顏靜婷，喬 凱，蔡燕飛

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510642)

微生物肥料被視為化學(xué)肥料強(qiáng)有力的替代品，其中，芽孢桿菌是微生物肥料中最常添加的菌屬。在自然界，芽孢桿菌屬()是一類(lèi)需氧或兼性厭氧，可產(chǎn)生內(nèi)生孢子的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。當(dāng)接種到植物根際時(shí)，芽孢桿菌可通過(guò)增溶磷鉀、固氮、產(chǎn)生拮抗物質(zhì)和分泌植物激素等作用促進(jìn)植物生長(zhǎng)。同時(shí)，芽孢桿菌的內(nèi)生孢子具有較強(qiáng)的抗逆性，因此用芽孢桿菌制作的微生物肥料擁有更長(zhǎng)的貨架期和巨大的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)。

目前，已投入使用的芽孢桿菌屬菌種包括巨大芽孢桿菌()、枯草芽孢桿菌()、解淀粉芽孢桿菌()、地衣芽孢桿菌()、多黏類(lèi)芽孢桿菌()和膠質(zhì)芽孢桿菌()等。不同芽孢桿菌具有不同的促生性能和遺傳特性，這種特性甚至表現(xiàn)出菌種水平上的一致性，例如枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌通常能夠更好地定殖在植物根際，而蠟樣芽孢桿菌()和蘇云金芽孢桿菌()則會(huì)產(chǎn)生特定的毒性。出于生物安全性考慮，現(xiàn)行的微生物肥料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY 1109—2006《微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則》)對(duì)生產(chǎn)菌種的安全性做了分級(jí)：枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌()、地衣芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌、多黏類(lèi)芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌屬于一級(jí)安全水平，在應(yīng)用前可免做毒理學(xué)測(cè)試；蠟樣芽孢桿菌在應(yīng)用前需驗(yàn)證其是否具有致病性；而炭疽芽孢桿菌()則被禁止在微生物肥料中使用。從生產(chǎn)的角度來(lái)說(shuō)，菌種的準(zhǔn)確鑒定不僅有助于避免微生物肥料行業(yè)以次充好，也是保證產(chǎn)品安全性的必要措施。

長(zhǎng)期以來(lái)，生產(chǎn)上普遍使用生理生化鑒定和16S rRNA基因分型來(lái)鑒定芽孢桿菌，但一些近緣種，如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，具有相似的表型特性和極高的16S rRNA基因序列同源性，16S rRNA基因分型和表型分類(lèi)方法無(wú)法將其區(qū)分；因此，需要建立一種可以準(zhǔn)確鑒定芽孢桿菌微生物肥料菌種的方法。、和基因作為看家基因，具有高度保守性，而且在所有的細(xì)菌中都只有單一拷貝，可避免16S rRNA基因因多拷貝而表現(xiàn)出的異質(zhì)性，且其核苷酸序列長(zhǎng)度和進(jìn)化速度都遠(yuǎn)高于16S rRNA，顯示出更高的遺傳差異。也就是說(shuō)，、和基因在芽孢桿菌的鑒定上具有更強(qiáng)的分辨力。隨著芽孢桿菌屬全基因組測(cè)序工作的推進(jìn)，許多菌種的、和序列均可在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，這也為菌種的鑒定工作提供了便利。

本研究首先針對(duì)芽孢桿菌微生物肥料的常用菌種——巨大芽孢桿菌、阿氏芽孢桿菌()、地衣芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌、多黏類(lèi)芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌組、枯草芽孢桿菌組和蠟樣芽孢桿菌組，獲取相應(yīng)模式菌中編碼16S rRNA、RNA聚合酶β亞基蛋白(rpoB)、DNA促旋酶A亞基蛋白(gyrA)和組氨酸激酶(cheA)的核苷酸序列，比較其序列差異，以確定各看家基因在鑒定上述菌種中的作用，并明確在生產(chǎn)上鑒定相應(yīng)近緣種的流程。然后以16S rRNA測(cè)序結(jié)合、、特異性引物擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的方法鑒定了自主分離的19株生產(chǎn)可用的芽孢桿菌，驗(yàn)證了所提方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

