胡 鵬 周煌輝 陳光靜 李安平

(1. 湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012；2. 貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；3. 中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004)

生物胺是一類含氮有機(jī)化合物的總稱，是合成蛋白質(zhì)、核苷酸、生物堿、荷爾蒙和芳香類化合物等的前體物質(zhì)，在食品中廣泛存在[1-3]。攝入少量的生物胺能提高免疫力、增強(qiáng)代謝活力、促進(jìn)生長和清除自由基等，但是攝入含有高濃度生物胺的食物會(huì)對消費(fèi)者的健康造成一定的風(fēng)險(xiǎn)，如引起頭痛、心悸、嘔吐、腹瀉和高血壓等[4-5]。組胺和酪胺是毒性最大的兩種生物胺，分別可以導(dǎo)致“鯖魚中毒”和“奶酪反應(yīng)”的癥狀?！磅涺~中毒”通常是因?yàn)槭秤媒饦岕~、沙丁魚、鳳尾魚、鯖魚等魚類導(dǎo)致的，表現(xiàn)為面部、頸部和上臂發(fā)紅，口腔麻木、灼燒或者頭痛、心悸、哮喘發(fā)作、蕁麻疹、胃腸道癥狀以及吞咽困難。酪胺中毒稱為“奶酪反應(yīng)”，表現(xiàn)為偏頭痛、心率加快、惡心、嘔吐、呼吸紊亂和血糖升高[6-8]。其余生物胺，2-苯乙胺、腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺攝入濃度過高時(shí)不僅會(huì)引起人體中毒，還可以抑制組胺和酪胺的代謝酶，從而增強(qiáng)組胺和酪胺的毒性[9]。盡管食用含有高濃度生物胺的食物會(huì)引起中毒，但目前對食物中生物胺的存在卻沒有統(tǒng)一的限量標(biāo)準(zhǔn)[10]。歐盟食品安全局對本地區(qū)發(fā)酵食品中生物胺進(jìn)行了定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，規(guī)定水產(chǎn)品中組胺含量不得超過100 mg/kg，規(guī)定食品中酪胺含量不得超過100 mg/kg，美國FDA規(guī)定食品中組胺含量不得超過50 mg/kg[11]。生物胺根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以分為芳香族(酪胺和2-苯乙胺)、脂肪族(腐胺、尸胺、精胺和亞精胺)和雜環(huán)族(組胺和色胺)。

臘肉是腌臘制品中的典型代表和重要組成部分，是具有中國特色的一種傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品[12]。按照臘肉的生產(chǎn)地分類，可分為廣東臘肉、四川臘肉、湖南臘肉等[13-14]。湖南臘肉是一種發(fā)酵肉制品，而發(fā)酵肉制品中的生物胺一直受到食用安全性的質(zhì)疑，但是目前未見湖南臘肉制品中生物胺測定的研究報(bào)道[15-16]。研究擬采集湖南臘肉制品，采用高效液相色譜法測定湖南臘肉制品中的8種生物胺含量，并檢測分析湖南臘肉制品中的水分含量、過氧化值和亞硝酸鹽含量等理化指標(biāo)，為評(píng)估湖南臘肉制品中生物胺安全風(fēng)險(xiǎn)及品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臘肉制品：市售；

尸胺、色胺、腐胺、組胺、苯乙胺、精胺、亞精胺、酪胺、丹磺酰氯：純度>98%，美國Sigma公司；

碳酸氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、亞鐵氰化鉀、碘化鉀、三氯甲烷、冰乙酸、正己烷、氨水、石油醚、鹽酸萘乙二胺、乙醇、乙醚、氫氧化鉀：分析純，上海麥克林有限公司；

對氨基苯磺酸、硼酸鈉、硫酸銅：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色儀：LC-20A型，日本島津公司；

超聲波清洗器：KQ5200B型，昆山市超聲儀器有限公司；

電子分析天平：CPA225D型，德國賽多利斯科學(xué)儀器公司；

臺(tái)式高速離心機(jī)：H1850型，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

六孔水浴鍋：HH-M6型，江蘇新春蘭儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與柱前衍生 按孫霞等[17]的方法略做修改：準(zhǔn)確稱取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺各50 mg，用0.1 mol/L鹽酸定容到50 mL，并分別稀釋制成終質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，50.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，加入200 μL NaOH(2 mol/L)，300 μL 飽和NaHCO3溶液，2 mL丹磺酰氯溶液(10 mg/mL 溶于丙酮)，混合均勻后在40 ℃黑暗中反應(yīng)45 min，立即加入100 μL 25%氨水以終止反應(yīng)，靜置30 min 后用乙腈定容至5 mL，最后用0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾，用于分析檢測。

