楊春蘭， 張藝寧， 李志梅， 任潔釧

(1.北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部， 北京 100124；2.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)病學中心， 北京 100050)

彌散張量成像(diffusion tensor imaging, DTI)技術通過追蹤水分子擴散運動，顯示腦白質(zhì)纖維束的結構特征及空間分布. 基于體素分析(voxel-based analysis, VBA)是一種常用的DTI分析方法，通過比較大腦不同組織內(nèi)水分子擴散能力的差異，計算DTI指標，包括部分各向異性(fractional anisotropy, FA)、平均彌散率(mean diffusivity, MD)、軸向擴散率(axial diffusivity, AD)和徑向擴散率(radial diffusivity, RD)，然后進行客觀、定量的統(tǒng)計評估，得出存在差異的腦區(qū)，研究全腦微觀結構的改變. 但是，Raffelt等[1]認為體素內(nèi)可能包含多個方向的纖維束，體素平均值的定量分析不能代表纖維束的特異性，因此，提出了一種基于fixel分析(fixel-based analysis, FBA)的方法，通過對白質(zhì)軸突體積的測量，進一步檢測白質(zhì)纖維束內(nèi)微觀和宏觀結構變化情況. FBA方法通過約束球面反褶積(constrained spherical deconvolution, CSD)來追蹤同一體素內(nèi)的多個纖維走向，計算纖維束特異性指標，包括纖維密度(fiber density, FD)，纖維橫截面積(fiber cross-section, FC)及纖維密度和纖維橫截面積(fiber density and cross-section, FDC)[1]. 目前，F(xiàn)BA方法在青年腦損傷[2]、精神分裂癥[3]、阿爾茨海默病和輕度認知障礙癥[4]等研究中均發(fā)現(xiàn)患者白質(zhì)結構改變. 在顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)的研究中，Raffelt等[1]應用FBA方法發(fā)現(xiàn)患者白質(zhì)纖維束的FD、FC和FDC均顯著降低. 體素內(nèi)纖維束改變的示意圖如圖1所示.

圖1 纖維束橫截面的示意圖(灰色圓圈代表軸突，網(wǎng)格代表體素)[1]Fig.1 Schematic of a fiber bundle cross-section (grey circles represent axons, while the grid represents voxels)[1]

TLE是最常見的局灶性癲癇，也是最常見的藥物難治性癲癇[5]，其主要的病理改變包括海馬硬化和萎縮，病因包括炎癥、腦損傷、腫瘤、動靜脈畸形等. 癲癇患者的大腦神經(jīng)元異常放電，使得腦組織受損，基于DTI的研究發(fā)現(xiàn)，患者腦白質(zhì)損傷已超出顳葉[6-7]，但由癲癇引發(fā)腦白質(zhì)結構改變的病理機制尚不清晰，并且少有學者通過分析TLE患者軸突體積的變化來討論白質(zhì)結構改變. 因此，本研究聯(lián)合VBA和FBA方法，對TLE患者全腦白質(zhì)進行微觀和宏觀統(tǒng)計分析，進一步討論癲癇患者白質(zhì)纖維束受損情況，為了解癲癇患者白質(zhì)結構及癲癇疾病的病理生理機制提供幫助.

1 實驗對象與方法

1.1 實驗對象

選取2017年10月—2018年10月就診于北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的TLE患者23例(男性15例，女性8例)，所有患者均完成影像學數(shù)據(jù)及臨床資料(年齡、病程、首發(fā)年齡等)的采集. 納入標準：診斷符合國際抗癲癇聯(lián)盟關于TLE的診斷標準，腦電圖(electroencephalogram, EEG)檢查顯示病灶位于或起源于顳葉. 排除標準：藥物濫用者、精神疾病者、患有影響智力的其他疾病者、無法配合完成實驗者以及檢查不合格者. 同時招募30例(男性18例，女性12例)年齡、性別相匹配的無精神及神經(jīng)系統(tǒng)疾病史、無腦血管病危險因素，且腦影像圖像未見明顯病變及變異的健康受試者作為對照. 所有受試者均簽署了知情同意書且實驗獲得北京天壇醫(yī)院倫理委員會批準.

