不同應(yīng)激處理方式對(duì)乳酸菌噴霧干燥過(guò)程中存活率的影響及內(nèi)在機(jī)制

莊若茹，張巧玲，王俊國(guó)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌是一類(lèi)能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱(chēng)，絕大部分乳酸菌對(duì)人體有益，可促進(jìn)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)吸收和新陳代謝，改善腸道環(huán)境，抑制致病菌繁殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[1]。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功效深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，而乳酸菌發(fā)酵劑的品質(zhì)對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)起著關(guān)鍵作用，通過(guò)制備高活性、高穩(wěn)定性的乳酸菌發(fā)酵劑可以使工業(yè)發(fā)酵取得更好的效果[2]。但在乳酸菌工業(yè)化制備的過(guò)程中往往會(huì)受到多種環(huán)境脅迫的影響，制得的乳酸菌發(fā)酵劑活菌數(shù)大幅下降[3]。

目前，在食品工業(yè)中乳酸菌發(fā)酵劑的制備方式主要包括冷凍干燥和噴霧干燥[4]。冷凍干燥技術(shù)制備的發(fā)酵劑活菌數(shù)高且產(chǎn)酸能力強(qiáng)，但生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)[3]。噴霧干燥是將液體中的乳酸菌及載體材料通過(guò)霧化器在熱空氣中分散成細(xì)小的液滴，水分快速蒸發(fā)后形成固體菌粉，這就使得噴霧干燥制備乳酸菌發(fā)酵劑不僅效率高，而且生產(chǎn)成本低，然而在干燥后期菌株會(huì)受到熱脅迫、脫水脅迫及氧化脅迫等影響，使大量菌株喪失活性[5]。隨著乳酸菌發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，噴霧干燥技術(shù)受到了廣泛關(guān)注[3]，所以研究不同應(yīng)激處理提高乳酸菌在噴霧干燥過(guò)程中的存活率并探究其保護(hù)機(jī)制具有重要意義。

1 不同應(yīng)激處理方式對(duì)乳酸菌噴霧干燥過(guò)程中存活率的影響及內(nèi)在機(jī)制

在乳酸菌進(jìn)行噴霧干燥前，一定程度的應(yīng)激處理可誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生適宜性反應(yīng)，提高其抗脅迫能力[6]。主要的保護(hù)機(jī)制為經(jīng)應(yīng)激處理后的乳酸菌通過(guò)產(chǎn)生應(yīng)激蛋白來(lái)提高菌株自身的抗脅迫能力，也通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸成分來(lái)維持細(xì)胞膜的生理功能和完整性以及改變?nèi)樗峋募?xì)胞代謝途徑，從而提高菌株的噴霧干燥存活率[7]。這些應(yīng)激反應(yīng)重疊發(fā)生在不同的應(yīng)激處理之間，形成交叉保護(hù)網(wǎng)絡(luò)，有利于維持菌株在脅迫環(huán)境中的抗性[8]。

1.1 熱應(yīng)激

乳酸菌生長(zhǎng)的適宜溫度為30～37 ℃，50 ℃以上的環(huán)境容易導(dǎo)致菌株失活，且溫度越高，菌株的失活速率越快[9]。在噴霧干燥過(guò)程中，菌株與熱空氣接觸造成的熱損傷是引起乳酸菌死亡的主要因素，菌株大量死亡主要集中在噴霧干燥后期，此時(shí)顆粒內(nèi)部水分開(kāi)始向顆粒表面遷移，菌體逐漸暴露在熱空氣中，接觸溫度逐漸接近出口溫度，使菌體失活[3]。熱脅迫引起鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosusGG）死亡主要是由高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、核糖體和RNA等大分子受損、細(xì)胞膜通透性增大等因素所致[10]。Gong Pimin等[11]發(fā)現(xiàn)，保加利亞乳桿菌sp1.1（Lactobacillus bulgaricussp1.1）受到熱脅迫時(shí)，細(xì)胞壁上蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)最先被破壞，細(xì)胞膜上的膜蛋白發(fā)生熱變性、膜脂被氧化，使細(xì)胞膜通透性增加；最后，核糖體30S亞基受到損傷，蛋白質(zhì)也發(fā)生熱變性。一般認(rèn)為，64 ℃以下，細(xì)胞膜通透性增加是導(dǎo)致保加利亞乳桿菌sp1.1死亡的主要原因，65 ℃以上，核糖體、蛋白質(zhì)及細(xì)胞壁的損傷是引起菌株死亡的主要原因，其中核糖體的損傷是不可逆的，當(dāng)核糖體的數(shù)量不能滿(mǎn)足合成蛋白質(zhì)等基本生命活動(dòng)所需物質(zhì)的最低含量時(shí)，細(xì)胞便會(huì)失活，但在噴霧干燥前對(duì)菌株進(jìn)行熱應(yīng)激處理可提高菌株在加工過(guò)程中的存活率[3]。

