馬芳芳，康碧靜，馬春英，劉振斌，王明明，喬自林,5，張家友，喬永平，王家敏,5

(1.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心 甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心,甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；4.武漢生物制品研究所有限責任公司 國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430207；5.蘭州民海生物工程有限公司 甘肅省生物工程材料工程研究中心，甘肅 蘭州 730030；6.蘭州百靈塑料制品有限公司，甘肅 蘭州 730030)

細胞工廠(Cell Factory)是繼轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)貼壁細胞的一種新興靜置細胞培養(yǎng)裝置，因其進液管道和氣體管道巧妙結(jié)合而有效減少細胞與外界的接觸，能在有限的空間內(nèi)充分利用表面進行培養(yǎng)[1-2].利用符合《美國藥典》規(guī)定的聚苯乙烯[3]制成1 層、2 層、10層和40 層不同規(guī)格的細胞工廠，使疫苗生產(chǎn)規(guī)模變得簡單，并且獨特的設(shè)計可以有效保證無菌操作.聚苯乙烯具有良好的加工性能，其制品表面整潔透明，且價格便宜，被廣泛應用于生物醫(yī)藥生產(chǎn)并得到迅速發(fā)展.運用現(xiàn)代細胞工廠自動化設(shè)備可以實現(xiàn)細胞培養(yǎng)的自動化，降低勞動強度，實現(xiàn)大規(guī)模細胞培養(yǎng).

近年來細胞工廠在國內(nèi)開始應用，許多生物制品公司也采用細胞工廠進行細胞培養(yǎng).利用細胞工廠培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細胞制備及生產(chǎn)疫苗，成為貼壁細胞培養(yǎng)的首選技術(shù)，例如用細胞工廠培養(yǎng)原代地鼠腎細胞制備凍干人用狂犬病疫苗[4]；用細胞工廠培養(yǎng)MRC-5 細胞制備的水痘疫苗原液病毒滴度略高，且均一性更好[5].利用細胞工廠培養(yǎng)原代地鼠腎細胞制備森林腦炎滅活疫苗，獲得了較高的細胞密度并收獲了高毒力的病毒液，原液中抗原含量、蛋白質(zhì)含量、地鼠腎細胞蛋白質(zhì)殘留量、牛血清白蛋白殘余量均符合《中國藥典》三部(2015 版)規(guī)定，可替代轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝大規(guī)模制備森林腦炎滅活疫苗[6].用細胞工廠制備麻腮風系列疫苗[7].高英[8]試驗研究結(jié)果表明，利用細胞工廠培養(yǎng)的H9亞型具有較高的免疫原性，適合大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感疫苗.細胞工廠技術(shù)因其安全方便、操作簡單、占用空間少、可控性好等優(yōu)勢，已被越來越多的國內(nèi)企業(yè)接受.因此，細胞工廠的應用將越來越廣泛，并迅速成為新一代的細胞培養(yǎng)技術(shù).從我國的發(fā)展和應用角度來看，細胞工廠培養(yǎng)技術(shù)將會推動疫苗生產(chǎn)企業(yè)的快速發(fā)展.本文采用不同廠家細胞工廠培養(yǎng)Vero細胞，在相同培養(yǎng)條件下， 比較Vero細胞培養(yǎng)在Corning、Thermo和蘭州百靈生產(chǎn)的細胞工廠中的增殖效果，為今后進一步規(guī)?；a(chǎn)提供參考.

1 材料

1.1 細胞與病毒

Vero貼壁細胞由甘肅省動物細胞工程技術(shù)創(chuàng)新中心提供，本次試驗細胞代次為P138-143；甲型H5N1流感病毒由武漢生物制品研究所有限責任公司提供.