1.2 實驗方法

1.2.1 數(shù)據(jù)采集

采用Siemens Trio 3.0 T磁共振成像系統(tǒng)對所有受試者進行掃描，其DTI掃描參數(shù)為：使用單次激發(fā)平面回波成像序列(echo planar imaging，EPI)，按照軸狀位無間隔掃描75層，30個擴散梯度方向(b=1 000 s/m2)，1個無擴散加權方向(b=0 s/m2)，F(xiàn)OV=256 mm×256 mm，TR=8 000 ms，TE=60 ms，層厚=2.0 mm. T1加權結構圖像掃描參數(shù)為：TR=2 300 ms，TE=2.32 ms，翻轉時間(TI)=900 ms，翻轉角=8°，視野(FOV)=100 mm×100 mm，矩陣=256×256，層數(shù)=192，層厚=0.9 mm，無間距掃描. 所有圖像均經(jīng)目測評價以確保成像質(zhì)量.

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

VBA方法基于Linux系統(tǒng)下的PANDA(https:∥www. nitrc. org/projects/panda)軟件[8]對實驗數(shù)據(jù)進行的預處理，該軟件集成了多個現(xiàn)有軟件包，包括FMRIB軟件庫(FSL)、PSOM(Pipeline System for Octave and Matlab)、Diffusion Toolkit和MRIcron；使用SPM8(http:∥www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm)軟件對平滑標準化后的DTI圖像進行統(tǒng)計學分析；采用xjview(http:∥www.alivelearn.net/xjview/)軟件進行差異結果顯示. 數(shù)據(jù)處理步驟如下：1) 將所有受試腦圖像的DICOM文件轉換成NIFTI文件; 2) 剔除非腦組織，構建腦mask圖像; 3) 圖像截取，剪除非腦圖像區(qū)域; 4) 對圖像進行渦流校正和頭動校正，以消除運動和渦流引起的失真; 5) 計算每個受試的DTI指標(FA、MD、AD和RD); 6) 將個體圖像非線性配準到蒙特利爾(Montreal neurological institute, MNI)標準空間; 7) 圖像平滑，通過高斯核對參數(shù)圖像進行平滑(6 mm×6 mm×6 mm)，之后進行標準化處理.

將上一步所有受試的FA、MD、AD和RD圖像導入SPM8中，利用一般線性模型進行組間差異比較，計算后得到統(tǒng)計參數(shù)圖，隨后利用xjview軟件進行結果顯示，p<0.001(未校正)且簇(cluster)閾值為50個相鄰體素，記作有統(tǒng)計學意義.

FBA方法基于Linux系統(tǒng)下的MRtrix3(http:∥www.mrtrix.org/)軟件包[9]和FSL(https:∥fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/)軟件工具包進行數(shù)據(jù)處理. 數(shù)據(jù)處理流程如下. 預處理：1) 將所有受試的DTI數(shù)據(jù)從DICOM格式轉換成符合MRtrix3分析的mif格式; 2) 去除圖像的噪聲和偽影; 3) 對圖像進行頭動校正和渦流校正，構建腦mask圖像; 4) 結合b0圖像進行偏差場校正; 5) 對所有受試圖像進行標準化，獲得FA模板和mask圖像. FBA分析：1) 計算每個受試的白質(zhì)響應函數(shù); 2) 對標準化后的圖像進行重采樣，體素大小為1.3 mm; 3) 利用限制球面反褶積算法對每個受試的纖維取向分布(fiber orientation distributions, FOD)進行估計; 4) 基于所有受試構建無偏FOD模板; 5) 將每個受試的FOD配準到FOD模板上; 6) 計算所有受試mask圖像的交集; 7) 分割FOD圖，計算FD、FC和FDC指標; 8) 進行概率性纖維追蹤，構建fixel連接矩陣; 9) 進行2組間統(tǒng)計分析，利用非參數(shù)統(tǒng)計檢驗，置換次數(shù)為5 000，采用family wise error (FWE)校正來抵消多重比較，當p<0.05時認為有統(tǒng)計學意義，并使用MRtrix3包中的mrview軟件來顯示有差異的腦區(qū).

1.2.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件，分別對2組間年齡進行雙樣本t檢驗，對性別進行卡方檢驗，以p<0.05為閾值記為有統(tǒng)計學意義. 利用VBA和FBA方法在進行組間差異比較及相關性分析時，添加年齡和性別為協(xié)變量.

