乳源低聚糖及其代謝的研究進展

高舒曼，潘雨琦，張力中，董奕岑，劉小鳴，趙建新，張 灝，陳 衛(wèi)

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

母乳中含有許多對新生兒有益的物質(zhì)，其中在乳腺中由乳糖合成而來的母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMO）是母乳中第三豐富的固體成分，其含量僅次于乳糖和脂質(zhì)。HMO具有復雜的結(jié)構(gòu)，目前被鑒定出超過200 種HMO，它們在消化道中不被胃酸和消化酶分解，可以完整地到達大腸，被共生在腸道中的菌群代謝。HMO通過作用于腸道生物群影響人體免疫系統(tǒng)及新生兒發(fā)育，因此，通常被視作益生元的一種。

除了人乳，其他哺乳動物的乳汁中也含有不同組成與含量的低聚糖，這些低聚糖中，有的與HMO的核心成分結(jié)構(gòu)一致，可以作為HMO的替代品添加到配方乳粉中。近年來許多文獻報道，不同結(jié)構(gòu)的乳源低聚糖可以被腸道菌群代謝，并起到影響腸道菌群組成與豐度的作用。本文針對乳源低聚糖的最新研究進展予以綜述，著重關(guān)注腸道菌群分解代謝低聚糖，提出關(guān)于乳源低聚糖調(diào)節(jié)腸道菌群的合理猜想。

1 乳源低聚糖

HMO可以刺激胃腸道中雙歧桿菌的生長，同時可能具有抗黏附作用，減少病原菌與腸道細胞的結(jié)合，對腸道相關(guān)淋巴組織水平的免疫過程也有調(diào)節(jié)作用。大量研究從體外發(fā)酵、動物與人體實驗的角度證明了HMO中的代表性結(jié)構(gòu)具有“雙歧效應(yīng)”，即能促進以雙歧桿菌為代表的益生菌生長。到目前為止，母乳中種類繁多的低聚糖還不能成功地被大規(guī)模復制，以添加在嬰兒配方乳粉中。因此，類似HMO的產(chǎn)品可能作為嬰兒甚至成人調(diào)節(jié)腸道菌群的補充劑，不同哺乳動物的低聚糖組成以及與HMO的相似性值得被研究。

低聚糖在哺乳動物的乳汁中含量與組成不一，且在不同泌乳階段有較大差異。母乳中低聚糖含量約為10～15 g/L，有文獻報道人初乳的低聚糖含量可以達到20 g/L以上，是牛乳的40 倍；山羊乳初乳的低聚糖含量為1.11～1.35 g/L，常乳中為250～300 mg/L，大約是牛乳的5 倍[1]。與人乳中超過200 種HMO不同，牛乳低聚糖（bovine milk oligosaccharides，BMO）被報道67 種不同結(jié)構(gòu)，山羊乳低聚糖（caprine milk oligosaccharides，CMO）則為40 種[2]。其中，至少有10 種BMO和9 種CMO與某些HMO具有相同結(jié)構(gòu)。

HMO一般由3～22 個單糖單元組成，包括D-葡萄糖（D-glucose，Glc）、D-半乳糖（D-galactose，Gal）、N-乙酰-D-氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）、L-巖藻糖（L-fucose，F(xiàn)uc）和N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac），它們通過多種鍵連接在一起[3]。每個HMO結(jié)構(gòu)開始于末端的乳糖單元Gal-β-1,4-Glc與Gal-β-1,3-GlcNAc，并分別通過β-1,3和β-1,6糖苷鍵在乳糖單元的基礎(chǔ)上延伸。到目前為止，已描述了19 種不同的HMO核心結(jié)構(gòu)[4]。這些核心結(jié)構(gòu)可以是線性或分支的，并且可以進一步通過巖藻糖基化或唾液酸化延長。BMO和CMO中除了組成HMO的5 種單糖外，還含有N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）[5]。

