劉伯承，王 慧，劉俊琦，杜麗飛，劉彬揚，楊 俊※

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131；2.湖南省長沙市芙蓉區(qū)大同第三小學，湖南長沙410125）

發(fā)展和壯大生態(tài)健康養(yǎng)殖是我國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化建設的重要基礎。近年來，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構不斷深入改革和完善，區(qū)域化、集中化、規(guī)?；蔀楫斍梆B(yǎng)殖發(fā)展的新形式，同時生物安全法也在新的形式下即將落地，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了新的機遇與挑戰(zhàn)。要建立健全綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖模式，打造無疫區(qū)生態(tài)養(yǎng)殖，做好消毒滅源是其關鍵抓手。過硫酸氫鉀復合物是由過硫酸氫鉀（KHSO5）、硫酸氫鉀（KHSO4）和硫酸鉀（K2SO4）組成的固體物質[1]，通過破壞細菌細胞壁蛋白及其通透性發(fā)揮殺菌作用，具有活性高、穩(wěn)定、無毒副作用等優(yōu)點[2]。目前，在獸藥中作為一種廣譜、高效、安全殺毒劑被廣泛應用[3]。然而，養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中環(huán)境因素復雜，加上基礎人員對不同消毒劑特點認識不到位，導致盲用、濫用的現(xiàn)象，因此，應根據(jù)不同的環(huán)境和使用目的來合理選擇使用消毒劑，使其提高殺菌效率。本研究以奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌為受試株，通過懸菌液定量殺滅試驗研究了不同梯度濃度，不同時間及溫度作用下過硫酸氫鉀復合粉的殺滅效率，以期為防控奶牛乳房炎及養(yǎng)殖生產(chǎn)中消毒劑的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

潔凈工作臺，購自力康精密科技（上海）有限公司；水浴恒溫搖床，購自常州國宇儀器制造有限公司；漩渦混合器，購自常州越新儀器制造有限公司；血瓊脂培養(yǎng)基，購自貝瑞特生物科技有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基，購自杭州百思生物科技有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自青島海博生物科技有限公司；過硫酸氫鉀復合粉，購自佛山市某制藥有限公司，批號：獸藥字190373276，含有效氯不少于10%；硫代硫酸鈉，購自上海邁瑞爾化學技術有限公司；PBS緩沖液，購自長沙市博儀生物科技有限公司。

1.2 受試菌株

金色葡萄球菌為湖南省畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)獸藥實驗室經(jīng)鑒定保存的菌株。

1.3 實驗方法

1.3.1 懸菌液和消毒液的制備

懸菌液的制備：無菌挑取單個菌落置5mL LB肉湯的試管中，水浴恒溫培養(yǎng)14h后做細菌菌落計數(shù)，用滅菌水調整菌落數(shù)濃度至1×107～5×107CUF/mL4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制：取10g PBS緩沖液（干粉），溶于800 mL去離子水中，定容至1000 mL，調整pH 7.2～7.4，121℃高壓蒸汽滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

中和劑的配制：取硫代硫酸鈉1200 mg加入400 mL PBS中，121℃高壓蒸汽滅菌后4℃保備用。

消毒劑的配制：臨用前取1g過硫酸氫鉀復合粉置400mL PBS稀釋液中。

1.3.2 中和劑鑒定試驗

以上述調整好的懸菌液為受試菌液，參照2002年版《消毒技術規(guī)范》[4]消毒劑殺微生物試驗中和劑鑒定試驗規(guī)定進行操作及結果判定。設a、b、c、d、e、f共6組，a組：消毒劑＋菌懸液，用于驗證消毒劑的殺菌效果；b組：（消毒劑＋菌懸液）＋中和劑，用于驗證消毒劑在殺滅細菌后能否被完全中和；c組：中和劑＋菌懸液，用于驗證中和劑對細菌的生長是否有抑制作用；d組：（消毒劑＋中和劑）＋菌懸液，用于驗證中和產(chǎn)物對細菌的生長是否有抑制作用；e組：稀釋液＋菌懸液，為陽性照組；f組：稀釋液＋中和劑，為陰性對照組。

具體操作：取0.5 mL調整好的懸菌液加入至4.5 mL消毒劑（2.5 mg/L）的試管中，室溫下作用5 min；取0.5 mL混合液加入至4.5 mL中和劑（3 g/L硫代硫酸鈉）的試管中，作用10 min；c、d、e組做1000倍稀釋，取100 μL涂布到STA平板上（做兩個平行板），37℃培養(yǎng)18～24 h，每個試驗重復3次，計算細菌菌落數(shù)，結果取平均值。