熱應(yīng)激是指乳酸菌在高于其正常生長(zhǎng)溫度的環(huán)境下生存時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)產(chǎn)生大量熱激蛋白，以及改變細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)來(lái)增強(qiáng)其對(duì)熱脅迫的適應(yīng)能力的反應(yīng)[12]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，將植物乳桿菌LIP-1（Lactobacillus plantarumLIP-1）在44 ℃熱激處理10 min，然后在30 ℃修復(fù)培養(yǎng)10 min，可顯著提高菌株的耐熱性[13]。Desmond等[14]研究表明，副干酪乳桿菌NFBC 338（Lactobacillus paracaseiNFBC 338）經(jīng)52 ℃處理15 min后GroESL伴侶蛋白的表達(dá)量增加，菌株的抗熱脅迫及抗?jié)B透壓脅迫能力顯著提高（P＜0.05）。Zhang Chenchen等[15]發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301（Lactobacillus rhamnosushsryfm 1301）經(jīng)46 ℃熱激處理1 h可使其在2 mmol/L H2O2中的抗氧化能力提高12 倍。

乳酸菌在噴霧干燥過(guò)程中無(wú)法產(chǎn)生熱激蛋白，對(duì)已損傷的蛋白質(zhì)、DNA無(wú)法進(jìn)行修復(fù)，所以要在干燥前刺激細(xì)胞產(chǎn)生熱激蛋白，經(jīng)熱應(yīng)激處理后的保加利亞乳桿菌sp1.1會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生一系列熱激蛋白來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)噴霧干燥的抵抗能力[3]。如Dnak、GroEL等分子伴侶蛋白具有修復(fù)損傷蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能[16]，小分子熱激蛋白在熱應(yīng)激條件下能和細(xì)胞膜相互作用，從而調(diào)節(jié)膜脂的流動(dòng)性[17]，絲氨酸蛋白酶HtrA能降解熱脅迫后產(chǎn)生的異常蛋白[18]，酪蛋白裂解酶P（casein lyase P，ClpP）的多聚體復(fù)合物可以將不能被伴侶蛋白修復(fù)的蛋白質(zhì)降解，從而減少錯(cuò)配蛋白對(duì)細(xì)胞的損害，提高嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的抗氧化能力[19]。另外，有研究表明，酒酒球菌（Oenococcus oeni）在受到熱應(yīng)激時(shí)細(xì)胞膜上的?；溸\(yùn)動(dòng)增加，可保持較好的脂質(zhì)順序，防止因細(xì)胞膜流動(dòng)性過(guò)高引起細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)流失，提高菌株的抗熱脅迫能力[20]。

1.2 冷應(yīng)激

乳酸菌在低于正常生長(zhǎng)溫度條件下生存時(shí)，通過(guò)合成應(yīng)激蛋白的方式來(lái)提高菌體存活率的過(guò)程稱(chēng)為冷應(yīng)激[21]。在噴霧干燥過(guò)程中，乳酸菌易受到熱脅迫的影響，使其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損、蛋白質(zhì)變性、關(guān)鍵酶失活以及DNA受損等，故在噴霧干燥前對(duì)乳酸菌進(jìn)行適當(dāng)?shù)睦鋺?yīng)激處理，通過(guò)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常的生理功能來(lái)提高菌株的抗熱脅迫能力[22]。