HMO與其他哺乳動物低聚糖的主要區(qū)別在于，人乳中含有高水平的巖藻糖化低聚糖，含量約占母乳中低聚糖的70%，其中檢測到的2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）含量可達到4.65 g/L[6]，但是在其他哺乳動物中這類低聚糖的比例較低，CMO中含3.8%，BMO則幾乎沒有。而唾液酸化的低聚糖在BMO中含量非常豐富，約占70%，在HMO中這一比例為10%～20%[7]，CMO中為40%～50%[2]。隨著泌乳階段變化，乳中的低聚糖含量和成分也會改變，哺乳動物初乳中的低聚糖和免疫球蛋白含量最高，成熟乳中的低聚糖含量逐漸降低。BMO中唾液酸化的低聚糖在初乳中相對豐度超過70%，但在成熟乳中逐漸下降到50%左右[8]。山羊乳初乳中，6’-唾液酸乳糖（6’-sialyllactose，6’-SL）與3’-唾液酸乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）含量最高，并且含量與品種、泌乳時間、產(chǎn)量密切相關(guān)[9]。因此，在比較乳源低聚糖的成分及作用時，不同泌乳階段的潛在影響也值得關(guān)注。

2 腸道菌群對乳源低聚糖的代謝

并非所有的腸道微生物均可利用乳源低聚糖。Marcobal等[10]對腸道菌群中10 個屬、共16 種菌的HMO代謝能力進行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅長雙歧桿菌嬰兒亞種、脆弱擬桿菌、普通擬桿菌能夠高效代謝HMO，而腸球菌、鏈球菌、韋永氏球菌、真細菌、梭菌和大腸桿菌菌株在以HMO為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長情況不佳或根本沒有生長。大量其他研究也證實，雙歧桿菌可以較好地利用乳源低聚糖，所涉及的代謝途徑也逐漸清晰。此外，Bidart等[11]對13 種腸道相關(guān)乳桿菌進行HMO核心結(jié)構(gòu)半乳糖-N-二糖（galacto-N-biose，GNB）/乳糖-N-二糖（lacto-N-biose，LNB）（GNB/LNB）利用能力探究，發(fā)現(xiàn)僅干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、玉米乳桿菌、格氏乳桿菌和約氏乳桿菌能進行GNB/LNB的體外發(fā)酵。其后續(xù)研究揭示了干酪乳桿菌對GNB/LNB的代謝途徑，且該途徑與迄今為止描述的雙歧桿菌所采用的代謝途徑完全不同[12]。

2.1 雙歧桿菌對乳源低聚糖的代謝

研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌已經(jīng)進化出2 種乳源低聚糖代謝模式，一種是轉(zhuǎn)運蛋白依賴型，即胞內(nèi)代謝模式，另一種是胞外糖苷酶依賴型，即胞外代謝模式。如圖1所示，兩歧雙歧桿菌和部分長雙歧桿菌菌株是采用胞外代謝模式的典型菌株，它們利用細胞外糖苷酶從細胞外的HMO中釋放單糖和/或二糖，釋放的HMO降解物隨后被細胞導入并在細胞質(zhì)中進一步降解；而其他采用胞內(nèi)代謝模式的雙歧桿菌，如長雙歧桿菌長亞種和假小鏈雙歧桿菌等，則通過特定的轉(zhuǎn)運蛋白內(nèi)化HMO，并在細胞內(nèi)將之降解[13-14]。

圖1 4 種主要的嬰兒腸道相關(guān)雙歧桿菌的乳源低聚糖利用途徑Fig. 1 Pathways for utilization of milk oligosaccharides by four infant intestinal bifidobacteria

2.1.1 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

目前，對乳源低聚糖代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的研究還相對較少，僅GNB/LNB、FL和乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT）的轉(zhuǎn)運蛋白得到了一定的生理表征。深入研究發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌嬰兒亞種和短雙歧桿菌中存在2 種巖藻糖乳糖轉(zhuǎn)運蛋白（fucosyllactose-binding protein，F(xiàn)L-BP），即FL1-BP和FL2-BP。FL1-BP僅轉(zhuǎn)運2’-FL和3-FL，而FL2-BP還可以轉(zhuǎn)運乳糖二巖藻四糖（lactodifucotetraose，LDFT）和乳酰-N-巖藻五糖（lacto-N-fucopentaose，LNFPI），且當同時存在FL1-BP和FL2-BP時，2’-FL的轉(zhuǎn)運效率取決于FL1-BP[15]。

