許 莉，阮加陳，楊光樂，周宇豪，王勛銘，莊君茹，張 崗*

(1．廈門醫(yī)學院 廈門市海洋藥用天然產(chǎn)物資源重點實驗室，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學院 天然化妝品福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建 廈門361023)

紅樹林微生物因其獨特的生態(tài)特征、生物多樣性及豐富的次級代謝產(chǎn)物類型，成為海洋藥物研究的重點領(lǐng)域之一[1]。曲霉屬真菌是紅樹林微生物的重要成員，也是發(fā)現(xiàn)先導化合物的重要資源[2-3]。作者利用涂布法從廈門紅樹林植物白骨壤根部分離得到1株內(nèi)生真菌，通過測定ITS序列對該菌株進行鑒定，對菌株在大米培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物進行分離純化，通過波譜學數(shù)據(jù)分析對主成分結(jié)構(gòu)進行鑒定，并對其抗氧化活性進行評價。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

白骨壤根，采自廈門市龍舟池風景區(qū)，經(jīng)廈門醫(yī)學院鮑紅娟副教授鑒定為馬鞭草科植物白骨壤(Avicenniamarina)的根。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，青島海博生物；總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP法)，碧云天公司；超氧陰離子清除能力檢測試劑盒，索萊寶公司；色譜用甲醇，Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1260 infinity系列分析及制備型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；分析及半制備反相YMC Pack ODS-A 色譜柱(250 mm×5 mm，5 μm；250 mm×10 mm，5 μm，),日本YMC公司；AV-500型超導核磁共振波譜儀，Bruker公司；Q Exactive Focus 組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；鈣流檢測工作站(Molecular Device FlexStation 3型酶標儀)。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：取商品化PDA培養(yǎng)基粉末適量，按說明書配制，滅菌后稍冷卻，無菌條件下取適量倒入培養(yǎng)平板中，冷卻，備用。

大米培養(yǎng)基：取10份大米，每份90 g，分別置于10個500 mL容量瓶中，加入120 mL純化水，115 ℃滅菌后，冷卻，備用。

1.3 內(nèi)生真菌的分離

將白骨壤根洗凈，用無菌棉球吸干水分；在超凈工作臺中用無菌小刀將白骨壤根切成長度為4 cm的小段，先用75%乙醇浸泡10 s，再用次氯酸鈉溶液(40 mg·L-1) 消毒30 s，最后用無菌水漂洗4次，剪去兩端褐變部分，將中間部分剪成0.5 cm左右小段，用無菌棉球吸干表面的水分；將樣品剪碎置于無菌研缽中，加入5 mL無菌水，研磨，吸取研磨溶液200 μL涂布于PDA培養(yǎng)基中，26 ℃下倒置培養(yǎng)5～7 d，做3次重復實驗。為驗證表面消毒效果，實驗中設(shè)置漂洗(最后一次漂洗材料的無菌水涂布于PDA雙抗培養(yǎng)基)和印記(最后一次消毒材料的外表面印記于PDA雙抗培養(yǎng)基)2個對照組。待平板上長出各種形態(tài)的菌落后，用接種針挑取不同形態(tài)的單菌落分別以平板劃線法接種于PDA培養(yǎng)基中，做好標記，26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后，觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落菌絲體，重復以上操作，直至獲得純單菌落，編號為 CW5-7。

1.4 內(nèi)生真菌的鑒定

收集分離得到的內(nèi)生真菌CW5-7菌絲體，送美吉生物公司進行測序。擴增引物為：ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5，5′-GGAAGTAA-AAGTCGTAACAAGG-3′。將內(nèi)生真菌CW5-7的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST比對，選擇并下載同源性最高的數(shù)條序列。使用Clustal軟件對搜集的序列進行多序列比對，根據(jù)比對結(jié)果使用MEGAX軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap分析中使用1 000次重復計算系統(tǒng)進化樹的支持率。

1.5 代謝產(chǎn)物主成分的分離與鑒定

1.5.1 內(nèi)生真菌的大規(guī)模培養(yǎng)

無菌環(huán)境下，將內(nèi)生真菌CW5-7接種于滅菌的大米培養(yǎng)基中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1個月后，加入500 mL乙酸乙酯，終止菌株生長。

1.5.2 主成分的分離

將內(nèi)生真菌CW5-7在大米培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物搗碎后，用乙酸乙酯浸泡7 d，過濾，收集濾液，備用。向每瓶代謝產(chǎn)物中加入500 mL乙酸乙酯，同法提取，濾液合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃下減壓回收溶劑，得提取物10.4 g。取少量提取物用甲醇溶解成濃度為5 mg·mL-1溶液，進行HPLC分析，初步確定提取物主成分類型及含量。色譜分析條件：梯度洗脫，甲醇體積分數(shù)從5%升至100%，流速0.8 mL·min-1，進樣量5 μL，檢測波長230 nm，分析時間30 min。