1.2 主要試劑及儀器

M199(Gibco干粉，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司配制)；DMEM(Gibco干粉，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司配制)；MEM(Gibco干粉，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司配制)；新生牛血清(蘭州民海生物，特級新生牛血清)；0.25%胰酶溶液(Gibco，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司配制)；0.2%臺盼藍(Sigma)；結(jié)晶紫染液；T75、T225細胞培養(yǎng)瓶(Corning)；細胞工廠(Corning、Thermo、蘭州百靈生物技術(shù)有限公司)；生物微倒置顯微鏡(Olympus，CKX-41)；CO2培養(yǎng)箱(ThermoFisher，3111型)；細胞計數(shù)儀(美國Countstar，IC1000)；細胞工廠觀察裝置(北京恒一，XBG-III)等.

2 方法

2.1 貼壁培養(yǎng)及細胞工廠傳代觀察

采用常規(guī)方法復蘇一支Vero細胞至T75細胞瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含5%NBS的M199，觀察細胞貼壁情況并記錄結(jié)果.待細胞長至單層致密時，棄去培養(yǎng)液，加入適量PBS溶液清洗2遍，之后加入適量0.25%胰酶，室溫作用片刻后棄掉胰酶消化液，室溫放置1～2 min，在顯微鏡下觀察細胞變圓后輕拍瓶底解離細胞.加入適量5%NBS 的M199培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液移至T225細胞瓶內(nèi)培養(yǎng).當Vero細胞匯合率達95%左右時，按上述方法均以9×104cells/cm2的細胞密度接種至三個不同來源的1層細胞工廠，補加培養(yǎng)基至200 mL/層，37 ℃、5%CO2培養(yǎng).觀察三個不同來源細胞工廠中細胞生長狀態(tài)、致密程度并拍照，統(tǒng)計結(jié)果.

待細胞工廠中細胞單層鋪滿后按上述方法傳代，分別補加培養(yǎng)基M199(5%NBS)、MEM(5%NBS)、DMEM(5%NBS)至200 mL/層，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，每24 h顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)并拍照.觀察不同培養(yǎng)基對三個不同來源細胞工廠中Vero細胞生長形態(tài)、長勢及致密程度的影響.

2.2 生長曲線

每隔24 h各取3個不同來源細胞工廠，按常規(guī)方法消化后分別取1 mL細胞懸液至EP管中計數(shù)細胞量，統(tǒng)計分析結(jié)果.

2.3 貼壁率分析

將三個不同來源細胞工廠培養(yǎng)的Vero細胞，按5 cells/cm2接種至對應細胞工廠各3個，分別補加培養(yǎng)基M199(5%NBS)200 mL/層，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)15 d，呈結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計克隆數(shù)，計算貼壁克隆率.

2.4 甲型H5N1流感病毒在Vero細胞上的增殖

以MOI=0.0001接種甲型H5N1流感病毒三個不同細胞工廠培養(yǎng)的Vero 細胞中增殖[9]，觀察細胞病變現(xiàn)象，檢測血凝效價和CCID50.

2.5 數(shù)據(jù)分析

用Graphpad prism 8軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

3 結(jié)果

3.1 Vero細胞貼壁培養(yǎng)及細胞工廠傳代觀察

Vero細胞在方瓶中復蘇培養(yǎng)6 h后，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)為三角形及不規(guī)則的上皮樣細胞狀，生長致密，細胞增殖較快，復蘇后細胞狀態(tài)良好，如圖1.

圖1 復蘇6 h Vero細胞狀態(tài)(40×)

觀察三個不同來源的細胞工廠培養(yǎng)過程中細胞生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)三個來源的細胞工廠培養(yǎng)Vero細胞形態(tài)較為規(guī)則，呈三角形及不規(guī)則的多角形，中央有扁圓形細胞核，細胞之間相互銜接或呈鑲嵌狀緊密排列，為典型的上皮樣貼壁培養(yǎng)型細胞系，細胞增殖較快，生長旺盛.經(jīng)觀察分析，在三個不同來源的細胞工廠中第一代Vero細胞均能夠良好生長，生長狀態(tài)、長勢、致密程度無明顯差別，匯總結(jié)果如下表1.

