潘曉君 呂渭升 楊文惠 羅宇琴 梁月儀 魏梅 孫冬梅 陳向東 霍文杰 李振雨

中圖分類號 R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）02-0185-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.02.10

摘 要 目的 建立蛇床子藥材的指紋圖譜及其中4種香豆素類成分的含量測定方法。方法 采用超高效液相色譜法，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》建立21批蛇床子藥材的指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評價，與對照品比對指認(rèn)共有峰。以10個共有峰峰面積為變量，采用組間連接法對21批蛇床子藥材進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。采用相同超高效液相色譜法，以蛇床子素為內(nèi)參物，計算花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素的相對校正因子，采用一測多評法計算其含量，并與外標(biāo)法測定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 21批蛇床子藥材的指紋圖譜中共標(biāo)識出10個共有峰，相似度為0.997～1.000;指認(rèn)出峰4為花椒毒素，峰8為佛手柑內(nèi)酯，峰9為歐前胡素，峰10為蛇床子素。21批樣品被劃分為3類，其中S7為一類，S14為一類，其余19批為一類。一測多評法與外標(biāo)法測定的花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素含量的相對偏差分別為0.88%～1.07%、2.22%～2.29%、0.67%～2.93%。結(jié)論 成功建立了蛇床子藥材的超高效液相色譜指紋圖譜及4種香豆素類成分含量測定的一測多評法。

關(guān)鍵詞 蛇床子;超高效液相色譜法;指紋圖譜;香豆素類成分;一測多評法

Establishment of the fingerprint of Cnidium monnieri and a method for the content determination of 4 kinds of coumarins

PAN Xiaojun，LYU Weisheng，YANG Wenhui，LUO Yuqin，LIANG Yueyi，WEI Mei，SUN Dongmei， ? ? ? ?CHEN Xiangdong，HUO Wenjie，LI Zhenyu（Guangdong Provincial Enterprise Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula Granule， Guangdong Foshan 528244， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To establish the fingerprint of Cnidium monnieri and a method for the content determination of 4 kinds of coumarins. METHODS Ultra-high performance liquid chromatography（UPLC） method was adopted to establish the fingerprints of 21 batches of C. monnieri; their similarities were evaluated with Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition）; common peaks were identification by comparison with reference substance. Using 10 common peak areas as variables， cluster analysis was performed for 21 batches of C. monnieri by the method of between groups. The relative correction factors of xanthotoxin， bergapten and imperatorin were calculated by the same UPLC method with osthole as the internal reference. The contents of them were calculated by quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS）， and compared with the results of external standard method. RESULTS Totally 10 common peaks were identified in the fingerprints of 21 batches of C. monnieri; the similarities ranged from 0.997 to 1.000. Peak 4 was identified as xanthotoxin， peak 8 as bergapten， peak 9 as imperatorin and peak 10 as osthole. A total of 21 batches of samples were divided into 3 categories， of which S7 was clustered into one category， S14 was clustered into one category， and the other 19 batches were clustered into one category. The relative deviations of the contents of xanthotoxin， bergapten and imperatorin determined by QAMS and external standard method were in the range of 0.88%-1.07%， 2.22%-2.29%， 0.67%-2.93%， respectively. CONCLUSIONS UPLC fingerprint of C. monnieri is successfully established， and QAMS method for content determination of 4 coumarins is also established.

KEYWORDS ? Cnidium monnieri; ultra-high performance liquid chromatography; fingerprint; coumarins; quantitative analysis of multi-components by single marker

蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實[1]，又名蛇粟、蛇米、蛇珠等，主要分布于我國江蘇、山東、浙江、陜西等地[2]。蛇床子的主要活性成分為香豆素類，以簡單型香豆素（如蛇床子素）和呋喃型香豆素（如佛手苷內(nèi)酯、花椒毒素、歐前胡素）為主[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地蛇床子所含香豆素的種類相差不大，但不同類型香豆素的含量差異明顯，這種差異與不同產(chǎn)地溫度、降雨量和日照時長的相關(guān)性較高[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，香豆素類成分是蛇床子的主要活性成分，可有利于心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等疾病以及骨質(zhì)疏松的治療[5-8]。2020年版《中國藥典》（一部）以蛇床子素為單一含量測定指標(biāo)，難以全面地反映蛇床子藥材的內(nèi)在質(zhì)量;而多指標(biāo)檢測則常因?qū)φ掌钒嘿F或不易獲得，導(dǎo)致檢測成本較高。一測多評法可采用同一對照品實現(xiàn)對多種成分的同時測定，實用性和經(jīng)濟(jì)性較強(qiáng)?；诖?，本文以超高效液相色譜法為手段，建立21批蛇床子藥材的指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評價和系統(tǒng)聚類分析，結(jié)合一測多評法，以常見、易得的蛇床子素為內(nèi)參物，同時測定蛇床子藥材中佛手柑內(nèi)酯、花椒毒素、歐前胡素的含量，旨在為提高蛇床子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司），Vanquish型超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），1290型超高效液相色譜儀（美國Agilent公司），ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平[梅特勒-托利多（中國）有限公司]，HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

花椒毒素對照品（批號17111503，純度98%）、佛手柑內(nèi)酯對照品（批號17120501，純度98%）均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;歐前胡素對照品（批號110826-201616，純度99.6%）、蛇床子素對照品（批號110822-201710，純度99.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院;實驗用乙醇（分析純）、甲醇（分析純）均購自西隴科技股份有限公司;液相用甲醇為色譜級，水為超純水。

21批蛇床子藥材分別采集自我國江蘇、山東、河南、湖北、黑龍江等地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，均為傘形科植物蛇床C. monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實，其產(chǎn)地信息詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用H-Class型超高效液相色譜儀，以YMC Trait C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-水（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，39%A→40%A;15～20 min，40%A→45%A;20～25 min，45%A→60%A;25～30 min，60%A→80%A;30～34 min，80%A）;流速為0.20 mL/min;柱溫為30 ℃;指紋圖譜檢測波長為310 nm，定量分析檢測波長為248 nm;進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含花椒毒素10 μg、佛手柑內(nèi)酯5 μg、歐前胡素35 μg、蛇床子素35 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取蛇床子藥材粉末（過三號篩，下同）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率50 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 取蛇床子藥材（編號S8）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以蛇床子素峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，10個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.05%～0.25%、0.08%～0.61%（n=6），均小于3.0%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取同批次蛇床子藥材粉末（編號S8）6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以蛇床子素峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，10個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.08%～0.36%、0.23%～2.35%（n=6），均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取蛇床子藥材（編號S8）供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以蛇床子素峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，10個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.05%～0.36%、0.27%～1.58%（n=7），均小于3.0%，說明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立及相似度評價 取21批蛇床子藥材粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，以S8樣品圖譜為參照進(jìn)行保留時間校正和全峰匹配。結(jié)果顯示，21批蛇床子藥材指紋圖譜中共有10個共有峰（圖1）。以平均數(shù)法生成蛇床子藥材對照指紋圖譜（圖2）。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》計算21批蛇床子藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度。結(jié)果顯示，21批樣品中大多數(shù)批次樣品（編號S7和S14除外）的相似度均不低于0.999，詳見表2。

2.3.5 共有峰的指認(rèn) 查閱文獻(xiàn)[3]，在與混合對照品（同法測定，見圖3）比對的同時，結(jié)合色譜峰的紫外吸收光譜對10個共有峰進(jìn)行指認(rèn)，共指認(rèn)了4個共有峰，即峰4為花椒毒素、峰8為佛手柑內(nèi)酯、峰9為歐前胡素、峰10為蛇床子素。

2.4 系統(tǒng)聚類分析

以10個共有峰峰面積為變量，采用組間連接法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，設(shè)歐氏距離為20，采用Z得分法對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見圖4。圖4顯示，21批蛇床子藥材樣品被劃分為3類，其中S7為一類，S14為一類，其余19批為一類。

2.5 4種香豆素類成分含量的測定

2.5.1 專屬性考察 取“2.2.1”項下混合對照品溶液、“2.2.2”項下供試品溶液（編號S8）、空白溶劑（80%甲醇），按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（圖5，空白溶劑圖略）。結(jié)果顯示，花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素的保留時間分別約為19.4、26.4、31.4、32.8 min，與相鄰色譜峰的分離度均大于2.5，理論板數(shù)均大于20 000，空白溶劑對測定無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密稱取花椒毒素對照品0.745 mg、佛手柑內(nèi)酯對照品2.838 mg、歐前胡素對照品7.771 mg、蛇床子素對照品35.594 mg，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液5、2、1、0.4、0.2 mL，分別置于20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得系列濃度的混合對照品溶液。精密吸取上述混合對照品貯備液及系列濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、對照品質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程及線性范圍如表3所示。