將其余提取物過反相固相萃取柱，分別用體積分數(shù)10%、30%、50%、70%、100%甲醇洗脫，每次洗脫液顏色變淡時更換下一體積分數(shù)甲醇，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃下減壓回收溶劑，得相應(yīng)各洗脫部位F1～F5。30%甲醇洗脫部位(F2)經(jīng)半制備HPLC進一步分離，得化合物Ⅰ(7 mg)及化合物Ⅱ(6 mg)，分離條件為：40%甲醇等度洗脫，流速2.0 mL·min-1。

1.5.3 結(jié)構(gòu)鑒定

采用核磁共振氫譜(1HNMR)、核磁共振碳譜(13CNMR)及高分辨質(zhì)譜(HR-ESI-MS)對化合物Ⅰ、Ⅱ的結(jié)構(gòu)進行鑒定。

1.6 代謝提取物及主成分的抗氧化活性評價

1.6.1 總抗氧化能力的測定

(1)

式中：c1為對應(yīng)Fe2+濃度，mmol·L-1；c2為樣品溶液濃度，mg·mL-1。

1.6.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定

取上述樣品溶液，按試劑盒說明方法測定樣品的超氧陰離子自由基清除能力；以VC 為陽性對照，清除率按式(2)計算：

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)生真菌的鑒定

內(nèi)生真菌CW5-7的ITS序列測試結(jié)果如下：

CATTACCGAG TGAGGGTTTC TCTGAAGCCC

免疫接種具有不可替代的作用，然而因重視程度不足，導致很多羊養(yǎng)殖戶存在僥幸心理，認為加強飼養(yǎng)管理即可。然而，一部分致病原在不同因素的作用下會導致羊患病[3]。

AACCTCCCAC CCGTGTATAC CGTACCCTGT

TGCTTCGGCG GGCCCGCCTC ACGGCCGCCG

GGGGACCTCG CGTCCCCGGG CCCGCGCCCG

CCGAAGACCC CAACACGAAC ACTGTCTGAA

AAGTGCAGTC TGAGTCGATT GTTACCAATC

AGTCAAAACT TTCAACAATG GATCTCTTGG

TTCCGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT

GCGATAACTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG

TGAATCATCG AGTCTTTGAA CGCACATTGC

GCCCCCTGGT ATTCCGGGGG GCATGCCTGT

CCGAGCGTCA TTGCTGCCCT CAAGCACGGC

TTGTGTGTTG GGCCCCGTCC CCGGTACCCC

CGGGGACGGG CCCGAAAGGC AGCGGCGGCA

CCGCGTCCGG TCCTCGAGCG TATGGGGCTT

TGTCACCCGC4 TCTGCAGGCC CGGCCGGCGC

CAGCCGACCA ACCCAACCAT TTTTTACAGG

TTGACCTCGG ATCAGGTAGG GATACCCGCT

GAACTTAAGC ATATCAATAA

根據(jù)測序結(jié)果進行序列比對、構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 內(nèi)生真菌CW5-7的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of endophytic fungus CW5-7

從圖1可以看出，內(nèi)生真菌CW5-7與A.candidus高度同源(同源性100%)，可判斷內(nèi)生真菌CW5-7為亮白曲霉(A.candidus)。

2.2 代謝提取物的 HPLC 分析(圖2)

從圖2可以看出，亮白曲霉 CW5-7 在大米培養(yǎng)基中的代謝提取物包括 2 個主成分，其保留時間分別為22.3 min 和 24.1 min。2 個主成分的紫外光譜(圖3)相似，峰位均在250～300 nm 處，提示為對三聯(lián)苯類化合物。

圖2 亮白曲霉CW5-7 代謝提取物的 HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of metabolic extracts of Aspergillus candidus CW5-7

圖3 化合物Ⅰ、Ⅱ的紫外光譜Fig.3 UV spectra of compounds Ⅰ and Ⅱ

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

采用反相固相萃取法初步分離CW5-7在大米培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)對三聯(lián)苯類化合物主要集中在 30%甲醇洗脫部分，采用半制備 HPLC 進一步分離，得到 2 個對三聯(lián)苯類化合物單體，其理化性質(zhì)及波譜學數(shù)據(jù)如下：

