蘇珊珊 劉慧 修方睿 王冬燕

山東省中醫(yī)院腎病科（濟南 250011）

體內(nèi)持續(xù)的高糖環(huán)境可促進腎小球系膜細胞損傷，并可引起氧化應激、炎癥反應及誘導細胞凋亡進而促進糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展[1-2]。微RNA（miRNA）是一種小的非編碼RNA（長度約22個核苷酸），參與細胞增殖和凋亡等生物過程[3-4]。據(jù)報道，miRNA在糖尿病腎病中表達異常，可調(diào)控腎小球系膜細胞增殖及凋亡等生物學行為[5-6]，是糖尿病腎病潛在的治療靶點。研究[7]顯示，miR-92a-3p在腎臟組織損傷中表達水平升高，抑制其表達可減輕腎組織損傷。但miR-92a-3p在糖尿病腎病中的作用尚不清楚。TargetScan預測顯示miR-92a-3p與同源盒蛋白 13（Homeobox protein 13，HOXA13）存在結(jié)合位點。研究[8]表明HOXA13在高糖誘導的腎小球系膜細胞中表達下調(diào)。miR-92a-3p是否能通過調(diào)控HOXA13參與糖尿病腎病的進展鮮有報道。因此，本研究旨在探討miR-92a-3p是否可通過靶向調(diào)控HOXA13的表達而參與高糖誘導的腎小球系膜細胞損傷過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑美國ATCC公司提供小鼠腎小球系膜細胞SV40-MES-13；美國Gibco提供DMEM培養(yǎng)液與胎牛血清；北京全式金生物公司提供Trizol試劑；美國Thermo Fisher公司提供Lipofectamine2000、cDNA合成及qRT-PCR試劑；上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供anti-miR-NC、anti-miR-92a-3p、pcDNA、pcDNA-HOXA13、miR-NC、miR-92a-3p mimics、si-NC、si-HOXA13；北京索萊寶公司提供細胞凋亡檢測試劑盒與雙熒光素酶活性檢測試劑盒；美國Promega公司提供雙熒光素酶報告基因載體；英國Abcam公司提供兔抗鼠HOXA13抗體；美國CST公司提供兔抗鼠Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-12抗體；武漢博士德生物公司提供HRP標記的山羊抗兔IgG二抗。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組取對數(shù)生長期SV40-MES-13細胞接種于6孔板（1×104個/孔），分為對照組（正常培養(yǎng)的SV40-MES-13細胞）、高糖組（用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基處理細胞 24 h[9]）、anti-miR-NC+高糖組（anti-miR-NC轉(zhuǎn)染SV40-MES-13細胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基處理細胞24 h）、anti-miR-92a-3p+高糖組（anti-miR-92a-3轉(zhuǎn)染SV40-MES-13細胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基處理細胞24 h）、pcDNA+高糖組（pcDNA轉(zhuǎn)染SV40-MES-13細胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基處理細胞24 h）、pcDNA-HOXA13+高糖組（pcDNAHOXA13轉(zhuǎn)染SV40-MES-13細胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基處理細胞24 h）、anti-miR-92a-3p+si-NC+高糖組（anti-miR-92a-3p和si-NC共轉(zhuǎn)染SV40-MES-13細胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基處理細胞24 h）、anti-miR-92a-3p+si-HOXA13+高糖組（anti-miR-92a-3p和si-HOXA13共轉(zhuǎn)染SV40-MES-13細胞后用含30 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基處理細胞24 h），采用Lipofectamine2000進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-92a-3p、HOXA13mRNA的表達水平采用Trizol試劑提取SV40-MES-13細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，應用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測miR-92a-3p、HOXA13 mRNA相對表達量。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率各組SV40-MES-13細胞加入預冷PBS洗滌后棄上清，按照凋亡檢測試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.2.4 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-92a-3p與HOXA13的靶向關(guān)系HOXA13-3'UTR-WT/miRNC、HOXA13-3'UTR-MUT/miR-NC、HOXA13-3'UTR-WT/miR-92a-3p mimics、HOXA13-3'UTR-MUT/miR-92a-3p mimics分別共轉(zhuǎn)染至SV40-MES-13細胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測細胞熒光素酶活性。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-NC、miR-92a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-92a-3p分別轉(zhuǎn)染至SV40-MES-13細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，采用Western blot法檢測HOXA13蛋白水平。