本研究選取12株芽孢桿菌模式菌進(jìn)行研究，將其名稱(chēng)、GenBank序列號(hào)、基因序列長(zhǎng)度等相關(guān)信息整理于表1，上述信息主要在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到。

供試的19株待鑒定芽孢桿菌分離株(依次命名為YC001～YC019),均分離自植物根際，具有分泌生長(zhǎng)素、溶磷、拮抗病原菌等促生特性，被認(rèn)定為微生物肥料生產(chǎn)的可用菌株。經(jīng)初步的生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rRNA基因分型鑒定，認(rèn)為分屬于巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等(表2)。

1.2 菌株基因組DNA模板制備

對(duì)待鑒定的19株芽孢桿菌分離株，挑取經(jīng)平板活化的菌株單菌落于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min振蕩培養(yǎng)8 h，按Genstar細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)的方法提取菌株基因組DNA，作為PCR模板。

1.3 特異性引物設(shè)計(jì)

從GenBank下載模式菌的相關(guān)序列，用Primer-BLAST程序設(shè)計(jì)引物(表3)并進(jìn)行比對(duì)。每條引物均基于與本菌種同源而與其他菌種存在突變的區(qū)域設(shè)計(jì)，以保證其在相近種中同源性差異較大，其中，gyrA-bs和gyrA-ba引物僅能特異性擴(kuò)增相應(yīng)菌種。

1.4 分離株16S rRNA、rpoB、gyrA、cheA基因的PCR擴(kuò)增

以19株分離株的基因組DNA為模板，用16S rRNA引物擴(kuò)增所有菌株，用rpoB-bs、gyrA-bs、gyrA-ba引物擴(kuò)增YC001～YC005菌株，用gryA-bc引物擴(kuò)增YC006菌株，用cheA-bm引物擴(kuò)增YC009～YC017菌株。反應(yīng)體系為25 μL，包括PCR Mix預(yù)混液(含10×PCR緩沖液、dNTPs和聚合酶)12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L)各1 μL，25 ng基因組DNA(50 ng·μL)和10 μL無(wú)菌超純水。PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)32次；72 ℃延伸10 min。最后，取3 μL PCR產(chǎn)物在1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

表1 供試芽孢桿菌模式菌及其相關(guān)信息

表2 供試芽孢桿菌分離株的促生特性和來(lái)源

表3 特異性引物序列

1.5 模式菌株相關(guān)基因序列的相似性比較

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast-N程序，對(duì)比模式菌之間16S rRNA、、、基因的序列一致性，確定不同基因在區(qū)分不同菌種上的應(yīng)用。

1.6 分離株16S rRNA、rpoB、gyrA和cheA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)Blast-N比對(duì)19株分離株16S rRNA、、和基因擴(kuò)增序列的同源性，用Lasergene軟件中的SeqMan程序?qū)ρ挎邨U菌分離株的擴(kuò)增序列進(jìn)行拼接，再使用Clustal W算法進(jìn)行多序列比對(duì)，去除5′、3′末端的空序列，將所有序列修整為相同長(zhǎng)度，最后利用Mega 7軟件以鄰接法構(gòu)建供試分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 rpoB、gyrA和cheA基因在芽孢桿菌鑒定上的應(yīng)用

