薛濤，張成龍，李昀達(dá)，趙越超，林琳，常芷健，岳勇銘，王蘇桐，李劍男*

（1. 神威藥業(yè)（四川）有限公司生產(chǎn)車間，四川 邛崍 611530；2. 長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117）

女貞子又稱女貞實(shí)，是女貞的成熟、干燥果實(shí)[1]，是一種補(bǔ)腎養(yǎng)肝養(yǎng)目的中藥，出現(xiàn)內(nèi)熱外渴、腰膝無力、耳鳴、肝腎陽虛、眩暈、胡須干白等癥狀的人群可以根據(jù)醫(yī)囑使用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有增強(qiáng)血管強(qiáng)度、抗肝損傷、降血脂、降血糖的作用，可增強(qiáng)機(jī)體對于外來細(xì)菌或致病物質(zhì)的抵抗能力，提高人體免疫力[1～3]。

花青素，別名花色素，基本骨架為C6-C3-C6，是由糖苷配基和糖組成的類黃銅酚類化合物，是2-苯基苯并吡喃烊離子或黃烊鹽的多羥基和甲氧的衍生物。女貞子中花青素含量較高，其藥材可獲得性較好、提取便捷。花青素的開發(fā)不僅可以為食品工業(yè)提供安全、高質(zhì)量的天然色素，在醫(yī)藥領(lǐng)域，花青素亦可取代合成色素以著色劑形式加入到藥物制劑中以生產(chǎn)出彩色片劑、口服液等[4]，因此研究女貞子中花青素的提取工藝具有市場價(jià)值。

目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中對女貞子中花青素提取方法報(bào)道包括加壓溶劑萃取、超聲波輔助提取法、有機(jī)溶劑提取、煎煮法、生物發(fā)酵提取、超臨界提取法等，其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)不一而足，如加壓溶劑萃取可以提高沸點(diǎn)從而提高萃取效率，但加壓條件需要配合專門的設(shè)備，同時(shí)也具有一定危險(xiǎn)性；生物發(fā)酵法反應(yīng)條件溫和，有效成分保留較好，但操作過程比較復(fù)雜；煎煮法是最常用的提取方法，但花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)為熱敏性結(jié)構(gòu)，煎煮法溫度高，易造成有效成分的分解。

溫浸法也是中藥材傳統(tǒng)提取工藝之一，該方法對設(shè)備沒有特殊要求，提取條件溫和，有利于保持有效成分的穩(wěn)定性，操作簡單，對操作工人的要求較低，但在近五年的文獻(xiàn)資料中并未檢索到以溫浸法提取花青素的研究報(bào)道；因此本研究采用溫浸法提取女貞子中花青素，花青素含量以矢車菊素-3-0-葡萄糖苷計(jì)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化女貞子中花青素的提取工藝[5]，為女貞子中花青素的工業(yè)化提取提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥

1.1 儀器

UV-935 型紫外可見分光光度計(jì)（大連依利特儀器公司）；RE371D 型電熱數(shù)碼恒溫水浴鍋（金壇市電熱儀器廠）；ME204E 型梅特勒電子天平 （梅特勒-托利多集團(tuán)）；P-500B-2D 粉碎機(jī)（永康久品工貿(mào)有限公司）；SHZ-III 臺(tái)式循環(huán)水真空泵（鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司）；LXJ-IIB 型離心機(jī)（上海安寧科學(xué)儀器廠）；DHG9101-A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津盛欣有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

女貞子于2021 年1 月購買于吉林省通化市。經(jīng)生藥學(xué)鑒定該藥品為木犀科（Oleaceae）女貞屬（Ligustrum Linn）女貞子（Ligustrum Lucidum）；標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素-3-0-葡萄糖苷，購于山東制劑有限公司；無水乙醇、氯化鈉等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 花青素分析方法的建立

2.1.1 對照品溶液的配制

將矢車菊-3-0-葡萄糖苷干燥至恒重[6]，稱取2.5 mg 置于10 mL 量瓶中，用濃度為60%、pH 值為2.0 的酸性乙醇溶液溶解后定容，得到濃度為0.25 mg/ mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液[6～10]。

2.1.2 供試品溶液的制備

取女貞子提取液， 濃縮后離心15 min（4 500 r/ min），將上清液移入100 mL 量瓶中，用pH值為2.0 的酸性乙醇溶液定容至刻度線[6～10]。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取已經(jīng)配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL， 分 別 置 于5 mL 量 瓶中，用pH 值為5.0 的無水乙酸鈉緩沖溶液定容至刻度線[6～10]。以第一瓶溶液為空白對照，用紫外-可見分光光度計(jì)在最大吸收波長500 nm 處分別測量其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)（X），以吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y= 19.793X-0.091 3，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 5，結(jié)果表明溶液濃度與吸光度在0.025 ～ 0.08 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 方法學(xué)考察