2.5.3 精密度試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素峰面積的RSD分別為0.83%、1.41%、0.12%、0.24%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取同批次蛇床子藥材粉末（編號S8）6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果顯示，花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素含量的RSD分別為0.50%、0.71%、0.55%、0.74%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取蛇床子藥材（編號S8）供試品溶液適量，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素峰面積的RSD分別為0.38%、0.49%、0.69%、0.28%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 取已知含量的蛇床子藥材粉末（編號S8）約0.15 g，精密稱定，按樣品中4種成分已知量的0.5、1、1.5倍加入花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素的混合對照品溶液（配制方法同“2.5.2”項），每種質(zhì)量濃度平行3份。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素的加樣回收率分別為100.26%～107.45%、101.47%～106.01%、98.42%～103.11%、98.44%～103.11%，RSD均小于3.0%（n=9），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.7 相對校正因子的計算 以蛇床子素為內(nèi)參物，按下式計算其他組分與內(nèi)參物的相對校正因子（fk/m）：fk/m=fk/fm=（Wk×Am）/（Wm×Ak）。式中，Ak為內(nèi)參物的峰面積，Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量濃度，Am為m組分的峰面積，Wm為m組分的質(zhì)量濃度[9]。根據(jù)“2.5.2”項下線性關(guān)系考察結(jié)果，以對照品的質(zhì)量濃度及其對應(yīng)色譜峰的峰面積分別計算花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素的相對校正因子，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素的平均相對校正因子分別為0.181 4、0.258 6、0.731 6，RSD分別為1.14%、0.30%、2.51%（n=6）。

2.5.8 耐用性考察 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液1 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別考察Waters H-Class、Agilent 1290、Thermo Vanquish型超高效液相色譜儀，YMC Trait C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Agilent SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱以及柱溫±2 ℃、流速±0.02 mL/min對花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素相對校正因子的影響，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，在上述條件下，花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素相對校正因子的RSD均小于3.0%（n=3），表明不同色譜儀、色譜柱以及較小變化的柱溫、流速對上述3種成分的相對校正因子無顯著影響。

2.5.9 色譜峰定位 根據(jù)“2.5.8”項下耐用性考察結(jié)果，以蛇床子素峰為參照峰，計算花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素的相對保留時間，結(jié)果見表7。結(jié)果顯示，在不同色譜儀、色譜柱以及較小變化的柱溫、流速條件下，花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素相對保留時間的RSD均小于5.0%（n=3），說明相對保留時間比較穩(wěn)定，可以采用相對保留時間對花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素的色譜峰進(jìn)行定位。本研究得不同色譜條件下花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯和歐前胡素的平均相對保留時間分別為0.550、0.788、0.960。

2.5.10 含量測定 取21批蛇床子藥材粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。采用外標(biāo)法計算其中蛇床子素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素的含量;以蛇床子素為內(nèi)參物，采用一測多評法計算花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素的含量，并計算兩種測定法的相對偏差，結(jié)果見表8。結(jié)果顯示，兩種方法測定的花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素含量的相對偏差[（A-B）/（A+B）×100%，式中A表示外標(biāo)法結(jié)果，B表示一測多評法結(jié)果]分別在0.88%～1.07%、2.22%～2.29%、0.67%～2.93%范圍內(nèi)，均小于3.0%，表明一測多評法與外標(biāo)法測得的含量結(jié)果無明顯差異，一測多評法的結(jié)果可靠性高。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

本研究采用超高效液相色譜法構(gòu)建蛇床子藥材指紋圖譜，并對其中4種成分進(jìn)行含量測定。與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，超高效液相色譜法分辨率更高、分析能力更強(qiáng)、分析時間更短，同時減少了溶劑用量，降低了分析成本[10]。本研究前期分別對色譜柱、流動相體系、檢測波長、柱溫等進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，在色譜柱為YMC Trait C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、流動相為甲醇-水（梯度洗脫）、流速為0.20 mL/min、檢測波長為248 nm（指紋圖譜檢測波長為310 nm）、柱溫為30 ℃的色譜條件下，蛇床子藥材色譜圖的整體基線平穩(wěn)，各色譜峰分離效果良好且方法重復(fù)性良好。