Spano等[23]發(fā)現(xiàn)，對(duì)植物乳桿菌Lp90（LactobacillusplantarumLp90）進(jìn)行8 ℃冷應(yīng)激處理15 min可誘導(dǎo)熱脅迫相關(guān)基因hsp18.55的表達(dá)，提高菌株的耐熱性。Panoff等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)冷應(yīng)激處理的菌株相比，乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403（Lactococcus lactissubsp.lactisIL1403）在8 ℃冷應(yīng)激處理48 h后應(yīng)激蛋白R(shí)pod的表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），使其在52 ℃的熱致死環(huán)境中處理30 min后的耐熱存活率提高60～100 倍。

對(duì)乳酸菌進(jìn)行冷應(yīng)激處理可誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生大量冷激蛋白，冷激蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，減少?lài)婌F干燥過(guò)程中熱脅迫對(duì)乳酸菌造成的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，增加菌株在不利環(huán)境下的脅迫抗性[25]。另外，嗜酸乳桿菌在冷應(yīng)激后產(chǎn)生的ClpP，通過(guò)分解細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊或受損的蛋白質(zhì)，能減少有毒蛋白質(zhì)對(duì)菌株細(xì)胞的破壞作用，提高菌株的耐熱性[19]。

1.3 氧應(yīng)激

乳酸菌屬于兼性厭氧微生物，菌株自身能產(chǎn)生相應(yīng)的酶，以消除環(huán)境中的自由氧造成的危害，但在噴霧干燥過(guò)程中，菌株細(xì)胞中酶的活性受到抑制，造成細(xì)胞內(nèi)活性氧及自由基大量積累，而羥自由基及負(fù)氧離子能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)、脂類(lèi)、核苷酸等成分造成損傷，引起細(xì)胞的老化和死亡[26]；超氧陰離子可以將含鐵硫簇酶中的鐵離子氧化為亞鐵離子，導(dǎo)致酶失活，破壞細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝，導(dǎo)致菌株細(xì)胞受損死亡[27]。

在噴霧干燥前將乳酸菌置于特定的亞致死濃度氧中進(jìn)行應(yīng)激處理，菌株通過(guò)調(diào)節(jié)自身的代謝通路和合成應(yīng)激蛋白來(lái)激活自身細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)，產(chǎn)生的抗氧化酶類(lèi)不僅可以消除自由基及氧負(fù)離子，還可以調(diào)控應(yīng)激蛋白修復(fù)菌株的損傷部位，這一過(guò)程稱(chēng)為氧應(yīng)激[28]。Zhang Chenchen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)氧應(yīng)激處理的菌株相比，用0.5 mmol/L H2O2氧應(yīng)激處理1 h的鼠李糖乳桿菌hsryfm1301在熱脅迫條件下的存活率提高約150 倍，這可能與菌株代謝通路的調(diào)整有關(guān)。Desmond等[29]發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌NFBC 338經(jīng)0.003 mmol/L H2O2處理后可提高噴霧干燥過(guò)程中菌株的存活率，這可能與應(yīng)激蛋白的合成有關(guān)。

乳酸菌自身具有一套抗氧化損傷系統(tǒng)，來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)及蛋白穩(wěn)態(tài)，這套抗氧化損傷系統(tǒng)包括胞內(nèi)氧化還原代謝酶（如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶）、抗氧化酶（如過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶）及呼吸代謝系統(tǒng)相關(guān)酶類(lèi)，可以通過(guò)清除菌株細(xì)胞內(nèi)的自由氧來(lái)避免細(xì)胞受到氧化損傷[28]。其中，谷胱甘肽在舊金山乳桿菌DSM20451T（Lactobacillus sanfranciscensisDSM20451T）中可以作為電子供體清除活性氧（如還原氫過(guò)氧化物和脂質(zhì)過(guò)氧化物），以及提高菌株抗?jié)B透壓脅迫能力[30]。另外，短雙歧桿菌UCC2003（Bifidobacterium breveUCC2003）受到氧脅迫時(shí)會(huì)刺激細(xì)胞產(chǎn)生熱休克蛋白20、GroEL、GroES、DnaK等伴侶蛋白，這些蛋白與胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，在噴霧干燥過(guò)程中維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的構(gòu)象，防止關(guān)鍵蛋白失活[31]。