在菌株鑒定上，通常將3%的序列差異視為物種劃分的閾值。從模式菌16S rRNA的序列一致性(表4)可以看出：多黏類(lèi)芽孢桿菌ATCC 842、膠質(zhì)芽孢桿菌3016與其他菌株的序列一致性分別為87.99%～89.17%和81.12%～88.57%，均低于97%，說(shuō)明16S rRNA基因可以用于鑒定多黏類(lèi)芽孢桿菌和膠質(zhì)芽孢桿菌。但16S rRNA基因的異質(zhì)性，使其無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分芽孢桿菌近緣種和部分亞種。例如：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌組和解淀粉芽孢桿菌組模式菌的16S rRNA基因序列具有98.06%～99.87%的同源性；蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌的16S rRNA基因序列同樣具有極高的序列一致性。這說(shuō)明16S rRNA基因無(wú)法將解淀粉芽孢桿菌組、枯草芽孢桿菌組的菌種，以及地衣芽孢桿菌進(jìn)行精確區(qū)分，也無(wú)法區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌組、解淀粉芽孢桿菌組所屬菌種和地衣芽孢桿菌由于具有相似的表型和系統(tǒng)發(fā)育特征，被統(tǒng)稱(chēng)為“枯草芽孢桿菌復(fù)合體”。這3個(gè)種組之間基因的序列一致性均低于物種界定閾值(表5)，說(shuō)明基因可用于區(qū)分這3個(gè)種組，但其組內(nèi)亞種的基因序列一致性仍在97%以上。蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的情況也是如此，說(shuō)明無(wú)法用于區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌，也無(wú)法鑒定解淀粉芽孢桿菌組和枯草芽孢桿菌組的亞種，這與前人的研究結(jié)果一致。但是，“枯草芽孢桿菌復(fù)合體”菌種間和基因序列存在明顯差異(表6～7)，表明可以用和基因區(qū)分這幾個(gè)菌種。另外，蘇云金芽孢桿菌ATCC 10792與蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579的基因序列一致性?xún)H為94.54%，表明基因適用于區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌?？傮w來(lái)說(shuō)，除了巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌外，本文中其他近緣種都能用基因來(lái)區(qū)分，顯示出該基因在芽孢桿菌鑒定上的優(yōu)勢(shì)。阿氏芽孢桿菌B8W22的全基因組測(cè)序項(xiàng)目仍在進(jìn)行中，目前只能從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得該菌的16S rRNA基因和基因序列。阿氏芽孢桿菌B8W22與巨大芽孢桿菌ATCC 14581的基因的序列一致性為94.55%，這表明，基因可以用于區(qū)分巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌。同樣地，除蠟樣芽孢桿菌組以外，其他模式菌之間基因的序列一致性均低于97%，展現(xiàn)了基因在分子分型上的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，應(yīng)用、和基因鑒定芽孢桿菌的方法可總結(jié)為：(1)純化菌株并提取基因組DNA；(2)根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)簽注明的菌種信息，選擇相應(yīng)的引物(表8)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)根據(jù)產(chǎn)物擴(kuò)增條帶(和引物僅對(duì)相應(yīng)菌種表現(xiàn)為陽(yáng)性)、序列相似度和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定菌種。

2.2 基于16S rRNA、rpoB、gyrA和cheA基因的分離株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

根據(jù)Blast-N同源性比較的結(jié)果，菌株YC001、YC002、YC003、YC004、YC005與“枯草芽孢桿菌復(fù)合體”菌種的16S rRNA基因序列高度相似；菌株YC006的16S rRNA序列與蠟樣芽孢桿菌組菌種的序列一致性也超過(guò)99%；YC009、YC010、YC011、YC012、YC013、YC014、YC015、YC016、YC017的16S rRNA基因與巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌的序列一致性都超過(guò)99%。由16S rRNA基因的序列一致性和構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)可以看出：利用16S rRNA序列分析可將YC001、YC002、YC003、YC004、YC005分為枯草芽孢桿菌組和解淀粉芽孢桿菌組，但這些菌株與相應(yīng)模式菌的親緣關(guān)系非常近；YC006被鑒定為蠟樣芽孢桿菌組；YC009、YC010、YC011、YC012、YC013、YC014、YC015、YC016和YC017被鑒定為巨大芽孢桿菌或阿氏芽孢桿菌。此外，YC019、YC008、YC018和YC007與大猩猩芽孢桿菌()和根內(nèi)芽孢桿菌()、、德林芽孢桿菌()和諾瓦氏芽孢桿菌()、五大連池芽孢桿菌()和栗褐芽孢桿菌()、短短芽孢桿菌()和茹氏短芽孢桿菌()在16S rRNA基因上都有較高的序列一致性，由于目前數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有相應(yīng)模式菌的16S rRNA基因序列，因此根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的遺傳距離，將YC007鑒定為茹氏短芽孢桿菌，YC008鑒定為，YC018鑒定為五大連池芽孢桿菌，YC019鑒定為大猩猩芽孢桿菌。