圖1 矢車菊-3-0-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Bluebonnet-3-0-glucoside standard curve

（1）精密度考察 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，共6 份，分別置于10 mL 量瓶中，用濃度為60%、pH值為2.0 的酸性乙醇溶液定容至刻度線，在紫外分光光計(jì)中于波長500 nm 測定其吸光度[6～10]。結(jié)果表明，花青素含量的RSD 值為0.70%，小于3%，證明儀器的精密度較好。

（2）重現(xiàn)性考察 取6 份2 mL 的供試品溶液，用60%的pH 值為2.0 酸性乙醇溶液于100 mL 量瓶中定容至刻度線，再將其分別放在紫外分光光計(jì)中依次在波長500 nm 處測定其吸光度[6～10]。結(jié)果表明，重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)RSD 值為2.02%，小于3%，證明該分析方法的重現(xiàn)性良好。

（3）穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，分別于0、3、6、9、12 h 在波長500 nm 處測定吸光度[6～10]，結(jié)果各樣品檢測值的RSD值為1.04%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

（4）回收率考察 取2 mL 供試品溶液共6 份，分別加入0.25 mg/mL 矢車菊-3-0-葡萄糖苷1 mL、2 mL、3 mL 在波長500 nm 處測定吸光度，計(jì)算回收率[6～10]。結(jié)果表明，加樣回收率平均值為98.16%，RSD%=0.473%，這就表明加樣回收結(jié)果較好。

回收率=（測得量-樣品量）÷ 加入量

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of sample addition recovery rate

綜合以上方法學(xué)考察結(jié)果得知，試驗(yàn)方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率均良好，證明該試驗(yàn)方法可行，可用于女貞子中花青素的含量測定。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對提取率的影響

將女貞子過50 目篩，取篩下樣品100 g，共5 份，分別置于裝有攪拌槳的圓底燒瓶中；將恒溫水浴鍋調(diào)至30 ℃，料液比1∶10（g/mL），分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%的pH 值為2.0 酸性乙醇溶液，攪拌槳調(diào)至第一檔（下同），浸提60 min；將提取液按“供試品溶液的制備”中的方法制備成供試品溶液，測定吸光度，計(jì)算提取率[11-13]。結(jié)果顯示：當(dāng)乙醇濃度分別為40%、50%和60%時(shí)花青素的提取率較高。乙醇濃度為70%時(shí)提取效果與40%接近，但用高濃度乙醇提取，生產(chǎn)成本更高，因此乙醇濃度三個(gè)水平選40%、50%、60%進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖2 乙醇濃度對花青素提取率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of anthocyanin

2.2.2 料液比對提取率的影響

將女貞子過50 目篩，取篩下樣品100 g，共5 份，分別置于裝有攪拌槳圓底燒瓶中，根據(jù)不同的料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）各加入濃度為60%的pH 值為2.0 酸性乙醇溶液，浸提60 min，將提取液按“供試品溶液的制備”中的方法制備成供試品溶液，測定吸光度，計(jì)算提取率[11-13]。結(jié)果顯示：當(dāng)料液比達(dá)到1∶15（g/mL）時(shí)提取率較高，溶劑體積繼續(xù)增加后花青素含量僅有較小的提高，但溶劑體積大意味著需要更多的時(shí)間進(jìn)行干燥，會(huì)增加生產(chǎn)成本，因此，選取1∶10、1∶15、1∶20（g/ mL）三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 料液比對花青素提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanin

2.2.3 粒徑大小對提取率的影響

將女貞子粉碎，用藥篩分別將女貞子過10 目篩、24 目篩、50 目篩、65 目篩、80 目篩，各取篩下物100 g，加入60%的pH 值為2.0 酸性乙醇溶液，浸提60 min，將提取液按“供試品溶液的制備”中的方法制備成供試品溶液，測定吸光度，計(jì)算提取率[11-13]。結(jié)果顯示：當(dāng)女貞子的粒徑依次減小時(shí)，提取率增加，達(dá)到50 目以下時(shí)，粒徑繼續(xù)減小對試驗(yàn)結(jié)果影響不大，且粒徑越小粉碎難度越大，成本越高，因此決定將藥材粒徑控制在完全可以通過50 目篩即可，不作為正交試驗(yàn)的考察因素。

圖4 粉碎程度對花青素提取率的影響Fig.4 The effect of pulverization degree on the extraction rate of anthocyanin

