楊博凱，王志會(huì)，張玉蕾，武 鑫，劉金龍*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部 化學(xué)生態(tài)研究所，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷030801)

核桃青皮一般占果實(shí)質(zhì)量的50%以上，其含有大量醌類、黃酮類及多酚等生物活性物質(zhì)，因此開(kāi)發(fā)核桃青皮的潛在價(jià)值，實(shí)現(xiàn)核桃青皮的高值利用，對(duì)于提高核桃產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義[1]。植物多酚主要分布在植物根、果殼和果肉中[2]，在結(jié)構(gòu)上植物多酚可大致分為2類：水解單寧和縮合單寧，在性質(zhì)上植物多酚的多羥基結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)以氫鍵締合成各種各樣的結(jié)合多酚。植物多酚作為植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，直接或間接參與了許多代謝反應(yīng),是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一，同時(shí)對(duì)人體也極為有益。研究表明，植物多酚具有抗氧化作用[3-4]，能夠預(yù)防高血糖、高血脂和心腦血管等疾病[5-6]，而且還能降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)[7]。植物多酚具有收斂性，用其制成的護(hù)膚品可使皮膚的毛孔收縮，讓皮膚細(xì)膩[8]。此外，利用植物多酚對(duì)紫外波段的吸收特性，可以減少因日曬引起皮膚黑色素的形成。核桃青皮多酚是綠色天然的化合物，其含量?jī)H次于蒽醌和黃酮類[9]，在農(nóng)業(yè)、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有很高的利用價(jià)值。因此，核桃青皮多酚的研究和開(kāi)發(fā)越來(lái)越成為關(guān)注的熱點(diǎn)。

近年來(lái)，植物多酚的提取方法主要有溶劑提取法、生物酶解法、大孔樹(shù)脂吸附法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、亞臨界或超臨界流體萃取法、高壓脈沖電場(chǎng)萃取法以及閃蒸提取法等[10-11]。盡管一些新型的提取分離技術(shù)可用于核桃青皮多酚的提取，例如微波輔助提取法和超聲波輔助提取法，其應(yīng)用尚處于實(shí)驗(yàn)室階段，受工藝條件和成本的限制，不適合規(guī)模化生產(chǎn)。經(jīng)典的溶劑提取法雖然在提取效率上有一定局限性，但由于提取條件簡(jiǎn)單、易于量化生產(chǎn)，仍占據(jù)主導(dǎo)地位。針對(duì)溶劑提取法中提取溶劑的極性問(wèn)題，結(jié)合核桃青皮多酚的理化特性，可摻入功能助劑以改進(jìn)溶劑提取法[12]。六偏磷酸鈉(sodium hexametaphosphate,SHMP)為偏磷酸鈉聚合體的一種，具有膠體性質(zhì)，在水中溶解度大，但溶解速度較慢，且不恒定，不溶于有機(jī)溶劑[13]。張海燕等[14]用SHMP溶液從甜菜干粕中提取果膠時(shí)，發(fā)現(xiàn)SHMP可與果膠中的Ca2+形成螯合物，有利于果膠的溶出；趙國(guó)建等[15]利用SHMP輔助溶劑法成功提取了茄子多酚。作者從量化生產(chǎn)需求角度出發(fā)，考慮到各種提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)，采用SHMP輔助溶劑法提取核桃青皮多酚，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化核桃青皮多酚的提取工藝，為核桃青皮的深度研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

核桃，采自山西省太原市郊。收集剝離的核桃青皮，洗凈后置于烘箱中60 ℃殺青，烘干至恒重，常溫下粉碎，過(guò)80目篩，密封、干燥、避光的條件下保存，備用。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，成都思科華生物技術(shù)有限公司；硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇、六偏磷酸鈉(SHMP)等試劑均為市售分析純。酒石酸亞鐵溶液(分別稱取0.500 g硫酸亞鐵和2.500 g酒石酸鉀鈉溶于蒸餾水中，定容至500 mL)；pH值7.5的磷酸緩沖溶液(分別稱取3.736 g磷酸氫二鈉和0.734 g磷酸二氫鉀溶于蒸餾水中，定容至500 mL)。

