羅 躍，吳小毛，*，劉阿麗，姚小龍，李榮玉，耿廣東

(貴州大學(xué)a.作物保護(hù)研究所；b.農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

斯高維爾炭疽菌()屬尖孢炭疽菌復(fù)合種(Complex)，被譯為好維爾炭疽、斯高威爾炭疽、斯科維爾炭疽等。近幾年，斯高維爾炭疽菌在我國(guó)多地被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，可引起辣椒、杧果、香蕉等果蔬炭疽病與蘋果炭疽葉枯病。斯高維爾炭疽菌對(duì)辣椒的毒力較強(qiáng)，是中國(guó)辣椒炭疽病中上的優(yōu)勢(shì)致病菌。有關(guān)報(bào)道中斯高維爾炭疽菌幾乎都分離自辣椒植株，其致病性、致病機(jī)理、抗性、感染預(yù)測(cè)等研究也多以辣椒為試驗(yàn)對(duì)象。貴州辣椒種植規(guī)模居全國(guó)之首，炭疽病普遍發(fā)生，經(jīng)分離鑒定多個(gè)辣椒炭疽病病樣發(fā)現(xiàn)，斯高維爾炭疽菌為貴州省內(nèi)引起辣椒炭疽病的重要致病菌種。

病原菌的檢測(cè)是炭疽病早期診斷和綜合防治的基礎(chǔ)，石妞妞等、劉西莉等報(bào)道了辣椒黑點(diǎn)炭疽菌()、平頭炭疽菌()的PCR檢測(cè)方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)，已成功用于水稻、葡萄、蘋果等多種植物的病原物檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)外尚未見將LAMP技術(shù)用于檢測(cè)斯高維爾炭疽菌的報(bào)道。本研究以斯高維爾炭疽菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列為靶基因，設(shè)計(jì)4條LAMP引物和1條環(huán)引物，通過對(duì)引物比例、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)體系等條件的選擇，建立對(duì)斯高維爾炭疽菌具有特異性擴(kuò)增的LAMP檢測(cè)方法，以期為斯高維爾炭疽菌引起的果蔬炭疽病診斷和防治提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試試劑

DL2 000 marker，大連寶生物工程公司；dNTPs，TakaRa公司；10×Thermopol Buffer、甜菜堿、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)，Sigma；MgSO，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；Bst DNA聚合酶，威展生物科技有限公司；DNA 膠回收試劑盒，博滿生物科技有限公司；石蠟油，蘇州禾森特種油品有限責(zé)任公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器、微波爐、DHG-9023A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱、超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SGZ150B型智能光照培養(yǎng)箱，常州澳華儀器有限公司；AL40電子天平，瑞士梅特勒公司；冰箱，新飛冰箱電器有限公司；等溫PCR，北京藍(lán)譜生物科技有限公司；HH-S8型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；電泳儀，美國(guó) Bio-Rad 公司。

1.1.3 供試分離物

3株斯高維爾炭疽菌分別分離自貴陽、遵義和畢節(jié)的患炭疽病辣椒植株，以1株葡萄炭疽病膠孢炭疽菌()、3株百香果炭疽病喀斯特炭疽菌()、2株水稻稻瘟病菌和2株刺梨葉斑病菌為對(duì)照，對(duì)照菌株均來自貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所。

1.2 LAMP檢測(cè)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

利用靶基因的6個(gè)特定區(qū)域B1、B2、B3、F3c、F2c、F1c設(shè)計(jì)4條LAMP引物，被擴(kuò)增的靶基因長(zhǎng)度小于200 bp，內(nèi)引物末端不含AT堿基對(duì)，引物的Tm值在55～65 ℃。根據(jù)LAMP設(shè)計(jì)的關(guān)鍵因素，如Tm值、GC含量等進(jìn)行初篩，并對(duì)靶序列進(jìn)行同源比對(duì)。核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列通過凝膠回收試劑盒純化并回收擴(kuò)增得到產(chǎn)物，根據(jù)斯高維爾炭疽菌核糖體的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列使用Prime ExplorerV5軟件在線設(shè)計(jì)的目標(biāo)片段，設(shè)計(jì)了4條LAMP引物(FIP:上游內(nèi)部引物，由F2和F1c組成；BIP：下游內(nèi)部引物，由B1C和B2組成；F3：上游外部引物；B3：下游外部引物)和1條環(huán)引物L(fēng)B，如表1所示。

