許金根，靳二輝，王重龍，顧有方，*，李慶崗，*

(1.安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽 233100； 2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

鈣蛋白酶系統(tǒng)在動物肌原纖維更新和宰后肌肉嫩化中起著關(guān)鍵作用。鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin， CAST)作為鈣蛋白酶系統(tǒng)的一員，在細(xì)胞內(nèi)具有專一抑制鈣蛋白酶的活性，通過抑制肌原纖維蛋白的降解，從而對肌肉生長和嫩度有重要影響。豬基因位于2號染色體的q2.1-2.4處，并發(fā)現(xiàn)fⅠ、Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)有多態(tài)。研究表明，豬2號染色體q臂含有影響肌肉剪切力和嫩度的數(shù)量性狀位點(diǎn)，而豬基因就位于此區(qū)域。因此，是調(diào)控豬肉質(zhì)性狀的功能和位置候選基因。

基因能轉(zhuǎn)錄多種可變剪接體，在豬肌肉中至少存在3種類型。豬骨骼肌中的基因Ⅰ型和Ⅲ型轉(zhuǎn)錄本的含量顯著高于Ⅱ型，并且CAST蛋白Ⅲ型含量要高于Ⅰ型。Ciobanu等檢測豬基因序列(GenBank登錄號：M20160)，發(fā)現(xiàn)了3個錯義突變(Ser66Asn、Arg249Lys、Ser638Arg)，其中前兩個多態(tài)位點(diǎn)完全連鎖，并且單倍型249Lys-638Arg與剪切力、蒸煮損失、多汁性等肉質(zhì)性狀相關(guān)。另外，Stalder等發(fā)現(xiàn)，豬基因Ser638Arg位點(diǎn)對腌制火腿水分含量有顯著影響，對火腿產(chǎn)量、火腿質(zhì)量損失、鹽含量、肉色的效應(yīng)接近顯著水平。Rybarczyk等報(bào)道稱豬基因Ⅱ位點(diǎn)基因型個體間的背最長肌總蛋白、pH、pH、黃度(b)、滴水損失有顯著差異。Urbański等研究表明，豬基因Ser/Arg位點(diǎn)多態(tài)性與部分胴體性狀(眼肌面積、眼肌重)顯著相關(guān)。這些研究結(jié)果表明，基因多態(tài)性與豬肉質(zhì)性狀密切相關(guān)。

鑒于基因?qū)θ赓|(zhì)性狀具有重要的調(diào)控作用，本試驗(yàn)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法檢測巴克夏豬、霍壽黑豬及其雜交F代基因多態(tài)性，并利用生物信息學(xué)分析該堿基變異對mRNA二級結(jié)構(gòu)以及豬CAST Ⅲ型蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)等的影響，為研究基因單核苷酸多態(tài)性改善豬肉品質(zhì)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集32頭巴克夏豬、48頭霍壽黑豬和105頭巴克夏豬♂×霍壽黑豬♀雜交F代的耳組織，置于75%乙醇的離心管中。

1.2 基因組DNA提取和稀釋

用苯酚-氯仿法提取豬基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并用NanoDrop測定DNA濃度，統(tǒng)一稀釋到100 ng·μL。

1.3 PCR擴(kuò)增和酶切

用PCR擴(kuò)增豬基因，引物序列參照Ciobanu等，其中，上游引物：5′-AAACCTATTTTCAGGGATATGGG-3′，下游引物：5′-CCTTTGTTGTGTTCTCTGAGG-3′。豬基因擴(kuò)增長度為183 bp，基因型分型標(biāo)準(zhǔn)參照張璐等。

PCR反應(yīng)體系：1 μL DNA模板，10 μL 2×PCR Master Mix，上、下游引物各1 μL (10 mmol·mL)，加ddHO至20 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。

酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物10 μL，內(nèi)切酶Ⅱ(CAG↓CTG)1 μL，10×Buffer 2 μL，HO 7 μL。37 ℃，酶切4 h后，用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測豬基因多態(tài)性。

1.4 序列生物信息學(xué)分析

RNAfold web server (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預(yù)測mRNA二級結(jié)構(gòu)。ExPASy數(shù)據(jù)庫proteomics (https://www.expasy.org/proteomics)的ProtParam、SOPMA、NCBI CDD分別預(yù)測豬CAST蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域。用CBS在線服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/)的NetPhos 3.1預(yù)測蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬CAST基因多態(tài)性檢測結(jié)果

用PCR擴(kuò)增豬基因序列，限制性內(nèi)切酶Ⅱ消化后產(chǎn)生兩個等位基因A(183 bp)和C(142+41 bp)，共檢測到AA、AC和CC基因型(圖1)。

根據(jù)張璐等對該突變位點(diǎn)的測序結(jié)果，將其及周邊序列與豬基因mRNA序列(GenBank登錄號：M20160)比對，發(fā)現(xiàn)該堿基變異位于編碼區(qū)的第1 980位(c.1980A>C)，導(dǎo)致第660處的氨基酸發(fā)生改變(p.Arg660Ser)。