1.3.3 不同溫度和作用時間下懸菌液定量殺滅試驗

試驗設A組（1min）、B組（5min）、C組（10min）、D組（陽性對照）、E組（陰性對照）。每組分別在4℃、20℃、30℃環(huán)境溫度下取0.5mL濃度為1×107～5×107CUF/mL懸菌液加入至含4.5mL的消毒液（KHSO4）試管中，作用規(guī)定時間后取0.5mL混合液加入至4.5mL中和劑中，作用10 min后取100μL至STA平皿涂板，37℃培養(yǎng)20 h，同時設置以PBS替代消毒液為陽性對照組，以同批STA平板為陰性對照；每組試驗重復3次，取其平均值。

2 結果

2.1 中和劑鑒定試驗

根據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》中和劑判斷標準，從表1可以看出，a組無菌生長，b組菌落數(shù)明顯減少，c、d、e組菌落數(shù)比較接近，誤差率＜15%，f組無菌落生長。說明硫代硫酸鈉對過硫酸氫鉀復合粉有較好的中和效果，符合本實驗要求。

2.2 不同溫度和作用時間下懸菌液定量殺滅試驗

3種不同濃度（1:400、1:800、1:1600）過硫酸氫鉀復合粉在5 min和4℃、20℃、30℃作用條下對金色葡萄球菌的殺滅達100%，而在1 min和4℃條件作用下分別為98.6%、95.5%、92%；1 min時間作用下，同一濃度的殺滅率隨著溫度的上升有所提高，說明時間對殺滅效果的影響較明顯，溫度從4℃升高至30℃有利于殺滅效果（見表2）。

表2 過硫酸氫鉀復合粉對金黃色葡萄菌的殺滅率

3 討論

目前，畜禽業(yè)常用的化學消毒劑主要有鹵素類（氯制劑、溴制劑、碘制劑）、氧化劑類、酸堿類、酚類、醛類、表面活性劑、醇類等[5]。各種消毒劑因其特點發(fā)揮不同的消毒效果，因此合理使用消毒劑對疫病防控及消毒滅源至關重要。同時，鑒于傳統(tǒng)消毒劑在一些安全性和抗性方面的缺點，新一代低毒高效適用廣泛復合消毒劑的研發(fā)受到關注，過硫酸氫鉀復合粉作為新一代高效安全消毒劑的代表，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)被廣泛使用。

研究結果發(fā)現(xiàn)3種不同濃度過硫酸氫鉀復合粉在5 min和4℃、20℃、30℃作用條下對金色葡萄球菌的殺滅達100%，說明時間對懸菌液的作用影響顯著。在不同濃度組，溫度從4℃升高至30℃時過硫酸氫鉀復合粉對金黃色葡萄球菌殺滅效率均有提高，且在低濃度組中殺滅率的提高比高濃度組更為明顯，與王娟等[6]研究結果相近；在生產(chǎn)實踐中消毒劑對不同菌屬殺滅效果也有差異，劉元元等[7]研究發(fā)現(xiàn)在畜禽舍現(xiàn)場表面過硫酸氫鉀復合粉對革蘭氏陰性菌的殺滅效果明顯優(yōu)于革蘭氏陽性菌，且在1∶400濃度下作用10min對金色葡萄球菌的殺滅率為89.73%。

過硫酸氫鉀復合粉對病毒類微生物也表現(xiàn)出較好殺滅效果，我國在非洲豬瘟發(fā)生后，過硫酸氫鉀復合粉成為豬場防控消毒的常用消毒劑。楊瑞梅等[8]在研究豬場非洲豬瘟消毒中發(fā)現(xiàn)，過硫酸氫鉀復合粉消毒后舍內環(huán)境細菌數(shù)從300 cuf/m2降至50 cuf/m2，ASFV（非洲豬瘟病毒）熒光定量檢測全部為陰性。殺菌作用明顯；張交兒等[9]研究發(fā)現(xiàn)，濃度為1000 mg/L的過硫酸氫鉀復合粉溶液作用5 min，可有效滅活懸液內ASFV；在秦濤等[10-11]對4種消毒劑對H5N6亞型流感病毒、H7N9亞型流感病毒的殺滅效果研究中，過硫酸氫鉀復合物在推薦使用量下對H5N6、H7N9亞型流感病毒無殺滅作用，需使用0.2%（W/V）溶液作用10 min才有殺滅效果，但相比其他成分消毒劑依然表現(xiàn)出了濃度低、作用時間短的優(yōu)勢。

大量研究證明，過硫酸氫鉀復合物活性好、穩(wěn)定、低毒、使用方便，可用于各種環(huán)境、器具、進出場人員及舍內帶豬消毒，但現(xiàn)場使用中建議根據(jù)不同環(huán)境和季節(jié)調整濃度和作用時間，可提高對病原微生物的有效殺滅率。