2 結果

2.1 受試者情況

TLE組的年齡(31.33±11.379)和健康組的年齡(28.60±7.283)差異無統(tǒng)計學意義(p=0.294)，TIE組的性別(15男、8女)和健康組的性別(18男、12女)差異無統(tǒng)計學意義(p=0.698)，癲癇患者的平均病程為(14.97±9.242) a，平均發(fā)病年齡為(16.20±12.071)歲.

2.2 VBA結果

TLE組較健康組表現(xiàn)出多個腦區(qū)的FA值、MD值、AD值和RD值異常. 其中，F(xiàn)A值減少的主要腦區(qū)包括：右側腦橋、顳葉(顳上、下回、海馬)、雙側豆狀蒼白球、雙側豆狀殼核、雙側胼胝體、邊緣葉(鍥前葉、扣帶回、前扣帶和旁扣帶腦回)、雙側島葉、頂葉(頂葉小葉、角回)和額葉(額內(nèi)側回、中央前回、中央后回)(見表1、圖2(a))；MD值增加的主要腦區(qū)包括：顳葉(顳中回、海馬、梭狀回)、邊緣葉(海馬旁回)和額葉(額中回)(見表2、圖2(b))；AD值增加的主要腦區(qū)包括：顳葉(顳極：顳上、中回、海馬、梭狀回)和邊緣葉(海馬旁回)(見表3、圖2(c))，RD值增加的主要腦區(qū)包括：顳葉(梭狀回、顳中回)、枕葉(距狀裂周圍皮層)、雙側胼胝體、右側屏狀核、右側豆狀殼核、邊緣葉(海馬旁回、扣帶回)、額葉(中央前回、補充運動區(qū))和頂葉(頂葉小葉)(見表4、圖2(d)). 圖2的左右分別對應受試者的左右，簇閾值設為50個體素.

表1 TLE患者組FA值減少的主要腦區(qū)

圖2 癲癇組較健康組有差異的t值分布(p<0.001，未校正)的VBA結果Fig.2 VBA results of the t value distribution in TLE group and healthy group (p<0.001, uncorrected)

表2 TLE患者組MD值增加的主要腦區(qū)

表3 TLE患者組AD值增加的主要腦區(qū)

表4 TLE患者組RD值增加的主要腦區(qū)

2.3 FBA結果

與健康組相比，TLE患者腦區(qū)白質(zhì)的FD在雙側胼胝體、雙側上縱束和右側鉤束降低(p<0.05，F(xiàn)WE校正)，F(xiàn)C在雙側胼胝體、右側內(nèi)囊和右側上縱束降低(p<0.05，F(xiàn)WE校正)，F(xiàn)DC在雙側胼胝體、雙側上縱束、右側內(nèi)囊、右側后放射冠和右側小腦中腳降低(p<0.05，F(xiàn)WE校正)，結果如圖3所示.

圖3 FBA結果，癲癇組較健康組FD、FC和FDC有差異的t值分布 (p<0.05，F(xiàn)WE校正)Fig.3 FBA results of the t value distribution of FD, FC and FDC in TLE group and healthy group (p<0.05, FWE corrected)

2.4 相關性分析結果

兩組間有差異腦區(qū)的DTI指標(FA、MD、AD、RD、FD、FC和FDC)與病程均無相關性(p>0.05)，其中控制了年齡和性別的影響.

3 分析與討論

DTI技術通過追蹤腦組織間水分子的擴散運動，得到三維空間彌散特性圖像，來顯示白質(zhì)纖維束的結構差異. 目前，DTI常用的分析方法主要包括：手繪感興趣區(qū)(region of interest, ROI)法、纖維束示蹤空間統(tǒng)計分析(tract-based spatial statistics, TBSS)方法和VBA方法3種. 其中，VBA方法是基于全腦計算存在統(tǒng)計學差異的腦區(qū)，而FBA方法是一種分析白質(zhì)纖維束形態(tài)的方法，2016年由 Raffelt等[1]提出，通過檢測單個體素內(nèi)不同纖維束走向，來顯示纖維束的解剖信息，并提出了FD、FC和FDC這3種指標.

VBA是基于體素水平的全腦圖像分析方法，它能夠自動地進行統(tǒng)計分析，無須先驗假設. 但該方法可能受配準、平滑等因素的影響，因此，在設計實驗時，對簇閾值、p值進行了嚴格設定；FBA方法是一種檢測白質(zhì)形態(tài)學改變的方法，能夠有效地檢測纖維束內(nèi)軸突體積的改變. 本文通過結合VBA與FBA兩種方法，分析TLE患者全腦微觀結構的變化情況，進一步探討白質(zhì)形態(tài)學的改變，為更好地研究癲癇患者大腦白質(zhì)宏觀和微觀結構改變提供理論依據(jù).

