鄭玲 代琪芳 陳雪冬

摘要：bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、生物合成及脅迫反應(yīng)等方面起著重要作用。利用生物信息學(xué)方法對森林草莓全基因組序列進(jìn)行bHLH家族的搜索和鑒定，共鑒定出112個森林草莓的bHLH基因，這些基因分別被定位在7條染色體上，但分布不均勻，在5號染色體上分布得最多，3號染色體上分布得最少。進(jìn)化樹結(jié)果顯示，森林草莓的bHLH家族可以進(jìn)一步被分為12個亞家族，其中第Ⅰ、Ⅲ亞族的成員較多。森林草莓bHLH家族基因的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，有73個FvbHLH基因與花的發(fā)育相關(guān)，有28個FvbHLH基因與果實(shí)的發(fā)育相關(guān)，其中FvbHLH97/36/55/39/42/52/26/44/68/54對森林草莓花的整個發(fā)育過程都尤為重要，而FvbHLH57/59/66/78/100/15/17/46則在果實(shí)發(fā)育中起到主要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：森林草莓;bHLH;進(jìn)化樹;花發(fā)育;果實(shí)發(fā)育

中圖分類號： S668.401? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0047-06

收稿日期：2021-03-28

基金項(xiàng)目：河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（編號：20A180018）;洛陽師范學(xué)院博士科研啟動項(xiàng)目（編號：180141051235）。

作者簡介：鄭 玲（1981—），女，河南南陽人，碩士，副教授，主要從事植物學(xué)研究。E-mail：linda2266@qq.com。

轉(zhuǎn)錄因子又稱為反式作用因子，是一類能夠結(jié)合在順式作用元件上調(diào)控基因表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白[1]。目前，人們已經(jīng)從植物中鑒定出很多轉(zhuǎn)錄因子，其中bHLH（堿性螺旋-環(huán)-螺旋）是第二大類轉(zhuǎn)錄因子[2]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子因含有高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)域而被命名，bHLH結(jié)構(gòu)域約含有60個保守氨基酸序列，由basic區(qū)域、HLH（helix-loop-helix）區(qū)域組成[3]。位于N端的basic區(qū)域是 DNA結(jié)合的堿性區(qū)域，約含有15個氨基酸，其中有6個是堿性氨基酸殘基;HLH區(qū)域位于C末端，主要由疏水氨基酸組成，并參與形成同源或異源二聚體[4]。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中最為廣泛存在，其功能也具有多樣性。在酵母和其他單細(xì)胞真核生物中，bHLH參與染色體分離和代謝調(diào)控等過程[5]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子可參與植物的物質(zhì)合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[6]，并在植物生長發(fā)育[7]及抗旱[8]、耐鹽[9]等脅迫應(yīng)答反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。植物中最早被發(fā)現(xiàn)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子（即玉米中由R基因編碼的Lc蛋白）的主要功能為參與花青素的生物合成[10]。隨后，擬南芥的AtbHLH1/2/42、水稻的OsbHLH013/016等基因都被證明與花青素的合成調(diào)控有關(guān)[11-13]，擬南芥AtbHLH40則與赤霉素的合成轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[14]。在響應(yīng)植物脅迫方面，擬南芥AtbHLH112是鹽、干旱及滲透脅迫的正調(diào)控因子[15];AtbHLH116基因是耐寒性的調(diào)節(jié)子，能夠提高植物的抗凍能力[16]。在植物生長發(fā)育方面，擬南芥的AtbHLH9、AtbHLH65基因均是調(diào)控植物生長發(fā)育的關(guān)鍵信號樞紐[17];AtbHLH95基因主要在胚乳中表達(dá)，控制胚胎發(fā)育，從而導(dǎo)致植物生長遲緩[18];擬南芥的AtbHLH21和水稻的OsbHLH164對花粉粒的形成及絨氈層細(xì)胞的發(fā)育有著關(guān)鍵的調(diào)控作用[19-20]。