表1 引物序列

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系和條件

首先進(jìn)行引物優(yōu)化。反應(yīng)溫度分別為60、62、64、65、66 ℃，反應(yīng)時(shí)間分別為30、40、50、60、70 min進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)體系中dNTP，Bst DNA 聚合酶、甜菜堿、MgSO模板濃度采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化，得到LAMP 25 μL反應(yīng)體系組合。試驗(yàn)選用鈣黃綠素和羥基萘酚藍(lán)作為指示劑。通過對(duì)比電泳結(jié)果進(jìn)行分析，確定最佳引物組合。在80 ℃恒溫水浴20 min即可失活。待反應(yīng)結(jié)束后，觀察顏色變化，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果。同時(shí)對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，選擇條帶較明亮、清晰的組合。

1.2.3 檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)

檢測(cè)靶標(biāo)以斯高維爾炭疽菌DNA為陽性對(duì)照，無菌水和其他菌株為陰性對(duì)照。采用已建立的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后觀察顯色反應(yīng)。加入鈣黃綠素觀察到綠色的樣品判斷為陽性，橘黃色判斷為陰性；加入羥基萘酚藍(lán)觀察到顏色為藍(lán)色的樣品判斷為陽性，紫色判斷為陰性。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若LAMP擴(kuò)增呈梯形條帶則為陽性，無擴(kuò)增條帶則為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP 反應(yīng)體系

用于檢測(cè)斯高維爾炭疽菌的LAMP最佳反應(yīng)體系為25 μL，組成如下：

10×熱聚合酶2.5 μL；dNTP(10 mmol·L)3.5 μL；甜菜堿(5 mol·L)4 μL；Bst DNA聚合酶1 μL；MgSO(100 mmol·L)1.5 μL；FIP(40 μmol·L)1 μL；BIP(40 μmol·L)1 μL；F3(10 μmol·L)0.5 μL；B3(10 μmol·L)0.5 μL；LB(10 μmol·L)2 μL；模板2 μL；鈣黃綠素(1.25 mmol·L)或羥基萘酚藍(lán)(3 mmol·L)1 μL；ddHO 4.5 μL。

2.2 LAMP反應(yīng)條件

采用2.1節(jié)反應(yīng)體系進(jìn)行最佳反應(yīng)溫度篩選，結(jié)果如圖1-a所示，LAMP體系在60、62、64、65、66 ℃等5個(gè)反應(yīng)溫度下均有擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)下呈梯形條帶，其中65 ℃條件下條帶最為清晰，確定LAMP體系最佳反應(yīng)溫度為65 ℃。

采用2.1節(jié)所列反應(yīng)體系進(jìn)行最佳反應(yīng)時(shí)間篩選，結(jié)果如圖1-b所示，LAMP體系在30、40、50、60、70 min 5個(gè)反應(yīng)時(shí)間下均可擴(kuò)增，其中，30、40 min 2個(gè)反應(yīng)時(shí)間下條帶較為模糊，50、60、70 min 3個(gè)反應(yīng)時(shí)間下條帶較為清晰，反應(yīng)60 min時(shí)條帶最為清晰明亮，確定LAMP體系最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.3 LAMP可視化檢測(cè)分析