本研究通過VBA方法對TLE患者FA、MD、AD和RD的變化特征進行了統(tǒng)計分析. 結果顯示，TLE組的FA值存在廣泛降低，涉及腦橋、顳葉、額葉、島葉、頂葉和邊緣葉等多個腦區(qū)(見表1)；MD值增加的主要腦區(qū)涉及顳葉、額葉和邊緣葉(見表2)；AD值增加的主要腦區(qū)涉及顳葉和邊緣葉(見表3)，RD值增加的主要腦區(qū)涉及顳葉、枕葉、邊緣葉、額葉、頂葉等(見表4). 這說明TLE患者因長期的大腦神經(jīng)元異常放電及癲癇的反復發(fā)作使得白質(zhì)微觀結構受損，如神經(jīng)細胞丟失、膠質(zhì)細胞增生及髓鞘完整性受損等，常表現(xiàn)為局部腦白質(zhì)FA值的降低；白質(zhì)纖維束完整性受損，局部細胞間隙的加寬，使得水分子的彌散運動能力增強，常表現(xiàn)為局部腦白質(zhì)MD值增加；AD和RD則是水分子在軸向和徑向的擴散率，與纖維束髓鞘的變化有關，可進一步反映水分子在軸向和徑向的擴散運動程度. 這些彌散指標的差異也說明癲癇患者的腦白質(zhì)微觀結構發(fā)生了改變. 基于VBA方法的研究發(fā)現(xiàn)，TLE患者白質(zhì)纖維束完整性受損，普遍表現(xiàn)為FA值顯著降低及MD值顯著增加[10-12]，TBSS分析方法的研究也有類似的發(fā)現(xiàn)[13-14].

FBA方法通過計算2組間的指標差異，發(fā)現(xiàn)與健康組相比，患者組的FD、FC及FDC均降低，這一結果與Raffelt等[1]研究一致. 其中，F(xiàn)D代表的是體素內(nèi)限制水的體積，F(xiàn)D降低表明體素內(nèi)限制水的體積減少和纖維束軸突丟失；FC代表的是白質(zhì)軸突體積的變化，是通過測量纖維束在垂直于固定方向的橫截面積來計算軸突體積的，F(xiàn)C降低表明纖維束萎縮；FDC代表的是纖維束的FD和FC均改變，F(xiàn)DC降低表明纖維束傳遞信息的能力下降[1].

本研究表明癲癇患者的FD在雙側胼胝體、雙側上縱束和右側鉤束降低；FC在雙側胼胝體、右側內(nèi)囊和右側上縱束降低；FDC在雙側胼胝體、雙側上縱束、右側內(nèi)囊、右側后放射冠和右側小腦中腳降低. Vaughan等[15]進一步研究伴有海馬硬化TLE患者，發(fā)現(xiàn)伴有海馬硬化的TLE患者FDC在同側穹窿、鉤狀束、下縱束、額枕下束、海馬旁帶和弓狀束下降明顯，而未伴有海馬硬化的TLE患者FDC表現(xiàn)出雙側減少，主要表現(xiàn)在胼胝體前部和背側扣帶.

胼胝體是大腦半球中最大的連合纖維，連接了左右兩側大腦半球[16]. 本研究聯(lián)合VBA和FBA方法發(fā)現(xiàn)，胼胝體的FA、FD、FC及FDC值均較健康組減少，RD值較健康組增加，這可能是由于胼胝體結構受損，導致體素內(nèi)水分子體積減小、軸突丟失、髓鞘完整性受損、纖維束萎縮，呈現(xiàn)出DTI指標的差異. 其中，F(xiàn)D、FC及FDC值減少，說明纖維束軸突丟失且萎縮，而RD值在白質(zhì)丟失時會增加[17]，這說明本研究2種分析方法結果一致. 趙地等[18]和尹相媛等[19]發(fā)現(xiàn)TLE患者的胼胝體FA值減少，RD值增加，與本研究結果一致. 基于體素的形態(tài)學測量(voxel-based morphometry, VBM)研究發(fā)現(xiàn)TLE患者胼胝體的體積縮小[20-21]. 該結果進一步證實了癲癇患者的胼胝體結構受損，并且從另一種視角討論體素截面信息變化情況.