2.2 豬CAST基因的基因型頻率和基因頻率

M，DL2000 marker；1、7、8、9、10，AA型；2、3、5、6，AC型；4，CC型。M， DL 2000 marker; 1， 7， 8， 9， 10， AA genotype; 2， 3， 5， 6， AC genotype; 4， CC genotype.圖1 豬CAST基因多態(tài)性檢測Fig.1 Detection of the CAST gene polymorphism in pigs

豬基因Ⅱ酶切位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率，見表1。巴克夏豬AA型頻率(0.562 5)最高，AC型頻率(0.281 2)居中，CC型頻率(0.156 3)最低，等位基因A頻率(0.703 1)高于等位基因C(0.296 9)。霍壽黑豬AC型頻率(0.500 0)最高，AA型頻率(0.437 5)居中，CC型頻率(0.062 5)最低，等位基因A頻率(0.687 5)高于等位基因C(0.312 5)。巴克夏豬×霍壽黑豬AA型頻率(0.495 2)最高，AC型頻率(0.428 6)居中，CC型頻率(0.076 2)最低，等位基因A頻率(0.709 5)高于等位基因C(0.290 5)。該突變在3個豬群中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(>0.05)，呈中度多態(tài)(0.25

2.3 豬CAST基因mRNA二級結(jié)構(gòu)分析

用RNAfold web server預(yù)測表明，c.1980A>C使豬基因mRNA序列的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化，并且最小自由能由-1 110.40 kcal·mol變?yōu)?1 113.70 kcal·mol(圖2)。

2.4 豬CAST蛋白的理化性質(zhì)分析

用ProtParam軟件分析表明，p.Arg660Ser導(dǎo)致豬CAST Ⅲ型蛋白的部分理化性質(zhì)發(fā)生變化(表2)。其中，分子式、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性、正電荷(Arg和Lys)數(shù)略有變化，但負(fù)電荷(Asp和Glu)數(shù)無變化。

2.5 豬CAST蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析

用SOPMA在線軟件預(yù)測，結(jié)果顯示，p.Arg660Ser突變未改變豬CASTⅢ型蛋白的二級結(jié)構(gòu)，突變前后都是無規(guī)則卷曲(457個，占64.10%)占的比例最高，其次是α-螺旋(229個，占32.12%)，而β-轉(zhuǎn)角(14個，占1.96%)和延伸鏈(13個，占1.82%)占的比例較低(圖3)。

2.6 豬CAST蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

經(jīng)NCBI的Conserved domains預(yù)測表明，豬CASTⅢ型蛋白含有4個保守的結(jié)構(gòu)域(圖4)，分別位于第137～221位(E-value=6.19×10)、234～361位(E-value=4.39×10)、373～501位(E-value=6.97×10)、507～637位(E-value=3.95×10)，即該660位的突變不位于結(jié)構(gòu)域上。

表1 豬CAST基因的基因型頻率和基因頻率

A，M20160原序列；B，M20160突變序列。A， Before mutation; B， After mutation.圖2 豬CAST基因mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Prediction of mRNA secondary structure of pig CAST gene

表2 豬CAST Ⅲ型蛋白的理化性質(zhì)

2.7 豬CAST蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析

用NetPhos 3.1預(yù)測豬CASTⅢ型蛋白的磷酸化位點(diǎn)(預(yù)測值>閾值0.5)，第660位的Arg突變?yōu)镾er未產(chǎn)生新的磷酸化位點(diǎn)，但導(dǎo)致催化相鄰位p.663Ser磷酸化的蛋白激酶由4個(unsp、RSK、PKA、PKG)減少到2個(unsp、CKII)。

3 討論

鈣蛋白酶抑制蛋白對肉嫩化的生物學(xué)功能，故基因是影響豬肉質(zhì)的重要功能候選基因。孫立彬等在豬基因Ⅲ型mRNA序列(登錄號：M20160)的基礎(chǔ)上，在豬肌肉中擴(kuò)增和拼接出基因Ⅱ型CDS序列(登錄號：AY555195)，為進(jìn)一步研究豬基因編碼區(qū)的多態(tài)性提供基礎(chǔ)。由于CASTⅢ型蛋白在豬骨骼肌中表達(dá)量最高。因此，推測Ⅲ型可能是豬CAST蛋白在肌肉中發(fā)揮生物學(xué)作用的主要類型。