2.1.2 糖苷酶和磷酸化酶

如前文所述，乳源低聚糖的核心結(jié)構(gòu)由半乳糖、葡萄糖和N-乙?；咸烟墙M成，且常綴有巖藻糖、唾液酸和Neu5Ac等。這些復雜的低聚糖必須逐步分解后被雙歧桿菌利用，因而雙歧桿菌已經(jīng)進化出了幾種高特異性糖苷酶和磷酸化酶，具體見表1。

表1 雙歧桿菌乳源低聚糖代謝相關(guān)酶Table 1 Summary of enzyme related to the metabolism of milk oligosaccharides in bifidobacteria

2.2 干酪乳桿菌對乳源低聚糖的代謝

研究表明，二糖α-L-巖藻糖-(1,3)-N-乙酰-D-氨基葡萄糖（α-L-fucosyl-(1,3)-N-acetyl-D-glucosamine，3FN）經(jīng)alfEFG編碼的甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）轉(zhuǎn)運進入細胞，這個過程中3FN未被磷酸化[24]。接著，3FN在alfB編碼的α-L-巖藻糖苷酶的作用下分解為L-巖藻糖和GlcNAc，后者被繼續(xù)代謝，而L-巖藻糖部分則被外排至培養(yǎng)基中[25]（圖2）。

圖2 干酪乳桿菌的乳源低聚糖代謝途徑Fig. 2 Metabolic pathway of milk oligosaccharides in Lactobacillus casei

干酪乳桿菌對LNB和GNB的利用依賴于gnb操縱子，其中包含gnbR編碼的轉(zhuǎn)錄抑制因子、gnbE編碼的6-磷酸半乳糖胺異構(gòu)酶/脫氨酶、gnbF編碼的6-磷酸-N-乙酰半乳糖胺脫乙酰酶、gnbG編碼的β-磷酸半乳糖苷酶和gnbBCDA編碼的甘露糖PTS中酶II（enzyme II，EII）的4 個組分（EIIB、EIIC、EIID和EIIA）；LNB、GNB和GalNAc經(jīng)PTSGnb磷酸化轉(zhuǎn)入細胞后，被β-磷酸半乳糖苷酶水解為6-磷酸半乳糖和相應(yīng)的N-乙酰己糖胺（GlcNAc和GalNAc），隨后GlcNAc和GalNAc被相應(yīng)的激酶磷酸化為GlcNAc-6P和GalNAc-6P，并進入不同的分解代謝途徑，6-磷酸半乳糖則通過塔格糖6-磷酸途徑代謝；GlcNAc-6P經(jīng)NagA脫乙酰酶轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖胺，6-磷酸葡萄糖胺再由NagB脫氨酶轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，進入糖酵解途徑代謝。而GalNAc-6P經(jīng)GnbF脫乙酰酶轉(zhuǎn)化為6-磷酸半乳糖胺，6-磷酸半乳糖胺再由GnbE脫氨酶轉(zhuǎn)化為6-磷酸塔格糖，進入塔格糖6-磷酸途徑分解代謝[26-27]。

2.3 擬桿菌對乳源低聚糖的代謝

腸道寄生的擬桿菌有效利用HMO的能力并不普遍。Marcobal等[28]的研究表明，多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）、脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）、糞擬桿菌（Bacteroides caccae）、普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）、卵圓擬桿菌（Bacteroides ovatus）和糞便擬桿菌（Bacteroides stercoris）6 種擬桿菌能在HMO為單一碳源的培養(yǎng)基生長，但其中卵圓擬桿菌與糞便擬桿菌未呈現(xiàn)指數(shù)增長。另外，該研究還發(fā)現(xiàn)HMO和人類腸道黏蛋白多糖的結(jié)構(gòu)相似，在新生兒腸道菌群中占優(yōu)勢的多形擬桿菌和脆弱擬桿菌在利用HMO和黏蛋白多糖時誘導了一部分同樣的基因。因此，HMO可以同時吸引依賴黏蛋白的菌群和依賴HMO的雙歧桿菌到嬰兒腸道，進而使得嬰兒微生物區(qū)系在引入固體食物后平穩(wěn)過渡。