森林草莓（Fragaria vesca）也稱野草莓，是薔薇科草莓屬的多年生草本植物，屬于二倍體植物[21]，具有相當(dāng)高的食用價值和藥用價值。目前，國內(nèi)外在分子生物學(xué)方面對擬南芥、水稻等植物bHLH家族的研究已經(jīng)較為成熟，然而還沒有關(guān)于森林草莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子鑒定和分析的報道。本研究利用生物信息學(xué)方法對森林草莓bHLH（FvbHLH）家族的成員進(jìn)行鑒定，并對其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化、基因在染色體上的分布、基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式等方面進(jìn)行全面分析，以期為將來深入研究該家族基因的結(jié)構(gòu)和功能提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 森林草莓bHLH家族的鑒定

本研究對象是森林草莓（Fragaria vesca）。2020年3—6月在洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室（214）電腦上進(jìn)行軟件操作和信息處理。森林草莓bHLH家族的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)來自Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html？）與PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫，由于2個數(shù)據(jù)庫中搜索到的結(jié)果會存在差異，因此將2類搜索結(jié)果進(jìn)行序列比對后，手動去除冗余序列，隨后利用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）在線軟件鑒定搜索的候選基因是否具有bHLH結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而獲得bHLH家族的所有成員。

1.2 森林草莓bHLH家族的理化性質(zhì)分析

通過在線軟件ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）得到森林草莓bHLH蛋白序列的基本理化性質(zhì)信息，如理論等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)量、分子量及總水平疏水性等。

1.3 森林草莓bHLH家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫下載森林草莓和擬南芥的bHLH序列，隨后通過MEGA 6.0的Clustal W工具進(jìn)行多序列比對，將獲得的比對結(jié)果用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[22]。同時采用相同方法單獨(dú)構(gòu)建森林草莓的bHLH家族進(jìn)化樹。

1.4 森林草莓bHLH基因在染色體上的定位

根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫中搜索到的FvbHLH基因在染色體上的位置信息，利用MapInspect軟件繪制基因在染色體上的分布圖[23]。

1.5 森林草莓bHLH基因在花、果實(shí)發(fā)育過程中的作用分析

從文獻(xiàn)[24-25]的附件中分別下載森林草莓花發(fā)育、果實(shí)發(fā)育過程中所有轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量，進(jìn)一步篩選出bHLH基因在各組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。用MeV4軟件分別對檢測到的FvbHLH基因表達(dá)量進(jìn)行聚類分析[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 森林草莓bHLH家族基因的鑒定及理化特性分析

通過PlantTFDB、Phytozome兩大數(shù)據(jù)庫共鑒定出112個候選bHLH家族基因，利用InterPro進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，這112個基因編碼的蛋白質(zhì)都具有完整的bHLH結(jié)構(gòu)域。同時利用ExPASy在線分析工具得到這112個FvbHLH家族基因編碼蛋白的理論等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)、原子組成及脂溶指數(shù)等理化信息。根據(jù)基因在染色體上的位置，將這112個轉(zhuǎn)錄因子依次命名為FvbHLH1～FvbHLH112。

結(jié)果顯示，各蛋白質(zhì)分子中的氨基酸數(shù)量在90（FvbHLH64）～1 496（FvbHLH27）個之間，平均為434個;蛋白質(zhì)分子量在10 296.6 u（FvbHLH64）～166 739.0 u（FvbHLH27）之間，平均為47 959.6 u;理論等電點(diǎn)在4.35（FvbHLH9）～10.94（FvbHLH106）之間，并且有70個蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在4～7之間，說明森林草莓bHLH家族蛋白的氨基酸序列的等電點(diǎn)大多在酸性范圍內(nèi)。有73個蛋白質(zhì)分子的不穩(wěn)定指數(shù)均大于50，說明bHLH蛋白質(zhì)的狀態(tài)不穩(wěn)定。對蛋白質(zhì)的親疏水性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，除FvbHLH76外，其余蛋白質(zhì)的總水平疏水性均為負(fù)值，表明森林草莓bHLH家族蛋白大多屬于親水蛋白。