1.4 酸應(yīng)激

酸應(yīng)激是指乳酸菌細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生應(yīng)激蛋白來(lái)修復(fù)或降解受損的DNA或蛋白質(zhì)，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞膜中脂肪酸的組成成分，保證細(xì)胞膜的正常生理功能，維持細(xì)胞內(nèi)外pH值平衡的過(guò)程[12]。因此，適當(dāng)?shù)乃釕?yīng)激處理可提高噴霧干燥過(guò)程中菌株抗熱脅迫及氧脅迫的能力[32]。

安璟[12]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，乳酸片球菌（Pediococcus lactis）經(jīng)pH 3.0的酸應(yīng)激處理后耐熱性提高10.8 倍。Chen等[33]發(fā)現(xiàn)，馬乳酒樣乳桿菌M1（Lactobacillus kefiranofaciensM1）經(jīng)過(guò)pH 5.0酸應(yīng)激處理1 h后比未經(jīng)酸應(yīng)激處理菌株的耐熱存活率提高18.04 倍。Zhang Chenchen等[15]發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在pH 2.5的鹽酸中酸應(yīng)激處理1 h可提高其在2 mmol/L H2O2氧致死環(huán)境中的抗氧脅迫能力。薛峰[32]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌ATCC 393（Lactobacillus caseiATCC 393）經(jīng)過(guò)pH 3.8～4.0的鹽酸預(yù)處理90 min后可使細(xì)胞在應(yīng)對(duì)熱脅迫和氧脅迫時(shí)存活率分別提高305、173倍。Barbosa等[34]發(fā)現(xiàn)，將植物乳桿菌299v（Lactobacillus plantarum299v）在pH 3.0的酸應(yīng)激環(huán)境中處理1 h可使其在噴霧干燥后的存活率提高11 倍。

乳酸菌經(jīng)過(guò)酸應(yīng)激環(huán)境培養(yǎng)一定時(shí)間后再暴露于極端脅迫環(huán)境中，菌株通過(guò)產(chǎn)生應(yīng)激蛋白和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸組成成分可使菌株存活率高于未經(jīng)應(yīng)激處理菌株的過(guò)程稱(chēng)為酸適應(yīng)性反應(yīng)機(jī)制[35]。酸應(yīng)激可誘導(dǎo)干酪乳桿菌ATCC 393中熱休克蛋白DnaK、DnaJ的表達(dá)增加，使錯(cuò)配蛋白重新正確折疊，以提高菌株的耐熱性，也可刺激菌株細(xì)胞中氧脅迫應(yīng)激蛋白MutS、RecO的表達(dá)上調(diào)，以提高菌株的抗氧化脅迫能力[36]。而且，酸應(yīng)激也可誘導(dǎo)與糖酵解相關(guān)的磷酸甘油酸激酶和烯醇化酶的表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞代謝活性提高，為修復(fù)受損的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)提供能量[32]。另外，酸應(yīng)激處理可刺激干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）細(xì)胞膜脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度增加，使菌株細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，維持細(xì)胞膜在熱致死環(huán)境中的穩(wěn)定性，提高菌株噴霧干燥過(guò)程中存活率[37]。