棱光721N型可見(jiàn)分光光度計(jì)；電子分析天平；HH-42型數(shù)顯恒溫三用水箱；80-2型電動(dòng)離心機(jī)；ZD-88型恒溫?fù)u床。

1.2 方法

1.2.1 核桃青皮多酚的SHMP輔助提取

準(zhǔn)確稱取干燥的核桃青皮粉末 2.00 g 于150 mL具塞錐形瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇、適量SHMP，以保鮮膜封口，充分搖勻后，置于恒溫?fù)u床進(jìn)行浸提；將提取液減壓抽濾，離心，取上清液測(cè)定核桃青皮多酚含量。

1.2.2 核桃青皮多酚含量的測(cè)定

1.2.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品為參照物，采用酒石酸亞鐵比色法測(cè)定核桃青皮多酚含量。精確稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品1.701 2 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，得0.10 mol·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稀釋100倍后，得1.0×10-3mol·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL的1.0×10-3mol·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，加入4 mL蒸餾水、5 mL酒石酸亞鐵溶液，用pH值7.5的磷酸緩沖溶液定容，搖勻，得沒(méi)食子酸濃度(mol·L-1)分別為0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以1 cm比色皿，于 540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程：A=3.0×103c-0.0044，R2=0.9996。

1.2.2.2 多酚提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確移取5.0 mL提取液于25 mL容量瓶中，按照1.2.2.1方法測(cè)定540 nm處吸光度，按下式計(jì)算核桃青皮多酚提取率(mg·g-1)：

式中：c為多酚濃度，mol·L-1；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)，此處取5.0；M為沒(méi)食子酸的相對(duì)分子質(zhì)量；m為核桃青皮干粉的質(zhì)量，g。

1.2.3 SHMP輔助提取工藝優(yōu)化

在45 ℃水浴條件下進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、SHMP用量等4個(gè)因素對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響。 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 軟件設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)、SHMP用量(D)為自變量，以核桃青皮多酚提取率為響應(yīng)值，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodologies

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

計(jì)算重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值(m)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)，結(jié)果以m±sd的形式表示，分別采用Design-Expert、SPSS、Origin等軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理，以P<0.05的Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響

固定液料比為20∶1(mL∶g,下同)、提取時(shí)間為80 min、SHMP用量為0.1%，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%、30%、40%、50%、60%)對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphenols from walnut green husk

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，核桃青皮多酚提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，多酚提取率達(dá)到最高(5.95 mg·g-1)，顯著高于其它處理組。這是由于，乙醇通過(guò)羥基與多酚物質(zhì)以氫鍵締合，破壞多酚與蛋白質(zhì)、多糖等大分子之間的結(jié)合，使得多酚溶解于提取液中[16]；但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，提取液的極性將會(huì)相應(yīng)減小，提取液與核桃青皮中多酚物質(zhì)極性的相似程度變差，依照相似相溶原則，使得多酚物質(zhì)在提取液中的溶解度減小。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心水平。

2.1.2 液料比對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、提取時(shí)間為80 min、SHMP用量為0.1%，考察液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1) 對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 液料比對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polyphenols from walnut green husk

由圖2可知，隨著液料比的增大，即提取溶劑用量的增加，核桃青皮多酚提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為25∶1時(shí)，多酚提取率達(dá)到最高(6.33 mg·g-1)，顯著高于其它處理組。這是由于，提取溶劑用量的增加使得多酚溶解量的增幅加大，對(duì)多酚提取率的升高起到明顯的促進(jìn)作用；但液料比過(guò)大時(shí)，受原料中多酚物質(zhì)總量的限制，多酚物質(zhì)溶解量的增幅減小，對(duì)多酚提取率的升高不能起到明顯的促進(jìn)作用。因此，結(jié)合提取效率及溶劑消耗情況，選擇液料比為25∶1作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心水平。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、液料比為20∶1、SHMP用量為0.1%，考察提取時(shí)間(40 min、60 min、80 min、100 min、120 min) 對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃青皮多酚提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為100 min時(shí)，多酚提取率達(dá)到最高(7.19 mg·g-1)。這是由于，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃青皮中多酚物質(zhì)與大分子之間的結(jié)合被充分?jǐn)嚅_(kāi)，有利于提取；但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取液中的多酚物質(zhì)因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間與空氣接觸會(huì)被氧化成醌，反而導(dǎo)致多酚提取率降低。因此，選擇提取時(shí)間為100 min作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心水平。