2.2 森林草莓bHLH家族基因進(jìn)化樹的構(gòu)建

選取111個擬南芥bHLH家族成員作為參考來構(gòu)建森林草莓bHLH家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。根據(jù)擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子的分類系統(tǒng)，可將森林草莓的112個bHLH成員劃分為12個亞族。其中第Ⅵ亞族成員最少，只有1個FvbHLH、2個AtbHLH;其次是第Ⅱ亞族，有1個FvbHLH、3個AtbHLH;第Ⅲ亞族的成員數(shù)最多，包含19個FvbHLH、17個AtbHLH;第Ⅰ亞族的基因數(shù)也較多，有15個FvbHLH、17個AtbHLH。其余亞家族的成員數(shù)量不一。

2.3 森林草莓bHLH家族基因在染色體上的定位

利用MapInspect軟件繪制出基因在染色體上的分布情況，由圖2可以看出，在森林草莓的全部bHLH基因中，F(xiàn)vbHLH104～FvbHLH112尚未定位到染色體上，其余103個基因在7條染色體上均有分布，但分布不均勻。其中5號染色體上分布的基因最多，有22個（FvbHLH55～FvbHLH76）;其次是2、4號染色體，都各有17個基因（FvbHLH12～FvbHLH28和FvbHLH38～FvbHLH54）;3號染色體上分布的基因較少，為9個（FvbHLH29～FvbHLH37），其余染色體上的基因分布數(shù)量為11～15個不等。多條染色體上出現(xiàn)了由2個或多個基因聚集在一起形成的基因簇。

2.4 森林草莓bHLH基因在花發(fā)育過程中的作用分析

用MeV4軟件對檢測到的FvbHLH家族成員在花發(fā)育過程中相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行聚類分析。由圖3可以看出，在森林草莓的花瓣（flower）、花被（perianth）、花托（receptacle）、花藥（anther）及小孢子（micrsopore）、花粉（pollen）和雌蕊（carpel）發(fā)育的過程中，共有73個FvbHLH家族基因表達(dá)。

結(jié)果顯示，有10個基因（FvbHLH97/36/55/39/42/52/26/44/68/54）在所有組織中的表達(dá)量均較高。FvbHLH90/19/9/107/80/67/22/1/11/18/15/51/24/46這14個基因除了在花粉中不表達(dá)之外，在其余組織中均大量表達(dá)。同樣的，F(xiàn)vbHLH57/93/37/43/78/71也僅在小孢子、花粉中的表達(dá)量較低。此外，有些基因的表達(dá)模式顯示出組織特異性，例如FvbHLH53在花藥、花粉和雌蕊中高表達(dá);FvbHLH13在小孢子、花藥中高表達(dá);FvbHLH86在雌蕊、花藥中高表達(dá);FvbHLH89/34在花藥、花粉中高表達(dá);FvbHLH16只在花粉中大量表達(dá);FvbHLH12/4只在花藥發(fā)育過程中的表達(dá)水平較高;FvbHLH10/

112/88/63/29只在雌蕊中高表達(dá)。

2.5 森林草莓bHLH家族基因在果實(shí)發(fā)育過程中的作用分析

通過MeV4軟件對檢測到的FvbHLH家族成員在果實(shí)發(fā)育過程中相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行聚類分析。由圖4可以看出，共有28個FvbHLH家族基因在森林草莓胚胎（embryo）、胚珠（ovule）、種皮（ghost）、種子（seed）及子房壁（wall）、果皮（cortex）、木髓（pith）的發(fā)育過程中表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，在胚珠、種子和子房壁發(fā)育的過程中，有14個基因即FvbHLH90/96/58/40/57/91/16/66/78/100/81/15/17/46均顯示出高表達(dá)，其中FvbHLH96/57/91/16/66/78/100/81/15/17/46在種皮整個發(fā)育階段中的表達(dá)量也很高，還有部分基因的表達(dá)水平則在種皮的不同發(fā)育階段存在較大差異，例如FvbHLH10/91/33的表達(dá)量持續(xù)增加，而FvbHLH58/66/15的表達(dá)量卻逐漸減少。在果皮、木髓中，F(xiàn)vbHLH77/57/59/112/99/66/78/100/79/64/30/15/17/46共14個基因的表達(dá)水平都很高，有些基因則只在這2種組織的特定發(fā)育階段表達(dá)，例如FvbHLH90、FvbHLH84分別只在果皮、木髓發(fā)育的 1～2階段顯示出較高的表達(dá)量，F(xiàn)vbHLH72只在果皮發(fā)育的4～5階段高表達(dá)。在胚胎發(fā)育過程中，bHLH基因的表達(dá)量較少，只有FvbHLH90/10/59/101/33/88/81/72共8個基因的表達(dá)量較高。