1.5 鹽應(yīng)激

在噴霧干燥過(guò)程中，細(xì)胞快速脫水會(huì)對(duì)細(xì)胞膜的磷脂雙分子層造成損傷，使細(xì)胞膜由液晶相轉(zhuǎn)變成凝膠相，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加[38]，也會(huì)使細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)變性、脂類(lèi)氧化[12]，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行正常的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)[39]。菌株脫水使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)高度濃縮，使細(xì)胞內(nèi)一些對(duì)電解質(zhì)敏感的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，并喪失其生理功能[3]。脫水過(guò)程還會(huì)造成DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基對(duì)間的氫鍵及糖苷鍵斷裂，影響核苷酸的組成，從而影響蛋白質(zhì)和酶的活力[40]。而且由于脫水造成的滲透壓脅迫不僅會(huì)在干燥階段對(duì)細(xì)胞造成損傷，在復(fù)水過(guò)程中，若細(xì)胞復(fù)水速率過(guò)快，會(huì)使細(xì)胞過(guò)度膨脹，造成細(xì)胞死亡[41]。

對(duì)菌株進(jìn)行適當(dāng)?shù)柠}應(yīng)激處理，通過(guò)產(chǎn)生應(yīng)激蛋白和調(diào)整細(xì)胞代謝通路來(lái)提高乳酸菌對(duì)熱及脫水等脅迫的耐受性的過(guò)程稱(chēng)為鹽應(yīng)激[42]。安璟[12]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌在6 g/100 mL NaCl的鹽應(yīng)激環(huán)境下處理30 min后耐熱性比未處理對(duì)照組提高4.2 倍，在8 g/100 mL NaCl的鹽濃度下處理保加利亞乳桿菌，菌株的抗脫水脅迫能力和耐熱性均有提高。Angelis等[43]發(fā)現(xiàn)，用4 g/100 mL NaCl處理瑞士乳桿菌CNRZ 32（Lactobacillus helveticusCNRZ 32）時(shí)，菌株細(xì)胞中絲氨酸蛋白酶HtrA的合成量增加8 倍，絲氨酸蛋白酶HtrA能降解熱脅迫后產(chǎn)生的異常蛋白，增強(qiáng)菌株的抗熱脅迫能力。鹽應(yīng)激處理會(huì)使植物乳桿菌的熱激蛋白和滲透壓脅迫蛋白的表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），提高菌株抗熱脅迫及脫水脅迫的能力[44]。Xie Yi等[45]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403在4 g/100 mL的鹽溶液中培養(yǎng)30 min后，murF和murG基因的表達(dá)量增加，提高菌株抗脫水脅迫能力。鹽應(yīng)激產(chǎn)生的蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶可調(diào)控糖酵解關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄，保證糖代謝的順利進(jìn)行，為清酒乳桿菌23K（Lactobacillus sakei23K）修復(fù)受損部位提供能量，提高菌株在噴霧干燥過(guò)程中的存活率[46]。

鹽應(yīng)激可促進(jìn)菌株細(xì)胞中DnaK、GroEL和GroES等熱激蛋白的表達(dá)量增加，這些蛋白在調(diào)控胞內(nèi)蛋白質(zhì)的修復(fù)和降解中起到關(guān)鍵作用[16]，也會(huì)刺激細(xì)胞中氧化損傷修復(fù)蛋白蛋氨酸亞砜還原酶的增加，提高乳酸菌的抗氧化脅迫能力[46]。鹽應(yīng)激過(guò)程刺激乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403的代謝通路發(fā)生變化，如基因murF和murG表達(dá)量增加，以誘導(dǎo)肽聚糖的合成，保護(hù)菌株細(xì)胞壁的穩(wěn)定性[45]。

1.6 醇應(yīng)激

醇應(yīng)激是指在一定的醇溶液中處理乳酸菌，菌株通過(guò)產(chǎn)生應(yīng)激蛋白以及調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性來(lái)提高菌株在噴霧干燥過(guò)程中的存活率[47]，如低濃度的醇應(yīng)激處理可提高乳酸菌的抗熱脅迫能力[23]。