3 乳源低聚糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

國際理論與應(yīng)用化學聯(lián)合會對低聚糖的定義如下：低聚糖是含有3～9 個單糖殘基的化合物，這些殘基的數(shù)量決定了其聚合程度。低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS）廣泛存在于食用植物和水果中，而低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides，GOS）由乳糖經(jīng)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶作用產(chǎn)生。乳源低聚糖與其他來源的低聚糖同為益生元，均能促進腸道中以雙歧桿菌為代表的有益微生物生長，但是，它們對整個腸道菌群的調(diào)節(jié)作用尚不十分明確。此外，乳源低聚糖與其他來源低聚糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用差異也有待摸索。

3.1 乳源低聚糖和其他低聚糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)

Hamilton等[29]給4 組C57/BL6小鼠分別喂養(yǎng)高脂飲食、高脂飲食+6% BMO、高脂飲食+6%菊粉或?qū)φ诊嬍?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMO和菊粉都增加了小鼠回腸中有益微生物雙歧桿菌和乳酸菌的豐度，然而，菊粉的添加改變了整個腸道菌群系統(tǒng)發(fā)育多樣性，降低了物種豐富度。Yu Zhuoteng等[30]發(fā)現(xiàn)，添加HMO或FOS后，嬰兒腸道菌群中雙歧桿菌數(shù)量增加，大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌均減少，產(chǎn)生的乳酸含量顯著高于對照組，pH值顯著降低，但是，添加HMO的效果均較FOS更為明顯。

乳源低聚糖相較于單一的益生元，在促進雙歧桿菌豐度上有一定的優(yōu)勢。這可能是由于乳源低聚糖中的某些結(jié)構(gòu)被雙歧桿菌優(yōu)先利用，使得雙歧桿菌的物種豐富度與豐度都有所增加。在其他文獻中，研究者還比較了HMO中的核心成分與其他益生元對腸道的影響。Kitaoka等[31]曾報道，在嬰兒腸道中占優(yōu)勢的雙歧桿菌具有LNB和GNB特有的代謝途徑，能把2 種二糖進一步切割。而其他腸道分離菌不能利用LNB顯著促進生長[32]。Satoh等[33]用含有1% LNB、乳果糖、棉子糖、低聚半乳糖或甘露寡糖的單一碳源培養(yǎng)基接種經(jīng)特定嬰幼兒配方乳粉喂養(yǎng)嬰兒的糞便樣本。結(jié)果表明：與其他寡糖相比，LNB能顯著增加雙歧桿菌總數(shù)；與其他寡糖的發(fā)酵產(chǎn)物相比，LNB的發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸含量明顯更低，乙酸含量明顯更高。HMO比其他單一的低聚糖有益生優(yōu)勢可能體現(xiàn)在LNB這類核心組分對雙歧桿菌的定向選擇。

Salli等[34]在體外結(jié)腸模擬器中分別發(fā)酵2’-FL、GOS與乳糖。結(jié)果表明：發(fā)酵2’-FL的腸道菌群生物多樣性增加，其中以雙歧桿菌屬最為顯著；添加3 種物質(zhì)的差異主要體現(xiàn)在短鏈脂肪酸上，GOS組產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸；2’-FL能使代謝它的細菌生長，因而能使雙歧桿菌特異性增殖。當然，整個腸道菌群結(jié)構(gòu)的維持需要更復雜的HMO混合物共同作用。