1.3.2 生物胺的提取 準(zhǔn)確稱取絞碎后的湖南臘肉5.0 g 于50 mL離心管中，加入0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)20 mL，勻漿機(jī)上徹底勻漿，超聲提取30 min，8 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，沉淀部分再提取一次，將兩次提取的上清液合并，再用0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50 mL。移取上述樣品提取液10 mL于50 mL具塞離心管中，加入10 mL正己烷，渦旋振蕩3 min，靜置分層后棄去上層有機(jī)相，再重復(fù)脫脂一次即可獲得樣品生物胺提取液。取1 mL樣品提取液按標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行柱前衍生。

1.3.3 高效液相色譜分析條件 色譜柱使用Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，紫外檢測波長254 nm，高效液相色譜進(jìn)樣體積為20 μL，流速1.0 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.4 理化指標(biāo)測定方法

(1) 水分：按GB 5009.3—2016執(zhí)行。

(2) 過氧化值：按GB 5009.227—2016執(zhí)行。

(3) 亞硝酸鹽：按GB 5009.33—2016執(zhí)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的線性回歸分析和相關(guān)性分析，結(jié)果采用Excel軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品圖譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，8種生物胺衍生物在25 min內(nèi)全部出峰，分離效果好。其中，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺的保留時(shí)間分別為9.607，11.734，12.492，13.516，14.192，18.369，19.311，23.356 min。

1. 色胺 2. 苯乙胺 3. 腐胺 4. 尸胺 5. 組胺 6. 酪胺 7. 亞精胺 8. 精胺

由表2可知，在0.1～50 μg/mL范圍內(nèi)8種生物胺的質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，其R2均在0.999 1以上。重復(fù)測定8次生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，8種生物胺RSD均低于4.0%，表明具有良好的重復(fù)性。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、R2及精密度

2.2 市售湖南臘肉樣品中生物胺的種類和含量

由表3可知，8種生物胺中，僅色胺、尸胺2種生物胺在湖南臘肉部分樣品中未檢出。色胺含量的變化范圍為ND～8.46 mg/kg，苯乙胺含量的變化范圍為10.71～17.21 mg/kg，腐胺含量的變化范圍為15.37～40.59 mg/kg，尸胺含量的變化范圍為ND～80.36 mg/kg，組胺含量的變化范圍為0.43～10.24 mg/kg，酪胺含量的變化范圍為2.11～57.60 mg/kg，亞精胺含量的變化范圍為1.53～6.79 mg/kg，精胺含量的變化范圍為11.17～39.47 mg/kg，生物胺總量在臘肉中的含量范圍為127.22～166.24 mg/kg。

表3 湖南臘肉樣品中的生物胺含量?

由圖2可見，6種湖南臘肉樣品中尸胺的平均含量高于其他生物胺的，而色胺的最低。尸胺、腐胺、精胺、酪胺是湖南臘肉中的主要生物胺。組胺是8種生物胺中毒性最強(qiáng)的。歐盟規(guī)定除魚類外其他食品中組胺含量不得超過100 mg/kg[18]；美國食品和藥品監(jiān)督局確定食品中組胺含量應(yīng)低于50 mg/kg[19]。湖南臘肉中組胺平均含量為4.84 mg/kg，在樣品中組胺范圍為0.43～10.214 mg/kg，其含量遠(yuǎn)低于歐盟和美國食品和藥品監(jiān)督局的規(guī)定。酪胺是目前認(rèn)為毒性僅次于組胺的生物胺。歐盟規(guī)定酪胺在食品中的限量為100 mg/kg[18]，在所檢樣品中酪胺均低于100 mg/kg。苯乙胺目前還沒有相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)，但有研究[20]表明苯乙胺超過30 mg會(huì)引起偏頭痛的反應(yīng)。試驗(yàn)采集的樣品中苯乙胺含量均低于30 mg/kg。Lu等[21]對中國的傳統(tǒng)中式香腸中生物胺進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)酪胺、腐胺和尸胺是主要的生物胺，在香腸中14.28%的樣品生物胺總量超過美國食品和藥品監(jiān)督局規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)(1 000 mg/kg)，57.14%的樣品中酪胺的含量超過美國食品和藥品監(jiān)督局規(guī)定的限值(100 mg/kg)，11.9%的樣品中組胺含量超過美國食品和藥品監(jiān)督局規(guī)定的限值(50 mg/kg)，28.5%的樣品中苯乙胺含量超過30 mg/kg。孫霞等[17]研究了四川30種市售四川發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)尸胺、組胺、酪胺、腐胺是主要的生物胺，80%的樣品中組胺超過100 mg/kg，73%的樣品中酪胺的含量超過100 mg/kg，10%的樣品中生物胺總量超過1 000 mg/kg，76%的樣品中苯乙胺含量超過30 mg/kg。試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果不同的原因可能與生產(chǎn)原料、發(fā)酵方法、加工條件以及生產(chǎn)工藝等有關(guān)。