1.2.5 Western blot檢測 HOXA13、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspas e-12蛋白表達量收集各組SV40-MES-13細胞加入500 μL RIPA裂解液提取細胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，每孔道加入30 μg蛋白進行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉 2 h，加入 HOXA13（1∶800）、Cleaved-caspase-3（1∶800）、Cleaved-caspase-12（1∶800）一抗與內(nèi)參β-actin抗體（1∶3 000）稀釋液，4℃孵育過夜，加入二抗稀釋液（1∶5 000）37℃ 孵育2 h，用Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖對腎小球系膜細胞miR-92a-3p和HOXA13表達的影響與對照組比較，高糖組miR-92a-3p的表達量升高（P＜0.05），HOXA13 mRNA及蛋白水平降低（P＜ 0.05），見圖1、表1。

圖1 Western blot檢測HOXA13的蛋白表達量Fig.1 Western blot detection of HOXA13 protein expression

表1 高糖對腎小球系膜細胞miR-92a-3p和HOXA13表達的影響Tab.1 Effects of high glucose on the expression of miR-92a-3p and HOXA13 in glomerular mesangial cells ±s

表1 高糖對腎小球系膜細胞miR-92a-3p和HOXA13表達的影響Tab.1 Effects of high glucose on the expression of miR-92a-3p and HOXA13 in glomerular mesangial cells ±s

組別對照組高糖組t值P值miR-92a-3p 1.00±0.11 2.43±0.21 18.096＜0.001 HOXA13 mRNA 1.00±0.10 0.43±0.04 15.877＜0.001 HOXA13蛋白0.82±0.08 0.34±0.03 16.854＜0.001

2.2 anti-miR-92a-3p對高糖介導的腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡的影響與對照組比較，高糖組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-12蛋白水平升高（P＜0.05）；與anti-miR-NC+高糖組比較，anti-miR-92a-3p+高糖組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-12蛋白水平降低（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 過表達miR-92a-3p對高糖介導的腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡和相關(guān)蛋白表達的影響Fig.2 Effect of overexpression of miR-92a-3p on apoptosis and related protein expression of high glucose mediated glomerular mesangial cell SV40-MES-13

表2 高糖對腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡的影響Tab.2 Effect of high glucose on apoptosis of glomerular mesangial cells SV40-MES-13 ±s

表2 高糖對腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡的影響Tab.2 Effect of high glucose on apoptosis of glomerular mesangial cells SV40-MES-13 ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05

組別對照組高糖組anti-miR-NC+高糖組anti-miR-92a-3p+高糖組F值P值miR-92a-3p 1.00±0.11 2.43±0.21*2.41±0.19 1.19±0.09#381.478＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.31±0.03 0.79±0.07*0.78±0.06 0.38±0.03#228.466＜0.001 Cleaved-caspase-12 0.32±0.03 0.73±0.07*0.71±0.06 0.34±0.03#177.670＜0.001細胞凋亡率（%）6.79±0.53 21.05±1.93*20.93±1.83 7.98±0.71#283.725＜0.001

2.3 miR-92a-3p靶向HOXA13，調(diào)控HOXA13的表達miR-92a-3p與HOXA13存在結(jié)合位點，見圖3A。miR-92a-3p過表達可抑制野生型載體HOXA13-3'UTR-WT的熒光素酶活性（P＜0.05），見表3。miR-92a-3p可負向調(diào)控HOXA13的表達，見表4。

圖3 miR-92a-3p靶向HOXA13，調(diào)控HOXA13的表達Fig.3 miR-92a-3p targets HOXA13 and regulates HOXA13 expression

表3 雙熒光素酶活性檢測Tab.3 Double luciferase activity test ±s

表3 雙熒光素酶活性檢測Tab.3 Double luciferase activity test ±s

組別miR-NC miR-92a-3p t值P值熒光素酶活性HOXA13-3'UTR-WT 1.00±0.10 0.39±0.03 17.528＜0.001 HOXA13-3'UTR-MUT 1.00±0.11 1.02±0.09 0.422 0.679