3 討論

目前， 還未見關(guān)于森林草莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子的

報道，本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定得到112個森林草莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子，對其理化性質(zhì)進(jìn)行全面分析發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子大多是不穩(wěn)定的親水蛋白，且等電點(diǎn)大多處于酸性范圍。在擬南芥、水稻中的bHLH蛋白等電點(diǎn)也存在這種現(xiàn)象，表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域中雖然存在basic堿性區(qū)域，但酸性氨基酸也同樣富集于蛋白質(zhì)分子中[27]。

在模式植物擬南芥中，研究者將133個bHLH基因劃分為12個亞家族[28];水稻中的167個bHLH轉(zhuǎn)錄因子被分為22個亞家族[29];159個馬鈴薯[30]、230個大白菜[31]bHLH家族分別被劃分為21、24個亞族。本研究參照擬南芥的分類方式，將森林草莓的112個bHLH轉(zhuǎn)錄因子分成12個亞族，其中第Ⅱ、Ⅵ亞族的成員最少，均只有1個FvbHLH基因;第Ⅲ亞族的成員最多，為19個。在擬南芥bHLH亞家族中較少的也是第Ⅱ、Ⅵ亞族，第Ⅲ亞族的bHLH成員也較多。通過染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，bHLH基因在各號染色體上的分布都不均勻，并且形成了基因簇，說明它們可能屬于串聯(lián)復(fù)制。

已有大量研究發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子與植物的脅迫反應(yīng)有關(guān)，包括抗鹽、干旱、缺鐵等抗脅迫過程。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，森林草莓FvbHLH30與擬南芥AtbHLH112[15]聚在同一分支，推測其在抗鹽、耐旱和抗?jié)B透脅迫方面也有重要作用;FvbHLH59與AtbHLH116[16]位于同一分支，因此FvbHLH59可能與植物的抗低溫調(diào)控有關(guān)。bHLH家族在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)合成方面也有關(guān)鍵作用。森林草莓FvbHLH93/57/21與擬南芥AtbHLH1/2/42[11-12]的進(jìn)化關(guān)系較近，推測它們與花青素的合成有關(guān);FvbHLH6與AtbHLH40[14]聚在同一分支，推測FvbHLH6也參與了赤霉素的合成轉(zhuǎn)導(dǎo)。

表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，在花的發(fā)育過程中顯示出高表達(dá)的部分基因主要集中于第Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ及Ⅺ、Ⅻ亞族，其中FvbHLH97/36/55/39/42/52/26/44/68/54的表達(dá)量在森林草莓花的整個發(fā)育過程中都很高，表明這些基因?qū)τ诨ǖ陌l(fā)育尤為重要。FvbHLH57/59/66/78/100/15/17/46幾乎在果實(shí)發(fā)育的全過程表達(dá)，說明這8個基因與森林草莓果實(shí)的發(fā)育調(diào)控有關(guān)。草莓是一種重要的小型漿果，其果實(shí)主要由花托發(fā)育而來[24]。由此推測，在花托發(fā)育中起較大調(diào)控作用的FvbHLH19/21/57/9等基因可能對改善森林草莓果實(shí)的品質(zhì)起著重要的作用。

本研究對森林草莓bHLH家族成員的理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、染色體分布及組織表達(dá)模式等方面進(jìn)行了全面分析，初步分析了bHLH基因在森林草莓花和果實(shí)發(fā)育過程中的作用，可為提高其經(jīng)濟(jì)價值提供理論基礎(chǔ)和研究方向，并為進(jìn)一步了解森林草莓bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系和在植物生長發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制提供重要的依據(jù)。

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