圖3 提取時(shí)間對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from walnut green husk

2.1.4 SHMP用量對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、液料比為20∶1、提取時(shí)間為100 min，考察SHMP用量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 SHMP用量對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響Fig.4 Effect of SHMP dosage on extraction rate of polyphenols from walnut green husk

由圖4可知，SHMP的加入對(duì)于核桃青皮中多酚物質(zhì)的提取有明顯的促進(jìn)作用，且隨著SHMP用量的增加，核桃青皮多酚提取率明顯升高，當(dāng)SHMP用量增至0.4%時(shí)，多酚提取率達(dá)到最高(7.78 mg·g-1)；繼續(xù)增加SHMP用量，多酚提取率降低。這是由于，SHMP呈堿性，可以使多酚物質(zhì)離子化，有利于提取；但SHMP過(guò)多，使得自由溶劑分子減少反而導(dǎo)致提取液活性降低，多酚溶解度也隨之減小[17]。因此，選擇SHMP用量為0.4%作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心水平。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of response surface methodologies

運(yùn)用Design-Expert 軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸模型方程為：Y=8.04+0.20A+0.29B+0.089C+0.083D-0.15AB-0.13AC+0.032AD+0.019BC+0.015BD-0.073CD-0.40A2-0.30B2-0.42C2-0.53D2。

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of regression model

2.3 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對(duì)核桃青皮多酚提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖5所示。

在三維響應(yīng)面圖中，響應(yīng)值從小到大的變化越快則響應(yīng)面的坡度越陡峭，說(shuō)明此因素對(duì)多酚提取率的影響越顯著，反之，響應(yīng)面越平緩，說(shuō)明此因素對(duì)多酚提取率的影響越小。在等高線圖中，最小圓的中心為響應(yīng)值的最大值，圓形表示2個(gè)因素之間的交互作用較弱，橢圓形表示2個(gè)因素之間的交互作用較強(qiáng)。由圖5a、b、f可知，響應(yīng)面曲面較陡峭，等高線為橢圓形，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、提取時(shí)間與SHMP用量之間的交互作用較強(qiáng)，對(duì)多酚提取率的影響顯著；由圖5c、d、e可知，響應(yīng)面曲面較平緩，等高線接近于圓形，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與SHMP用量、液料比與提取時(shí)間、液料比與SHMP用量之間的交互作用較弱，對(duì)多酚提取率的影響較小。

圖5 各因素交互作用對(duì)核桃青皮多酚提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot for interaction between various factors on extraction rate of polyphenols from walnut green husk

2.4 最佳提取工藝的確定及驗(yàn)證

利用響應(yīng)面法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，得到核桃青皮多酚的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比25∶1、提取時(shí)間110 min、SHMP用量0.4%，多酚提取率的預(yù)測(cè)值為8.12 mg·g-1。在此工藝條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得核桃青皮多酚平均提取率為8.14 mg·g-1，可見(jiàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值比較接近，此模型較真實(shí)地?cái)M合了實(shí)際情況[18]，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、SHMP用量對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)行了4因素3水平優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，各因素對(duì)核桃青皮多酚提取率的影響順序?yàn)椋阂毫媳?乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>SHMP用量；最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比25∶1(mL∶g)、提取時(shí)間110 min、SHMP用量0.4%，在此條件下，核桃青皮多酚提取率為8.14 mg·g-1，雖不及微波輔助提取法的核桃青皮單寧提取率(20.36 mg·g-1)[9]，但與超聲波輔助提取法的核桃青皮多酚提取率(10.49 mg·g-1)[19]接近，說(shuō)明添加適量SHMP，可提高溶劑提取法的多酚提取率，此法可用于量化生產(chǎn)。