2.2.4 提取溫度對提取率的影響

稱取五份過50 目篩的女貞子粉樣品，每份100 g，放在5 個(gè)圓底燒瓶中，將恒溫水浴鍋依次調(diào)至25、30、35、40、45 ℃，按料液比1∶20（g/ mL），加入濃度為60%的pH 值為2.0 酸性乙醇溶液，浸提60 min，將提取液按“供試品溶液的制備”中的方法制備成供試品溶液，測定吸光度，計(jì)算提取率[11-13]。結(jié)果表明：隨著溫度的升高，提取率先升高后降低，提取率較高時(shí)的溫度分別為30 ℃、35 ℃、40 ℃。造成這種波動(dòng)的原因可能是花青素本身的不穩(wěn)定性，低溫條件下花青素提取不完全，高溫會(huì)導(dǎo)致花青素降解，有效成分被破壞。綜合花青素的性質(zhì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，較優(yōu)提取溫度三個(gè)水平為30 ℃、35 ℃、40 ℃。

2.2.5 提取時(shí)間對提取率的影響

稱取五份過50 目篩的女貞子粉樣品，每份100 g，放在5 個(gè)圓底燒瓶中，按料液比1∶20（g/ mL）加入60%的pH 值為2.0 酸性乙醇溶液，水浴至40 ℃，依次浸提40、60、80、100、120 min；將提取液按“供試品溶液的制備”中的方法制備成供試品溶液，測定吸光度[11-13]。結(jié)果表明：隨著時(shí)間的增加，女貞子中花青素的提取率呈先升高后下降的趨勢，這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長花青素不斷溶出，到最后接近飽和，然而，時(shí)間繼續(xù)延長，導(dǎo)致花青素受熱時(shí)間過長而使花青素分解，降低提取率[12]，同時(shí)提取時(shí)間過長會(huì)增加成本，因此選取60、80、100 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 提取溫度對花青素提取率的影響Fig.5 The effect of extraction temperature on the extraction rate of anthocyanins

圖6 提取時(shí)間對花青素提取率的影響Fig.6 The effect of extraction time on the extraction rate of anthocyanins

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素結(jié)果，選取料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行L9（3）4正交試驗(yàn)，并對結(jié)果進(jìn)行分析，選出最佳工藝條件。

以上結(jié)果表明：以花青素提取率為考察指標(biāo)，通過直觀分析可知（R值大小對比），影響提取率因素大小順序依次為：B ＞A ＞C ＞D，即料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時(shí)間，見表3；通過方差分析，料液比和乙醇濃度對提取率的影響具有顯著性差別，見表4；結(jié)合KA3 ＞KA2 ＞KA1、KB3 ＞KB2 ＞KB1、KC3 ＞KC2 ＞KC1、KD2 ＞KD3 ＞KD1 的結(jié)果，確定最佳工藝為：A3B3C3D2，即料液比為1∶20（g/mL）、乙醇濃度為60%、提取溫度為40 ℃、提取時(shí)間為80 min。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Orthogonal test results

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Analysis of variance results

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)所得的結(jié)果，取女貞子藥材進(jìn)行粉碎，取三份，每份1.0 kg，備用；在生產(chǎn)用帶攪拌槳的反應(yīng)罐中加入20 L 濃度為60%、pH 值為2.0 的乙醇溶液，加熱至40 ℃后，加入粉碎好的女貞子藥材，開啟機(jī)器攪拌，浸提80 min，濾過；重復(fù)上述操作3 次，依法制備供試品溶液，測定吸光度，計(jì)算提取率。經(jīng)測定，提取物中花青素的平均含量為2.972 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.701%，證明該工藝條件穩(wěn)定。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.2 Orthogonal test factor level table

3 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)最開始時(shí)并沒有使用到攪拌槳，結(jié)果提取過程中有效成分溶出后出現(xiàn)濃度差，可明顯看出藥材周圍有有色物質(zhì)溶出但外圍溶劑幾乎無色，從而造成有效成分提取不完全。因此后期實(shí)驗(yàn)中引入攪拌槳輔助提取，縮短提取時(shí)間，提高提取率。

乙醇濃度、提取時(shí)間、藥材粒度等在一定范圍內(nèi)合理變動(dòng)有助于提高提取率；實(shí)驗(yàn)過程中也曾對提取次數(shù)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同提取時(shí)間，料液比1∶10 的條件下提取兩次與1∶20 條件下提取一次的提取率差不多，而在1∶20 料液比條件下提取兩次，第二次提取出來的花青素含量不足第一次的五分之一，且有大量其他物質(zhì)被溶出，從提取效率、操作周期、人工和水電等方面考慮，放棄提取兩次的操作方法，通過條件優(yōu)化在提取一次的情況下可將更多花青素提取出來。

浸漬法操作簡單，成本低廉，同時(shí)安全性高，能夠節(jié)約能源；通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)以及驗(yàn)證試驗(yàn)確定女貞子中花青素最佳提取工藝為：料液比為1∶20 g/mL、乙醇濃度60%、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間80 min，提取率為2.972 mg/g。