表1 細胞工廠培養(yǎng)Vero細胞增殖效果比較

分別用三種不同培養(yǎng)基在三個不同廠家的細胞工廠中培養(yǎng)Vero細胞，Vero細胞均能很好地增殖，見表2.在24 h時，Corning和百靈細胞工廠中Vero細胞狀態(tài)良好，單層基本鋪滿.各組培養(yǎng)基之間細胞形態(tài)無明顯差別，但Thermo細胞工廠中Vero細胞狀態(tài)一般，生長速度較慢，細胞匯合率達90%，細胞之間間隙清晰可見.48 h時，不同培養(yǎng)條件下，百靈細胞工廠中不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下Vero細胞生長速度較Corning和Thermo細胞工廠快，單層致密生長.而Corning和Thermo細胞工廠中不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下Vero細胞剛好單層鋪滿生長.

3.2 Vero細胞生長曲線

每隔24 h分別對三個不同細胞工廠培養(yǎng)的細胞進行消化計數(shù)，結(jié)果顯示(如圖2)：在細胞接種0～24 h之后，三種細胞工廠的細胞進入對數(shù)生長期，在120 h時Corning細胞工廠細胞進入平臺期，經(jīng)24 h后細胞濃度開始下降；百靈和Thermo細胞工廠在144 h時，細胞密度均達到峰值且遠高于Corning細胞工廠的細胞密度，倍增時間也小于Corning細胞工廠(見表3).從pH變化角度來看：①由于細胞培養(yǎng)液中有毒物質(zhì)的積累，細胞之間的條件抑制細胞密度開始下降，百靈細胞工廠細胞的生長曲線下降相對較慢.②影響細胞中酶的活性.酶是由活細胞產(chǎn)生的，對其底物具有高度特異性和高度催化功能的生物大分子.細胞的一些生理功能,如生長、分泌細胞因子等都需要合適的 pH 值以適應一系列酶的活性,從而影響培養(yǎng)基中酶的活性及某些因子的作用，進而影響細胞生長.③不同細胞材質(zhì)也可能對培養(yǎng)液pH的變化產(chǎn)生影響.

表2 不同培養(yǎng)基對比細胞工廠培養(yǎng)支持Vero細胞增殖效果

圖2 細胞工廠培養(yǎng)Vero細胞增殖生長曲線

表3 不同細胞工廠培養(yǎng)Vero細胞倍增時間測定結(jié)果

3.3 貼壁率

低密度接種培養(yǎng)后第三天鏡下可見有貼壁的細胞分裂成多個，形態(tài)不規(guī)則且細胞之間間隙較大.經(jīng)過六天已經(jīng)成小簇，簇的外觀呈不規(guī)則，兩周基本形成了致密的肉眼可見的大小相一的細胞集落.三種不同來源一層細胞工廠培養(yǎng)Vero細胞，均形成了有效的細胞集落數(shù)，平均克隆率為(86.20±0.62)%、(94.50±0.70)%、(89.53±0.60)%，Thermo細胞工廠顯著高于Corning和百靈細胞工廠，差異極顯著(P=0.000 4、P=0.002 7)，Corning細胞工廠低于百靈細胞工廠，差異顯著(P=0.011 7)，貼壁率結(jié)果見圖3.

圖3 細胞工廠培養(yǎng)Vero細胞貼壁率比較(P<0.05)

3.4 流感病毒在細胞工廠中的增殖比較

在三個不同來源的細胞工廠中培養(yǎng)Vero細胞至單層鋪滿，以相同接毒量感染流感病毒，加入胰酶濃度為1 μg·mL-1，34.2 ℃孵育，于不同時間取樣測血凝效價，結(jié)果顯示，在48 h時細胞病變明顯(如圖4)，血凝滴度和感染性滴度也最高(見表4).