表4 Western Blot檢測HOXA13蛋白的表達Tab.4 Western Blot detection of HOXA13 protein expression ±s

表4 Western Blot檢測HOXA13蛋白的表達Tab.4 Western Blot detection of HOXA13 protein expression ±s

組別miR-NC miR-92a-3p anti-miR-NC anti-miR-92a-3p F值P值HOXA13 0.83±0.08 0.40±0.04*0.81±0.07 1.23±0.10#180.616＜0.001

2.4 HOXA13對高糖介導的腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡的影響與pcDNA+高糖組比較，pcDNA-HOXA13+高糖組細胞凋亡率和Cleavedcaspase-3、Cleaved-caspase-12蛋白水平降低（P＜0.05），見圖4、表5。

圖4 HOXA13對高糖介導的腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡和相關(guān)蛋白表達的影響Fig.4 Effect of HOXA13 on apoptosis and related protein expression of high glucose mediated glomerular mesangial cells SV40-MES-13

表5 HOXA13對高糖介導的腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡的影響Tab.5 Effect of HOXA13 on apoptosis of high glucose mediated glomerular mesangial cells SV40-MES-13±s

表5 HOXA13對高糖介導的腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡的影響Tab.5 Effect of HOXA13 on apoptosis of high glucose mediated glomerular mesangial cells SV40-MES-13±s

組別pcDNA+高糖組pcDNA-HOXA13+高糖組t值P值HOXA13 0.35±0.03 0.87±0.08 18.258＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.81±0.07 0.41±0.03 15.757＜0.001 Cleaved-caspase-12 0.75±0.07 0.34±0.03 16.151＜0.001細胞凋亡率（%）21.15±2.03 8.36±0.63 18.052＜0.001

2.5 si-HOXA13可以逆轉(zhuǎn)anti-miR-92a-3p對高糖介導腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡的影響與anti-miR-92a-3p+si-NC+高糖組比較，antimiR-92a-3p+si-HOXA13+高糖組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-12蛋白水平升高（P＜ 0.05），見圖5、表6。

圖5 si-HOXA13可以逆轉(zhuǎn)anti-miR-92a-3p對高糖介導腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡和相關(guān)蛋白表達的影響Fig.5 si-HOXA13 can reverse the effect of anti-miR-92a-3p on apoptosis and related protein expression of high glucose mediated glomerular mesangial cell SV40-MES-13

表6 si-HOXA13可以逆轉(zhuǎn)anti-miR-92a-3p對高糖介導腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響Tab.6 si-HOXA13 can reverse the effect of anti-miR-92a-3p on apoptosis and endoplasmic reticulum stress of high glucose mediated glomerular mesangial cells SV40-MES-13 ±s

表6 si-HOXA13可以逆轉(zhuǎn)anti-miR-92a-3p對高糖介導腎小球系膜細胞SV40-MES-13凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響Tab.6 si-HOXA13 can reverse the effect of anti-miR-92a-3p on apoptosis and endoplasmic reticulum stress of high glucose mediated glomerular mesangial cells SV40-MES-13 ±s

組別anti-miR-92a-3p+si-NC+高糖組anti-miR-92a-3p+si-HOXA13+高糖組t值P值HOXA13 0.79±0.07 0.34±0.03 17.726＜0.001 Cleaved-caspase-3 0.37±0.03 0.75±0.06 16.994＜0.001 Cleaved-caspase-12 0.33±0.03 0.73±0.07 15.757＜0.001細胞凋亡率（%）7.89±0.63 19.13±1.52 20.494＜0.001