上縱束是人腦中重要的聯(lián)絡纖維之一，連接了額葉、頂葉、枕葉及顳葉腦區(qū)[22]，本研究發(fā)現(xiàn)癲癇患者上縱束的FD、FC和FDC均降低，患者顳葉、頂葉及額葉的FA值降低，顳葉及額葉的MD值增加，顳葉、枕葉、額葉及頂葉的RD值增加，這些改變可能與癲癇患者的上縱束受損有關，癲癇發(fā)作導致神經(jīng)元異常放電，上縱束結構受損，阻礙了信息傳遞，使得與上縱束相鄰腦區(qū)受損. 有研究表明，MD值增加與軸突受損有關[17]，而FA值與纖維束完整性有關[23]. 基于FBA方法得出，上縱束的FD、FC和FDC減少，說明纖維束丟失且萎縮，與VBA方法結果基本一致. Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)TLE患者上縱束等FA值降低.

研究還發(fā)現(xiàn)癲癇組右側鉤束只有FD降低，說明纖維束軸突丟失，但沒有發(fā)生萎縮；VBA結果表明癲癇組顳葉和額葉的FA值降低，且MD和RD值增加. 其中，鉤束是額葉和顳葉連接的重要纖維束[25]，因此，推測TLE患者的額顳葉可能存在膠質(zhì)增生、神經(jīng)細胞或軸突缺失及髓鞘脫落等結構損傷. 有研究證實TLE患者鉤束的FA值降低[24,26]，并與認知功能障礙密切相關[27-28].

右側內(nèi)囊的FC降低以及右側放射冠、內(nèi)囊和小腦中腳的FDC降低，說明纖維束可能存在萎縮. 內(nèi)囊位于基底神經(jīng)核與丘腦之間，與放射冠相連，VBA結果指出癲癇患者丘腦FA值減少. TBSS研究白質(zhì)纖維束完整性發(fā)現(xiàn)TLE患者放射冠、內(nèi)囊、矢狀層等結構的FA值降低[18].

有研究表明病程與腦白質(zhì)損傷相關[29-31]. Zhang等[32]發(fā)現(xiàn)癲癇患者丘腦的FA值與病程呈負相關，認為丘腦的結構異常程度隨病程的延長而增加. 在兒童癲癇疾病的研究中，Carolina等[33]發(fā)現(xiàn)患兒的病程越長，白質(zhì)受損越明顯，認知功能越差. 而張遠超等[34]研究發(fā)現(xiàn)TLE患者語言商的受損與發(fā)病年齡小有關，與病程無關，故癲癇發(fā)作越早，患者認知功能受損越明顯. 本實驗研究成年癲癇患者DTI指標與病程之間關系，未發(fā)現(xiàn)相關性，這可能與實驗例數(shù)少或患者病程長短不一有關. 有研究對不同病程分組討論(病程≤5a組，病程>5a組)，發(fā)現(xiàn)TLE患者病程>5a組其腦網(wǎng)絡異常更顯著[35].

4 結論

1) 本研究表明TLE患者DTI指標較健康被試存在廣泛改變，白質(zhì)纖維束完整性受損.

2) 本研究使用2種分析方法，VBA方法針對全腦進行統(tǒng)計分析，為提高實驗結果的可重復性，排除了年齡和性別的影響，簇閾值設為50個體素，p<0.001認為存在統(tǒng)計學差異；FBA方法針對全腦白質(zhì)進行統(tǒng)計分析，為提高實驗結果的可重復性，同樣排除了年齡和性別的影響，對p值進行了FWE校正，p<0.05認為存在統(tǒng)計學差異. 這2種方法為理解TLE患者全腦白質(zhì)結構提供了客觀途徑，有助于理解癲癇疾病的病理機制.

3) 在后續(xù)研究中，將擴大樣本數(shù)量，補充VBM和TBSS方法實驗(VBM是對全腦分析灰、白質(zhì)體積進行統(tǒng)計分析的；TBSS是通過白質(zhì)骨架來計算并分析白質(zhì)纖維束差異的)，還可以將DTI指標與認知評分相結合，討論腦白質(zhì)結構改變與認知功能之間的關系，為理解TLE疾病認知功能障礙提供依據(jù).