圖2 臘肉中不同生物胺平均含量的比較

由圖3可知，不同湖南臘肉樣品中生物胺總量有差別但不大。有研究[22]表明，食品中生物胺總量大于1 000 mg/kg 會(huì)對人體造成損害。由圖3可知，所有臘肉樣品中生物胺總量均低于1 000 mg/kg。因此，食用湖南臘肉不會(huì)引起不良反應(yīng)。

圖3 不同臘肉樣品中生物胺總量

2.3 理化指標(biāo)

2.3.1 水分含量 由圖4可知，湖南臘肉樣品中水分含量檢出范圍為13.4%～22.4%。水分含量與微生物生長密切相關(guān)，水分含量高，微生物生長活動(dòng)旺盛，在微生物作用下，游離氨基酸容易產(chǎn)生生物胺。所檢樣品水分含量在13%～23%，水分含量適中，對微生物生長有抑制作用，不利于生物胺的生成。

圖4 臘肉樣品中水分含量

2.3.2 過氧化值 過氧化值可衡量油脂酸敗程度，其值越高臘肉制品酸敗越嚴(yán)重。由圖5可知，湖南臘肉樣品中過氧化值范圍為0.014 2～0.035 0 g/100 g。GB 2730—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 腌臘肉制品》規(guī)定臘肉中過氧化值不超過0.50 g/100 g。因此，試驗(yàn)樣品的過氧化值均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 臘肉樣品中過氧化值

2.3.3 亞硝酸鹽 由圖6可知，此次檢測的樣品中，所有被檢湖南臘肉制品均檢出了亞硝酸鹽，檢出率為100%，檢出范圍為2.15～7.50 mg/kg。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定臘肉制品亞硝酸鹽殘留量不能超過30 mg/kg，所檢樣品均符合此標(biāo)準(zhǔn)要求。王新惠等[23]調(diào)查了四川腌臘肉制品中的亞硝酸鹽超標(biāo)情況，發(fā)現(xiàn)15份樣品中，亞硝酸鹽殘留量遠(yuǎn)低于30 mg/kg，合格率100%，與試驗(yàn)得出的結(jié)論一致。亞硝酸鹽可以與尸胺、腐胺反應(yīng)生成致癌物質(zhì)亞硝胺，并能增強(qiáng)生物胺的毒性風(fēng)險(xiǎn)。因此必須嚴(yán)格控制亞硝酸鹽的含量，確保消費(fèi)者的健康。

圖6 臘肉樣品中亞硝酸鹽含量

馬艷莉等[24]研究了白方腐乳開蓋后貯藏過程中生物胺和理化指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)pH與苯乙胺呈顯著正相關(guān)，與其他生物胺之間呈弱相關(guān)，氨基態(tài)氮與苯乙胺、尸胺、組胺呈顯著正相關(guān)。吳訓(xùn)忠等[25]研究了發(fā)酵辣椒中生物胺含量及其品質(zhì)，表明生物胺含量與氨基酸態(tài)氮、總酸、還原糖含量之間未發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)相關(guān)性。曾雪晴等[26]研究了市售郫縣豆瓣醬中生物胺與理化性質(zhì)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)郫縣豆瓣醬中生物胺含量與pH和總酸間沒有較強(qiáng)的相關(guān)性，只呈弱的相關(guān)，與鹽及氨基態(tài)氮含量間無相關(guān)性。試驗(yàn)中湖南臘肉理化指標(biāo)水分含量、過氧化值、亞硝酸鹽與生物胺含量之間的相關(guān)性不顯著，目前研究認(rèn)為氨基酸態(tài)氮含量與生物胺含量之間可能存在一定關(guān)聯(lián)，尚需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

采用丹磺酰氯衍生，高效液相色譜—紫外檢測湖南臘肉制品中生物胺的含量，8種生物胺在25 min內(nèi)良好分離。測定結(jié)果顯示，湖南臘肉制品中尸胺、腐胺、精胺、酪胺是主要的生物胺，生物胺總量在127.22～166.24 mg/kg。組胺含量低于50 mg/kg，酪胺含量均低于100 mg/kg。湖南臘肉生物胺含量均低于限定標(biāo)準(zhǔn)，在食用的安全水平之內(nèi)。理化指標(biāo)方面，樣品水分含量適中(13%～23%)，過氧化值和亞硝酸鹽均符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。研究中生物胺含量與水分、過氧化值、亞硝酸鹽之間未發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)相關(guān)性。湖南臘肉中生物胺的形成受多種因素的影響，要確定生物胺形成的具體原因，還需要進(jìn)一步研究氨基酸態(tài)氮和微生物對臘肉生物胺生成的具體影響。