(gè)部分，詳見圖1。

圖1 不確定度來源分析圖

2.2 不確定度分量評(píng)定

2.2.1 樣品稱量導(dǎo)致的不確定度urel（m）

稱量所用萬(wàn)分之一分析天平的最大允許誤差是±0.0001 g，服從均勻分布k=，故電子天平稱取0.125 g樣品過程導(dǎo)致的相對(duì)不確定度為：

2.2.2 樣液定容導(dǎo)致的不確定度urel(v1)

（1）定容體積產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。樣品稱量后定容至25 mL容量瓶，根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[10]A級(jí)容量允差±0.03 mL，按均勻分布取。

（2）定容溫度變化所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為常溫（20±5）℃，容量瓶檢定溫度為20 ℃，此時(shí)水的膨脹系數(shù)是0.0018 /℃，取均勻分布則。

樣品定容時(shí)導(dǎo)致的合成不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 樣液稀釋產(chǎn)生的不確定度urel（V2-3）

（1）移液管分取樣液產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。用單標(biāo)線移液管移取5 mL樣液，其容量允差為±0.015 mL，按均勻分布取。

（2）定容產(chǎn)生的不確定度。稀釋定容至25 mL，不確定度由容量瓶容積和溫度變化兩部分組成，計(jì)算同2.2.2：

樣液稀釋導(dǎo)致的合成不確定度：

樣品稀釋導(dǎo)致的相對(duì)不確定度：

2.2.4 標(biāo)液配制過程導(dǎo)致的不確定度urel(s)

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。所購(gòu)買的標(biāo)品矢車菊素葡萄糖苷純度為99.9%，出廠標(biāo)物證書標(biāo)示其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為±0.2%，k=2，屬正態(tài)分布，則由標(biāo)準(zhǔn)品純度導(dǎo)致的相對(duì)不確定度為：

（2）標(biāo)樣稱量引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)品稱樣量為0.08 g，析天平的最大允許誤差是±0.0001 g，服從均勻分布，標(biāo)品稱量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

（3）標(biāo)樣定容引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)品定容過程產(chǎn)生的不確定度來自定容的容量瓶和溫度變化，計(jì)算方法同2.2.2，標(biāo)品定容至20 mL，20 mL容量瓶的最大允差為±0.03 mL，試驗(yàn)溫度為（20±5）℃，經(jīng)計(jì)算得urel(v2-3)=0.00527。

（4）標(biāo)樣稀釋引入的不確定度。標(biāo)樣稀釋過程同樣品稀釋過程2.2.3，則

（5）標(biāo)液配制過程產(chǎn)生的總相對(duì)不確定度。計(jì)算如下：

2.2.5 液相色譜儀產(chǎn)生的不確定度urel(q)

根據(jù)高效液相色譜儀校準(zhǔn)證書，液相色譜儀產(chǎn)生的不確定度為urel(q)=0.002。

2.2.6 樣品測(cè)定重復(fù)性引入的不確定度urel(frep)

樣品檢驗(yàn)過程中重復(fù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的不確定度主要包括樣品的均勻性、試劑的純度、天平和移液管、容量瓶的重復(fù)性等構(gòu)成，具有隨機(jī)性，屬于A類不確定度，對(duì)同一樣品，測(cè)定6平行，求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，詳見表2。樣品重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生相對(duì)不確定度為urel(frep)=RSD=0.00323。

表2 藍(lán)莓粉中花色苷矢車菊素葡萄糖苷的含量表（n=6）

2.3 合成相對(duì)不確定度urel(y)

藍(lán)莓提取物中花色苷矢車菊素葡萄糖苷含量測(cè)定不確定度的來源及各分量的測(cè)定結(jié)果見表3，根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL006:2019）[11]， 高效液相色譜花色苷矢車菊素測(cè)定的總合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表3 花色苷矢車菊素葡萄糖苷測(cè)定中各分量的 相對(duì)不確定度表

2.4 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

樣品中花色苷矢車菊素的含量為77.34 g·kg-1，在95%置信區(qū)間，包含因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度u(y)=2×0.0112=0.0224，矢車菊素葡萄糖苷的擴(kuò)展不確定度為：U(Y)=77.34×0.0226=1.73 g·kg-1。

2.5 測(cè)量不確定度結(jié)果報(bào)告

用高效液相色譜法測(cè)定藍(lán)莓粉中花色苷矢車菊素葡萄糖苷，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為77.34 g·kg-1時(shí)，描述為x=（77.34±1.73）g·kg-1；k=2，置信區(qū)間95%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)花色苷矢車菊素葡萄糖苷檢測(cè)過程中可能產(chǎn)生不確定度的6個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行計(jì)算分析。由表3可知液相色譜測(cè)定藍(lán)莓提取物中花色苷矢車菊素的不確定度主要來自標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程，其貢獻(xiàn)率達(dá)到31.73%，其次是樣品提取的定容和稀釋過程，均占22.17%，其他因素的影響相對(duì)較小。在用此方法測(cè)定藍(lán)莓提取物中花色苷矢車菊素葡萄糖苷的過程中，為控制測(cè)定的不確定度，應(yīng)控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)主要是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和樣品處理過程，如盡量選擇合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，讓標(biāo)液濃度與檢測(cè)樣液濃度接近以減小定量誤差，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性；樣品前處理過程中，注意取樣均勻，選取檢定合格的玻璃量器，并規(guī)范操作，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)樣品處理方法簡(jiǎn)單，未考慮加標(biāo)回收過程不確定度的貢獻(xiàn)，且用單標(biāo)定量，未考慮標(biāo)曲擬合過程的不確定度，這些都需要日后繼續(xù)研究。