表4 芽孢桿菌模式菌的16S rRNA基因序列一致性

表5 芽孢桿菌模式菌的rpoB基因序列一致性

表6 芽孢桿菌模式菌的cheA基因序列一致性

表7 芽孢桿菌模式菌的gyrA基因序列一致性

表8 鑒定菌種所用引物對(duì)應(yīng)表

菌株YC001～YC006、YC009～YC017的16S rRNA序列高度相似，基于16S rRNA鑒定結(jié)果，根據(jù)表8所列引物，分別用rpoB-bs、gyrA-bs、gyrA-ba對(duì)YC001～YC005進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用gyrA-bc對(duì)YC006進(jìn)行擴(kuò)增，用cheA-bm對(duì)YC009～YC017進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。

基于基因構(gòu)建的YC001～YC005的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)與基于16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的趨勢(shì)大體一致。從序列一致性來(lái)看：YC001與枯草芽孢桿菌的3個(gè)亞種均有超過(guò)97%的序列一致性，YC002、YC003、YC004和YC005與解淀粉芽孢桿菌組2個(gè)亞種的序列一致超過(guò)97%(表9)。基于序列一致性和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的一致性結(jié)果，將YC001鑒定為枯草芽孢桿菌組，將YC002、YC003、YC004和YC005歸為解淀粉芽孢桿菌組。盡管在用基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，這5個(gè)菌株都有與之親緣關(guān)系相對(duì)更近的菌種，但分離株與其他物種間的一致性仍高于97%，因此需要用更準(zhǔn)確的分型方法將其鑒定。

圖1 芽孢桿菌分離株的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Rooted neighbor-joining tree generated using 16S rRNA nucleotide sequences of Bacillus isolates

M，DNA分子量標(biāo)記；1，YC001；2，YC002；3，YC003；4，YC004；5，YC005；6，YC006；7，YC009；8，YC010；9，YC011；10，YC012；11，YC013；12，YC014；13，YC015；14，YC016；15，YC017。1， DNA marker; 1， YC001; 2， YC002; 3， YC003; 4， YC004; 5， YC005; 6，YC006; 7，YC009; 8， YC010; 9，YC011; 10， YC012; 11， YC013; 12， YC014; 13， YC015; 14， YC016; 15， YC017.圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic results of PCR amplified products

表9 分離株與枯草芽孢桿菌復(fù)合體模式菌的rpoB基因序列一致性

圖3 基于rpoB基因構(gòu)建的芽孢桿菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Rooted neighbor-joining tree generated using rpoB nucleotide sequences of Bacillus isolates

用基因進(jìn)一步確定YC001～YC006的分類(lèi)。YC002、YC003、YC004和YC005與解淀粉芽孢桿菌DSM7的序列一致性均低于97%，但與貝萊斯芽孢桿菌FZB42的序列一致性分別為97.95%、98.11%、98.38%和98.54%，且這些分離株在用基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與貝萊斯芽孢桿菌FZB42顯示出比與解淀粉芽孢桿菌DSM7更緊密的關(guān)系(圖4)，與用基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果一致。因此，將YC002、YC003、YC004和YC005鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，將YC001鑒定為枯草芽孢桿菌枯草亞種。YC006的序列與蘇云金芽孢桿菌ATCC 10792僅有92.91%的序列一致性，而與蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579有99.23%的序列一致性，因此將其鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

利用特異性引物擴(kuò)增、分析YC009～YC017菌株的基因序列。結(jié)果顯示，YC009、YC014和YC016分別與阿氏芽孢桿菌具有98.42%、97.97%和98.76%的序列一致性，而與巨大芽孢桿菌的序列一致性分別為94.06%、94.31%和94.29%(表10)。根據(jù)序列一致性，將YC009、YC014和YC016鑒定為阿氏芽孢桿菌。YC010、YC011、YC012、YC013、YC015、YC017與巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌基因的序列一致性均低于97%，無(wú)法準(zhǔn)確鑒別。目前，阿氏芽孢桿菌B8W22的全基因組測(cè)序工作尚未完成，且關(guān)于巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌近緣種的研究相對(duì)較少，可能存在尚未報(bào)道的其他近緣種。因此，要準(zhǔn)確鑒定上述菌株，還需要依賴(lài)全基因組測(cè)序工作的推進(jìn)，以及今后對(duì)芽孢桿菌種質(zhì)資源的持續(xù)挖掘。