Ciobanu等研究發(fā)現(xiàn)，豬基因638處的Arg/Arg和Arg/Ser型肌肉硬度值顯著低于Ser/Ser型，并且單倍型249Lys-638Arg個體具有較優(yōu)的肉質(zhì)(如嫩度和多汁性高，剪切力和蒸煮損失低)。另有研究表明，豬基因Arg/Ser突變位點(diǎn)對3個國家的生火腿性狀影響不一致，推測該基因位點(diǎn)可能與其他遺傳位點(diǎn)或環(huán)境因素存在互作。Meyers等對豬基因DNA序列進(jìn)行重測序，發(fā)現(xiàn)有大量的堿基變異。通過比對分析，本試驗(yàn)檢測的A/C突變位于序列(登錄號：EU137105)第114 650處。因此，豬Ⅲ型基因c.1980A>C可能是直接或與其他功能突變位點(diǎn)緊密連鎖調(diào)控肉質(zhì)性狀的一個遺傳標(biāo)記。研究結(jié)果顯示，萊蕪豬、大白豬、杜洛克豬、商品雜交豬基因該位點(diǎn)都存在AA、AC和CC基因型，除了萊蕪豬，其他3個豬種都是等位基因A的頻率高于等位基因C。遼寧黑豬、大約克豬、長白豬、杜洛克豬基因c.1980A>C該位點(diǎn)都是等位基因A的頻率較高，并且AA型個體的背膘厚顯著低于AC和CC型。相反，新民豬和皮民豬基因該位點(diǎn)都是等位基因A的頻率較低。上述研究關(guān)于豬Ⅲ型基因c.1980A>C位點(diǎn)基因頻率的差異，可能是與豬種的遺傳背景不同有關(guān)?；魤酆谪i是安徽省優(yōu)良的地方豬種，其可以用于純繁生產(chǎn)或與巴克夏豬雜交育種生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的黑豬肉。本研究發(fā)現(xiàn)，基因c.1980A>C位點(diǎn)的等位基因A的頻率在巴克夏豬、霍壽黑豬、巴克夏豬×霍壽黑豬群中都高于C，并且基因型分布在3個豬群中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，都呈中度多態(tài)，為后期針對該多態(tài)位點(diǎn)用于霍壽黑豬及其與巴克夏豬雜交群體肉質(zhì)性狀的選育提供前提。

h，α-螺旋；e，延伸鏈；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無規(guī)則卷曲。h， α-helix; e， Extended strand; t， β-sheet; c， Random coil.圖3 豬CASTⅢ型蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of the secondary structure of porcine CAST type Ⅲ protein

圖4 豬CAST Ⅲ型蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Prediction of the domain of porcine CAST type Ⅲ protein

經(jīng)RNAfold web server預(yù)測，本研究發(fā)現(xiàn)c.1980A>C使豬基因Ⅲ型mRNA序列的二級結(jié)構(gòu)有一定變化，且最小自由能由-1 110.40 kcal·mol變?yōu)?1 113.70 kcal·mol。研究發(fā)現(xiàn)，錯義突變能改變基因mRNA的表達(dá)量。由于堿基A>C變異改變了mRNA的二級結(jié)構(gòu)，而且自由能變小(負(fù)的絕對值增大)增加了mRNA的穩(wěn)定性，可能會對豬基因mRNA的表達(dá)效率產(chǎn)生一定影響。本試驗(yàn)預(yù)測結(jié)果顯示，豬CAST Ⅲ型蛋白的分子式為CHNOS，分子量為77 123.61 u，等電點(diǎn)為5.21，為不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)45.69>40)，蛋白整體呈親水性(總平均親水性-1.195<0)，正電荷(Arg和Lys)數(shù)為123，負(fù)電荷(Asp和Glu)數(shù)為149。由于精氨酸的分子量、等電點(diǎn)、親水性(負(fù)數(shù)的絕對值)參數(shù)都高于絲氨酸，p.Arg660Ser導(dǎo)致豬CAST Ⅲ型蛋白的分子量、等電點(diǎn)、總平均親水性略有降低。并且，極性帶正電荷的精氨酸突變成極性不帶電荷的絲氨酸，使豬CAST Ⅲ型蛋白的正電荷(Arg和Lys)數(shù)減少1個，負(fù)電荷(Asp和Glu)數(shù)不變；而不穩(wěn)定系數(shù)略有升高，提示突變后的蛋白穩(wěn)定性可能會稍有降低。本研究預(yù)測顯示，豬CAST Ⅲ型蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，但是c.1980A>C引起的錯義突變對蛋白的二級結(jié)構(gòu)沒有影響。這可能是精氨酸和絲氨酸同屬于極性氨基酸，該單一位點(diǎn)突變不足以改變CAST的高級結(jié)構(gòu)。鈣蛋白酶抑制蛋白具有保守的功能結(jié)構(gòu)域。Ciobanu等報(bào)道稱該Ser/Arg突變位于CAST蛋白第4結(jié)構(gòu)域，但本試驗(yàn)用NCBI CDD工具預(yù)測豬CAST Ⅲ型蛋白4個保守結(jié)構(gòu)域的位置，發(fā)現(xiàn)p.Arg660Ser突變并不位于結(jié)構(gòu)域上。磷酸化是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的一種常見方式。研究表明，磷酸化可調(diào)節(jié)大鼠骨骼肌鈣蛋白酶抑制蛋白的抑制效率。另外，Ciobanu等預(yù)測稱該Ser/Arg突變導(dǎo)致催化相鄰3位(絲氨酸)磷酸化的PKA消失。本試驗(yàn)用NetPhos 3.1預(yù)測顯示，CAST Ⅲ型蛋白突變后使相鄰處p.663Ser磷酸化的蛋白激酶由4個(unsp、RSK、PKA、PKG)減少到2個(unsp、CKII)，這與上述結(jié)果相一致。因此，p.Arg660Ser突變是否對豬CAST蛋白的功能有影響還需進(jìn)一步研究。