A 細胞對照(未接種H5N1) B 空格實驗組(接種H5N1 48 h)

表4 H5N1在不同來源細胞工廠培養(yǎng)Vero細胞的增殖情況

4 討論

目前，細胞工廠培養(yǎng)技術(shù)在國外已有三十多年的應用歷史，國外細胞工廠已成熟用于疫苗、單克隆抗體和生物制藥等規(guī)?；a(chǎn).國外葛蘭素史克生物制品公司和美國默克公司均采用細胞工廠生產(chǎn)甲型肝炎滅活疫苗[10]，其利用細胞工廠進行細胞培養(yǎng)和病毒擴增的技術(shù)已經(jīng)非常成熟.我國最早采用細胞工廠進行疫苗生產(chǎn)的企業(yè)是北京科興生物制品有限公司，現(xiàn)已生產(chǎn)甲型肝炎滅活疫苗[11-12].細胞工廠的設(shè)計與組裝除了需要考慮細胞生長情況外，還要考慮細胞工廠的可塑性.它的性能決定著生物合成產(chǎn)品的生產(chǎn)強度、效價和轉(zhuǎn)化率等，這些指標又直接影響著產(chǎn)品的質(zhì)量和成本，同樣值得關(guān)注[13].隨著研究不斷深入發(fā)展，國產(chǎn)細胞工廠逐漸興起，因此，在短時間內(nèi)成功篩選出細胞培養(yǎng)最佳的細胞工廠，能夠為擴大疫苗生產(chǎn)提供一定的科學依據(jù).

本實驗通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Vero在三種不同細胞工廠中的生長狀態(tài).在不同細胞工廠不同培養(yǎng)條件下細胞的生長狀態(tài)相似，形態(tài)規(guī)則，均能貼壁生長成致密單層，生長良好.觀察三種不同來源細胞工廠培養(yǎng)細胞生長曲線后得出，在Thermo細胞工廠中Vero細胞生長速度一般，但是細胞數(shù)量峰值最大，而在百靈細胞工廠中Vero細胞生長迅速，細胞數(shù)量峰值也大；Corning細胞工廠中Vero細胞生長最慢，且細胞數(shù)量峰值最低.貼壁依賴性細胞只有貼附于固體介質(zhì)表面才能夠良好生長繁殖，因此確保細胞貼附于細胞工廠表面是貼壁細胞生長的關(guān)鍵，而細胞低密度培養(yǎng)，細胞會生長成分散的集落，有助于觀察貼壁附著生長的情況.通過對細胞貼壁率(細胞貼壁率又稱接種存活率)的測定，進一步對Vero細胞在三個不同細胞工廠中的貼壁能力進行檢測.適用于觀察貼壁附著生長的細胞，是分析細胞增殖和存活的良好指標，因為只有活性相對較好的細胞才能貼壁生長，從而反映出細胞和培養(yǎng)底物材料的生物相容性.比較Vero細胞在不同細胞工廠中貼壁率結(jié)果：在Thermo細胞工廠中貼壁率最高，在百靈細胞工廠貼壁率次之，而Corning細胞工廠中貼壁率最低，說明百靈細胞工廠具有較好的細胞貼附能力，三個不同來源的細胞工廠均可實現(xiàn)較好的Vero細胞生長.為檢測不同細胞工廠培養(yǎng)Vero細胞的病毒增殖情況，將甲型流感病毒H5N1以MOI=0.0001接種至不同細胞培養(yǎng)的Vero細胞，結(jié)果顯示，接毒后48 h即可在顯微鏡下觀察到明顯細胞病變，從血凝滴度及感染性滴度結(jié)果也發(fā)現(xiàn)三種不同細胞工廠間無顯著差異.

綜上所述，國產(chǎn)百靈細胞工廠具有較好的細胞貼附能力，能較好地支持細胞生長，細胞工廠傳代穩(wěn)定.從培養(yǎng)細胞總量來看，優(yōu)于Corning 和Thermo細胞工廠，但操作使用方面仍存在不足.百靈細胞工廠每層連接處開口太小無法直接倒液，加液時易產(chǎn)生氣泡，出現(xiàn)溢液現(xiàn)象.對不同細胞工廠培養(yǎng)Vero細胞效果進行研究，旨在為生物制品生產(chǎn)中細胞擴大培養(yǎng)和短時間內(nèi)成功篩選出培養(yǎng)細胞的最佳培養(yǎng)方式提供一定的參考依據(jù)，同時也為國內(nèi)細胞工廠研制過程中原材的選擇、多層細胞工廠開口連接及進出液口的設(shè)計提供實驗依據(jù).