圖4 基于gyrA基因構(gòu)建的芽孢桿菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Rooted neighbor-joining tree generated using gyrA nucleotide sequences of Bacillus isolates

表10 分離株與相應(yīng)模式菌的cheA序列比對(duì)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌最初是用表型特征，如細(xì)胞形狀、內(nèi)生孢子形成能力、運(yùn)動(dòng)性、溶血性等來(lái)進(jìn)行分類(lèi)的，然后再利用分子分型做進(jìn)一步表征。然而，表型和遺傳特性的相似性使得一些近緣種無(wú)法通過(guò)常規(guī)的生化測(cè)試和16S rRNA基因測(cè)序來(lái)區(qū)分。菌種鑒定的困難度，使得生產(chǎn)上出現(xiàn)質(zhì)量不佳次品的概率較大，甚至?xí)?lái)安全隱患。很多研究都強(qiáng)調(diào)了菌種鑒定在生產(chǎn)上的重要性，但這些研究大多集中在食品安全貯藏或益生菌行業(yè)。本研究主要針對(duì)微生物肥料中難以區(qū)別的常用芽孢桿菌，提出以3種看家基因(、和基因)作為16S rRNA基因分子分型的替代或補(bǔ)充的菌種鑒定方法，并用特異性引物擴(kuò)增、鑒定了19株可用于微生物肥料生產(chǎn)的芽孢桿菌分離株。其中，基因編碼的RNA聚合酶β亞基與DNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)，基因編碼的DNA促旋酶A亞基控制DNA超螺旋和復(fù)制起始，基因編碼的組氨酸激酶是細(xì)菌趨化適應(yīng)反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，且有研究表明，基因與地衣芽孢桿菌的生物膜形成和控制有關(guān)。

為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究檢索了各菌種模式菌的16S rRNA、、和基因，并使用Blast-N算法和Mega 7軟件進(jìn)行序列比較分析?；?6S rRNA的序列一致性比較，僅鑒定出多黏類(lèi)芽孢桿菌和膠質(zhì)芽孢桿菌，在進(jìn)一步的研究中，看家基因彌補(bǔ)了16S rRNA基因的局限性，準(zhǔn)確地區(qū)分了其他菌種。模式菌的基因序列差異表明，、和基因可作為系統(tǒng)發(fā)育的標(biāo)記，用于區(qū)分枯草芽孢桿菌組和相關(guān)近緣種，和基因還可以準(zhǔn)確地鑒定枯草芽孢桿菌組和解淀粉芽孢桿菌組的亞種。在類(lèi)似研究中，、和基因已被用于追溯枯草芽孢桿菌組和解淀粉芽孢桿菌組之間的進(jìn)化關(guān)系，基因還常被用于鑒定炭疽芽孢桿菌，追蹤食品加工行業(yè)的蠟樣芽孢桿菌污染。研究表明，基因不足以將蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌區(qū)分開(kāi)，這與本研究的結(jié)果一致。但基因可用于鑒別蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌，這彌補(bǔ)了基因在鑒定上的局限性。與基因相比，基因具有更高的區(qū)分度。本研究還發(fā)現(xiàn)，基因具有區(qū)分巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌的能力。

本研究利用不同的引物鑒定了19株具有促生效果的芽孢桿菌。通過(guò)16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析，鑒定了4株菌，分別為茹氏短芽孢桿菌、、五大連池芽孢桿菌、大猩猩芽孢桿菌；分析將另外4株菌鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，1株菌鑒定為枯草芽孢桿菌枯草亞種，1株鑒定為蠟樣芽孢桿菌，分析得出了相似的結(jié)果并支持該物種分類(lèi)；基于基因序列差異將3株菌鑒定為阿氏芽孢桿菌；另外6株菌與巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌的序列一致性均低于97%，暫時(shí)無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分。