反應(yīng)條件為65 ℃恒溫水浴60 min，反應(yīng)結(jié)束后，觀察顏色變化，并進(jìn)一步用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。反應(yīng)效果如圖2所示，斯高維爾炭疽菌LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特有的梯形條帶，陰性反應(yīng)無條帶出現(xiàn)，在羥基萘酚藍(lán)指示劑的作用下，陽性顯藍(lán)色，陰性顯紫色，在鈣黃綠素指示劑的作用下陽性結(jié)果為綠色，陰性結(jié)果為橘黃色，可視化程度高。

M:DL2000 marker。a：LAMP體系不同反應(yīng)溫度的擴(kuò)增結(jié)果；1，陰性對(duì)照；2，60 ℃；3，62 ℃；4，64 ℃；5，65 ℃；6，66 ℃。b：LAMP體系不同反應(yīng)時(shí)間的擴(kuò)增結(jié)果；1，陰性對(duì)照；2，30 min；3，40 min；4，50 min；5，60 min；6，70 min。M:DL2 000 marker. a: Amplification results of LAMP system at different reaction temperatures; 1， negative control; 2， 60 ℃;3， 62 ℃; 4， 64 ℃; 5， 65 ℃; 6， 66 ℃.b: Amplification result of LAMP system with different reaction times; 1， negative control; 2，30 min; 3，40 min; 4，50 min; 5，60 min; 6, 70 min.圖1 LAMP體系不同反應(yīng)溫度和時(shí)間的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of LAMP system at different reaction temperature and time

a:LAMP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果；b：LAMP產(chǎn)物羥基萘酚藍(lán)顯色結(jié)果；c：LAMP產(chǎn)物鈣黃綠素?zé)晒怙@色結(jié)果。1，陰性對(duì)照(-)；2，斯高維爾炭疽菌(+)；3，斯高維爾炭疽菌(+)；4，陰性對(duì)照(-)。a: LAMP product agarose gel electrophoresis detection results； b: LAMP product hydroxynaphthol blue color results； c: LAMP product calcein fluorescence color results. 1, negative control (-); 2, Colletotrichum scovillei (+);3, Colletotrichum scovillei (+); 4, negative control (-).圖2 LAMP反應(yīng)體系檢測(cè)斯高維爾炭疽菌Fig.2 LAMP reaction system for detecting Colletotrichum scovillei

2.4 試劑盒特異性試驗(yàn)分析

根據(jù)試劑盒應(yīng)用方法進(jìn)行檢測(cè)，分別以斯高維爾炭疽菌菌株和對(duì)照菌株的DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，斯高維爾炭疽菌DNA為陽性對(duì)照，滅菌的超純水為陰性對(duì)照。

選用鈣黃綠素作為指示劑，結(jié)果表明，在鈣黃綠素指示劑的作用下，65 ℃恒溫水浴60 min，3個(gè)斯高維爾炭疽菌LAMP產(chǎn)物均顯示綠色，而其他的對(duì)照菌株LAMP產(chǎn)物均顯示橘黃色(圖3-a)。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果僅斯高維爾炭疽菌LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特有的梯形條帶，其他對(duì)照菌株則沒有出現(xiàn)任何條帶(圖3-b)。

在羥基萘酚藍(lán)指示劑的作用下，65 ℃恒溫水浴60 min，3個(gè)斯高維爾炭疽菌LAMP產(chǎn)物為藍(lán)色，而其他對(duì)照菌株LAMP產(chǎn)物均顯示紫色(圖4-a)。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果僅斯高維爾炭疽菌LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特有的梯形條帶，其他對(duì)照菌株則沒有出現(xiàn)任何條帶(圖4-b)。進(jìn)一步表明本研究建立的LAMP方法對(duì)斯高維爾炭疽菌具有很好的特異性，容易辨別。