3.2 供試品溶液制備方法考察

本課題組以花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素的含量以及各色譜峰“峰面積/稱樣量”為評價指標(biāo)，考察了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇、乙醇對蛇床子中花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素提取效率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)提取溶劑為80%甲醇時，各待測成分色譜峰響應(yīng)值高、基線平穩(wěn)，提取效果最好，且色譜信息豐富。另外，本課題組還對超聲提取和加熱回流的提取效率進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)兩者的提取效率沒有明顯差別，故為了操作更加簡便，本研究選擇超聲提取。同時，本課題組進(jìn)一步對樣品提取時間、料液比進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，超聲提取30 min已能夠?qū)悠诽崛⊥耆?當(dāng)料液比為0.3 ∶ 20（g/mL）時，4種待測成分均已被完全提取。通過上述考察，本課題組最終確定最優(yōu)供試品溶液制備方法如下：料液比為0.3 ∶ 20（g/mL），80%甲醇超聲提取30 min。

3.3 指紋圖譜分析

本研究基于21批蛇床子藥材的超高效液相色譜疊加指紋圖譜，采用平均數(shù)法建立了其對照指紋圖譜，并確認(rèn)了10個共有峰。相似度評價結(jié)果顯示，產(chǎn)自山東省日照市（編號S7）和河南省南陽市（編號S14）蛇床子藥材樣品的圖譜與對照指紋圖譜的相似度小于0.999，其余批次蛇床子藥材樣品的相似度均不小于0.999。筆者發(fā)現(xiàn)，S7與其余20批樣品的差異主要表現(xiàn)在峰1的峰高或峰面積較其他批次大;而S14主要表現(xiàn)在峰4的峰高或峰面積較其他批次小，這可能與藥材生長的環(huán)境、采收時間及產(chǎn)地加工方式等的差異有關(guān)。總體而言，21批蛇床子藥材的相似度均在0.99以上，說明21批蛇床子藥材指紋圖譜相似度較高，質(zhì)量比較穩(wěn)定;指紋圖譜的相似度評價結(jié)果可以作為藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的依據(jù)。

3.4 含量測定分析

香豆素類成分為蛇床子藥材的主要活性成分[3]，為了進(jìn)一步明確不同產(chǎn)地蛇床子中活性成分的差異，嚴(yán)格控制臨床用蛇床子的質(zhì)量，很有必要對蛇床子中所含香豆素類成分進(jìn)行含量測定。而香豆素類成分容易受地域溫度、降雨量和日照時長的影響[4]。本研究對21批產(chǎn)自7個產(chǎn)地的蛇床子藥材進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示，21批蛇床子藥材均符合2020年版《中國藥典》規(guī)定——蛇床子藥材蛇床子素的含量不少于1.0%（即10 mg/g）[1];4種香豆素類成分的總含量在22.712～52.806 mg/g（外標(biāo)法）之間，總含量按產(chǎn)地排序由高至低依次為江蘇省徐州市>湖北省宜昌市>山東省濱州市>江蘇省鹽城市>山東省日照市>河南省南陽市>黑龍江省哈爾濱市。這可能是因為南方地區(qū)的溫度、降雨量和日照時間總體上更有利于蛇床子的生長和香豆素類成分的富集[4]。但是，對于某些特殊類型的香豆素，北方天氣可能更利于其富集，如黑龍江省哈爾濱市蛇床子藥材中佛手柑內(nèi)酯的含量明顯高于其他產(chǎn)地。

綜上所述，本研究利用超高效液相色譜法建立了蛇床子藥材的指紋圖譜，并建立了測定4種香豆素類成分的一測多評法，實現(xiàn)了對蛇床子中蛇床子素、佛手柑內(nèi)酯、花椒毒素、歐前胡素含量的控制，為蛇床子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了參考。

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（收稿日期：2021-06-27 修回日期：2021-12-16）

（編輯：鄒麗娟）