綜上所述，乳源低聚糖與菊粉、FOS等其他來源低聚糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用存在差異，且相對而言，乳源低聚糖似乎具有更佳的益生作用，如更好地增加腸道菌群的多樣性、促進雙歧桿菌的增殖等。

3.2 腸道菌群的組成影響不同低聚糖的調(diào)節(jié)作用

Medina等[35]以4 種典型的嬰兒腸道微生物：長雙歧桿菌嬰兒亞種、普通擬桿菌、大腸桿菌和嗜酸乳桿菌模擬嬰兒腸道菌群，在單培養(yǎng)、成對培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下，使其在2’-FL或FOS中生長。結(jié)果顯示，雖然在2’-FL中成對培養(yǎng)時，長雙歧桿菌嬰兒亞種較普通擬桿菌更為強勢，但是共培養(yǎng)時，普通擬桿菌主導發(fā)酵，其次為嬰兒雙歧桿菌；然而，在FOS中聯(lián)合培養(yǎng)時，嗜酸乳桿菌始終占據(jù)主導地位。

Perdijk等[36]向成人或嬰兒糞便培養(yǎng)物摻入SL或GOS，以探究SL和GOS對腸道微生物群組成的影響。結(jié)果表明，在嬰兒糞便培養(yǎng)物中添加SL或GOS，擬桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均增加，而在成人糞便培養(yǎng)物中添加SL僅使得擬桿菌數(shù)量增加，添加GOS僅使得雙歧桿菌數(shù)量增加。這也誘導了不同的短鏈脂肪酸組成：添加SL后短鏈脂肪酸以丙酸酯為主導，添加GOS后短鏈脂肪酸以乳酸為主導。

可見，乳源低聚糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用可能受其間某些組成細菌驅(qū)動，即初始腸道菌群的組成會影響該調(diào)節(jié)作用，或者說同一種低聚糖作用于不同的腸道菌群也會產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 語

本文通過綜述乳源低聚糖的種類和結(jié)構(gòu)、腸道菌群對乳源低聚糖的代謝特點及乳源低聚糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，得出以下結(jié)論：1）來自不同哺乳動物的乳源低聚糖成分有很大差異，人乳中比例最高的FL在牛乳中比例極低，而在牛乳中占相當大比例的低聚糖為SL，HMO的種類最多，結(jié)構(gòu)最為復雜；2）并非所有腸道微生物均可利用乳源低聚糖，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌屬可以較好地利用乳源低聚糖，腸道相關(guān)乳桿菌中僅干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、玉米乳桿菌、格氏乳桿菌和約氏乳桿菌能進行GNB/LNB的體外發(fā)酵，擬桿菌中僅多形擬桿菌、脆弱擬桿菌、糞擬桿菌、普通擬桿菌、橢圓形擬桿菌和便擬桿菌能在HMO為唯一碳源的情況下生長；3）雙歧桿菌已經(jīng)進化出2 種乳源低聚糖代謝模式，一種是轉(zhuǎn)運蛋白依賴型，即胞內(nèi)代謝模式，另一種是胞外糖苷酶依賴型，即胞外代謝模式，干酪乳桿菌通過相同的甘露糖型PTS將LNB、GNB和GalNAc轉(zhuǎn)運到細胞中，擬桿菌通過黏液利用途徑攝取乳源低聚糖；4）乳源低聚糖與菊粉、FOS等其他來源低聚糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用存在差異，且相對而言，乳源低聚糖似乎具有更佳的益生作用，如更好地增加腸道菌群的多樣性、促進雙歧桿菌的增殖等，乳源低聚糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用可能受其間某些組成細菌驅(qū)動，即初始腸道菌群的組成會影響該調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，目前的研究已鑒定出一系列與乳源低聚糖運輸和降解相關(guān)的基因，且證實這些基因在雙歧桿菌屬中相對保守，但是仍有大量乳源低聚糖同化過程中涉及的轉(zhuǎn)運蛋白未被發(fā)現(xiàn)，有待研究揭示。另外，乳源低聚糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用也值得更多的關(guān)注。