化合物Ⅰ：白色無定形粉末，F(xiàn)eCl3反應(yīng)顯陽性。HR-ESI-MS，m/z:393.039 8[M+Na]+；1HNMR (500 MHz，CD3OD)，δ：7.10(1H，d，J=2.0 Hz)，6.96(1H，dd，J=8.0 Hz、2.0 Hz)，6.84(1H，d，J=8.0 Hz)，6.82(1H，d，J=2.0 Hz)，6.80(1H，d，J=8.0 Hz)，6.70(1H，dd，J=8.0 Hz、2.0 Hz)，6.69(1H，d，J=2.0 Hz)，3.67(3H，s)，3.41(3H，s)；13CNMR (125 MHz，CD3OD)，δ：154.84(C-5′)，149.18(C-3′)，146.06(C-3)，145.88(C-4)，145.52(C-3″)，145.15(C-4″)，140.74(C-2′)，134.37(C-1′)，131.65(C-1)，126.94(C-1″)，123.75(C-6″)，121.53(C-6)，119.39(C-2)，118.82(C-4′)，117.18(C-2)，116.24(C-5)，115.74(C-5′)，104.94(C-6′)，60.77(C-2′a)，56.47(C-5′a)。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道的 3,3″-dihydroxyterphyllin基本一致，故確定化合物Ⅰ為 3,3″-dihydroxyterphyllin。

化合物Ⅱ：白色無定形粉末，F(xiàn)eCl3反應(yīng)顯陽性。HR-ESI-MS，m/z:355.116 3 [M+H]+；1HNMR (500 MHz，CD3OD)，δ:7.47(2H，d，J=8.5 Hz)，6.86(2H，d，J=8.5 Hz)，6.82(1H，d，J=2.0 Hz)，6.80(1H，d，J=8.0 Hz)，6.70(1H，dd，J=8.0 Hz、2.0 Hz)，6.43(1H，s)，3.68(3H，s)，3.38(3H，s)；13CNMR (125 MHz，CD3OD)，δ：157.96(C-4)，154.95(C-5′)，149.24(C-3′)，145.54(C-3″)，145.18(C-4″)，140.80(C-2′)，134.31(C-1)，131.63(C-2，6)，131.06(C-1′)，126.93(C-1″)，123.75(C-6″)，119.40(C-2″)，118.94(C-4′)，116.11(C-3，5)，115.75(C-5″)，104.91(C-6′)，60.75(C-2′a)，56.49(C-5′a)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道的3-hydroxyterphyllin 基本一致，故確定化合物Ⅱ為 3-hydroxyterphyllin。

化合物Ⅰ、Ⅱ的結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

圖4 化合物Ⅰ、Ⅱ的結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structural formulas of compounds Ⅰand Ⅱ

2.4 代謝提取物及主成分的抗氧化活性

代謝提取物及主成分的總抗氧化能力及超氧陰離子自由基清除能力分別如圖5、圖6所示。

圖5 代謝提取物及主成分的總抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capacity of metabolic extracts and principal components

圖6 代謝提取物及主成分對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.6 Superoxide anion free radical scavenging ability of metabolic extracts and principal components

從圖5可以看出，在濃度0.1 mg·mL-1下，代謝提取物、化合物Ⅰ和Ⅱ的總抗氧化能力分別為4.6 mmol·g-1、11.2 mmol·g-1、10.3 mmol·g-1，化合物Ⅰ的總抗氧化能力最強，化合物Ⅰ、Ⅱ的總抗氧化能力均優(yōu)于陽性藥物Trolox(7.3 mmol·g-1)。

從圖6可以看出，在相同濃度(0.1 mg·mL-1)下，代謝提取物、化合物Ⅰ和Ⅱ?qū)Τ蹶庪x子自由基的清除率分別為30.8%、52.4%、32.2%，化合物Ⅰ清除超氧陰離子自由基能力與VC(51.0%)相當。表明，亮白曲霉CW5-7代謝提取物及主成分化合物Ⅰ和Ⅱ具有較強的抗氧化活性。

3 結(jié)論

從廈門紅樹林植物白骨壤根部分離得到1株亮白曲霉CW5-7， 該曲霉在大米培養(yǎng)基中能夠大量代謝產(chǎn)生2個對三聯(lián)苯類化合物3,3″-dihydroxyterphyllin(Ⅰ)和 3-hydroxyterphyllin(Ⅱ)。對三聯(lián)苯是自然界中一大類成分，已經(jīng)從微生物等生物樣本中分離得到了諸多類似物[6]。該類化合物具有很多生物活性，如神經(jīng)保護、免疫抑制性[7]及細胞毒性[8]等。本研究發(fā)現(xiàn)亮白曲霉CW5-7代謝提取物及化合物Ⅰ和Ⅱ具有較強的抗氧化活性，在化妝品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。