M：DL2000 DNA marker。a: LAMP產(chǎn)物鈣黃綠素?zé)晒怙@色結(jié)果; b: LAMP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。1，陰性對(duì)照；2～4，斯高維爾炭疽菌；5，膠孢炭疽菌；6～8，喀斯特炭疽菌；9～10，水稻稻瘟病菌；11～12，刺梨葉斑病菌。M: DL2000 DNA marker。a: LAMP product calcein fluorescence coloring result; b: LAMP product agarose gel electrophoresis detection result. 1， Negative control; 2-4， Colletotrichum scovillei; 5， Colletotrichum gloeosporioides; 6-8， Colletotrichum karstii; 9-10， Magnaporthe oryzae; 11-12， Aclinonema sp.圖3 鈣黃綠素指示下LAMP方法的特異性Fig.3 Specificity of LAMP method under the indication of calcei

M：DL2000 DNA marker。a: LAMP產(chǎn)物羥基萘酚藍(lán)顯色結(jié)果；b: LAMP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。1，陰性對(duì)照；2～4，斯高維爾炭疽菌；5，膠孢炭疽菌；6～8，喀斯特炭疽菌；9～10，水稻稻瘟病菌；11～12，刺梨葉斑病菌。M: DL2000 DNA marker。 a: LAMP product hydroxynaphthol blue color result; b: LAMP product agarose gel electrophoresis detection result. 1， Negative control; 2-4，Colletotrichum scovillei; 5， Colletotrichum gloeosporioides; 6-8， Colletotrichum karstii; 9-10， Magnaporthe oryzae; 11-12，Aclinonema sp.圖4 羥基萘酚藍(lán)指示下LAMP方法的特異性Fig.4 Specificity of LAMP method under the indication of hydroxynaphthol blue

3 結(jié)論與討論

本研究建立了果蔬斯高維爾炭疽菌特異擴(kuò)增的LAMP檢測(cè)方法，本方法特異性強(qiáng)，反應(yīng)時(shí)間60 min，在鈣黃綠素和羥基萘酚藍(lán)2種染料下均可進(jìn)行顯色反應(yīng)，條帶清晰，表明本研究研制的基于LAMP的檢測(cè)方法能成功應(yīng)用于果蔬斯高維爾炭疽菌樣品組織檢測(cè)，特異性好且可視化。此外，環(huán)引物的加入能夠加快反應(yīng)速度，但會(huì)影響檢測(cè)效果，其應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。LAMP檢測(cè)具有高靈敏度，但易受大氣氣溶膠污染，增加了產(chǎn)生假陽性的風(fēng)險(xiǎn)，在操作過程中要盡量避免假陽性的出現(xiàn)。傳統(tǒng)的提取法雖然DNA濃度和純度均較高，但操作步驟復(fù)雜，且易交叉污染。汪少麗等采用不開蓋檢測(cè)方法，將染料在反應(yīng)前加入到PCR管內(nèi)蓋上，能夠有效防止氣溶膠污染，本實(shí)驗(yàn)也采用石蠟油進(jìn)行封閉，少開蓋，盡量避免假陽性的產(chǎn)生。史亞娟等用LAMP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)假禾谷鐮刀菌擴(kuò)增范圍是61～66 ℃。汪少麗等對(duì)輪紋病菌檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，62～68 ℃均能擴(kuò)增出條帶。本研究檢測(cè)斯高維爾炭疽菌的擴(kuò)增溫度是60～66 ℃，最佳溫度為65 ℃，與以上研究結(jié)果相符，說明LAMP對(duì)溫度要求較低，范圍較廣。本研究建立了斯高維爾炭疽菌LAMP檢測(cè)體系，與傳統(tǒng)組織分離法和PCR鑒定方法相比，具有高效便捷、特異性好、可視化等優(yōu)勢(shì)，不需要專門的檢測(cè)儀器，使檢測(cè)實(shí)地應(yīng)用成為可能。本研究所得結(jié)果為斯高維爾炭疽菌的檢測(cè)和其引起的果蔬炭疽病防治提供了技術(shù)支撐，同時(shí)為其他病原菌的快速檢測(cè)方法研究提供了參考。