3 討論

miRNA異常表達可參與糖尿病腎病發(fā)生及發(fā)展過程，并可調(diào)節(jié)腎小球系膜細胞增殖及凋亡。研究表明 miR-206[10]、miR-485[11]、miR-17-5p[12]等miRNA在糖尿病腎病中表達異常。本研究結(jié)果表明，在高糖誘導的腎小球系膜細胞中miR-92a-3p的表達量升高，下調(diào)miR-92a-3p表達可減少腎小球系膜細胞凋亡，并降低Cleaved-caspase-3、Cleavedcaspase-12蛋白水平；表明敲低miR-92a-3p可抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡。此外，miR-92a-3p可靶向負調(diào)控HOXA13表達，抑制HOXA13表達可減弱miR-92a-3p敲低對高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡的抑制作用，提示敲低miR-92a-3p可能通過靶向上調(diào)HOXA13表達來抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡，這有助于糖尿病腎病的干預治療。

最初發(fā)現(xiàn)miR-92a-3p在多種人類癌癥中高度表達，在癌癥進展中起著關(guān)鍵作用，如胃癌[13]、乳腺癌[14]和腎癌[15]。近年來研究顯示，除癌癥外，miR-92a-3p在急性肺損傷中表達上調(diào)，抑制其表達可減輕急性肺損傷[16]；在腦微血管內(nèi)皮細胞損傷[17]、多柔比星誘導的心肌細胞損傷[18]中miR-92a-3p表達水平也升高，并可促進細胞凋亡。然而，miR-92a-3p在糖尿病腎病中的功能和分子機制尚不清楚。WIESE等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-92a-3p在腎損傷中呈高表達，抑制miR-92a-3p對腎組織損傷具有保護作用。在本研究中，在高糖誘導的腎小球系膜細胞中 miR-92a-3p水平升高，這與WIESE等[7]研究一致，提示miR-92a-3p可能參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。為了驗證此推測，本研究采用高糖誘導建立腎小球系膜細胞損傷模型，并利用antimiR-92a-3p轉(zhuǎn)染以敲低miR-92a-3p表達，結(jié)果顯示，高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡能力升高，與既往研究[19]報道結(jié)果相似，敲低miR-92a-3p可減少高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡，并降低Cleavedcaspase-3、Cleaved-caspase-12蛋白表達，提示敲低miR-92a-3p可抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡。

miRNA通過與mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）互補序列的堿基配對，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達[20-21]。HOXA13廣泛分布于組織器官中，其表達水平異常與腫瘤[22-23]、腎損傷等[8]疾病密切相關(guān)。研究表明HOXA13在缺血誘導的神經(jīng)元中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制神經(jīng)元凋亡[24]。HOXA13在慢性心力衰竭患者中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制人心肌細胞凋亡及促進細胞增殖[25]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導的腎小球系膜細胞中HOXA13表達水平降低，HOXA13過表達可抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡。生物信息學預測顯示，miR-92a-3p與HOXA13的3'UTR存在結(jié)合位點，提示HOXA13可能是miR-92a-3p的潛在靶基因。雙熒光素酶實驗證實miR-92a-3p與HOXA13之間存在靶向調(diào)控關(guān)系；Western blot結(jié)果進一步證實miR-92a-3p過表達可降低HOXA13蛋白水平，而miR-92a-3p敲低表現(xiàn)出相反作用，表明miR-92a-3p靶向負調(diào)控HOXA13表達。為了進一步驗證miR-92a-3p在高糖誘導的腎小球系膜細胞損傷中的作用機制，本研究在敲低miR-92a-3p的基礎(chǔ)上，采用小分子干擾技術(shù)下調(diào)HOXA13表達，結(jié)果顯示抑制HOXA13表達可明顯減弱miR-92a-3p敲低對高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡的抑制作用；提示敲低miR-92a-3p可能通過靶向上調(diào)HOXA13表達來抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡。

綜上所述，高糖誘導的腎小球系膜細胞中miR-92a-3p表達上調(diào)，HOXA13表達下調(diào)，敲低miR-92a-3p可通過靶向上調(diào)HOXA13表達抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡進而減輕細胞損傷。但由于miRNA可以靶向多個mRNA，其是否可通過調(diào)控其他靶基因參與高糖誘導的腎小球系膜細胞損傷仍需進一步探究。在未來的研究中將結(jié)合體內(nèi)動物實驗對miR-92a-3p的作用機制進行深入分析。