Spano等[23]發(fā)現(xiàn)，體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇可刺激植物乳桿菌產(chǎn)生熱休克蛋白，提高菌株的抗熱脅迫能力。趙紅玉等[20]研究發(fā)現(xiàn)，體積分?jǐn)?shù)低于12%的乙醇應(yīng)激可使酒酒球菌的應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)，其中clpP調(diào)控的蛋白酶可維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正確組裝，保證菌株的正常生長(zhǎng)代謝，提高菌株在噴霧干燥過(guò)程中的存活率；提高小分子熱應(yīng)激蛋白Lo18的合成量可防止菌體膜蛋白發(fā)生聚集而變性，提高酒酒球菌ATCC BAA-1163抗熱脅迫的能力[48]；ggpps基因可促使類(lèi)異戊二烯前體轉(zhuǎn)化為類(lèi)胡蘿卜素，以提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[49]。變形鏈球菌（Streptococcus mutans）還通過(guò)增加細(xì)胞膜中脂肪酸鏈長(zhǎng)的方式來(lái)降低細(xì)胞膜流動(dòng)性，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定，提高菌株應(yīng)對(duì)不利環(huán)境的抗性[50]。

1.7 交叉組合應(yīng)激

在噴霧干燥過(guò)程中，熱脅迫、脫水脅迫及氧脅迫幾乎同時(shí)作用于細(xì)胞，故提高菌株應(yīng)對(duì)多重脅迫的能力變得尤為重要，而單因素應(yīng)激的保護(hù)作用有限，故研究者也從交叉組合應(yīng)激方面做了研究[32]。乳酸菌通過(guò)大量的調(diào)控元件和功能基因組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)提高菌株抗脅迫能力，而一些調(diào)節(jié)元件可以調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)，一些功能基因又有多種用途，如圖1所示，產(chǎn)生應(yīng)激蛋白、調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性和調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等應(yīng)激反應(yīng)交叉重疊地發(fā)生在不同的應(yīng)激處理之間，形成交叉應(yīng)激[7]。

圖1 不同應(yīng)激處理方式對(duì)乳酸菌噴霧干燥過(guò)程中的保護(hù)機(jī)制Fig. 1 Protective mechanism of different stress treatments on lactic acid bacteria during spray drying

安璟[12]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌在4 g/100 mL NaCl鹽應(yīng)激環(huán)境中處理30 min，再以50 ℃熱激處理3 h，與進(jìn)行單一鹽應(yīng)激的菌株相比，其耐熱性提高21.28 倍。張鈺[51]發(fā)現(xiàn)，與僅進(jìn)行醇應(yīng)激的菌株相比，經(jīng)過(guò)10 mmol/L CaCl2及體積分?jǐn)?shù)8%乙醇應(yīng)激處理12 h后，二者形成的復(fù)合應(yīng)激效果使鼠李糖乳桿菌ZY（Lactobacillus rhamnosusZY）胞外多糖的生成量增多，菌株的耐熱性進(jìn)一步提高。林炳諭[52]發(fā)現(xiàn)，選擇合適的應(yīng)激處理方式促進(jìn)雙歧桿菌（Bifidobacterium）生物膜的形成，可提高其抗熱脅迫和抗氧化脅迫的能力。張國(guó)麗等[53]發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌PG3-1在42 ℃培養(yǎng)36 h后，細(xì)胞外形成大量的生物膜，且在生物膜成熟過(guò)程中DnaK、GroEL基因表達(dá)量增高，同時(shí)提高了菌株抗熱脅迫及抗脫水脅迫的能力。

2 結(jié) 語(yǔ)

在噴霧干燥法制備乳酸菌發(fā)酵劑的過(guò)程中，許多因素會(huì)對(duì)菌株造成不可避免的損傷，最終影響其活性。本文主要?dú)w納噴霧干燥過(guò)程中不同應(yīng)激處理對(duì)乳酸菌的保護(hù)機(jī)制，以期為提高菌株噴霧干燥過(guò)程中存活率提供理論參考。得出如下結(jié)論：首先，對(duì)乳酸菌進(jìn)行應(yīng)激處理可刺激細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激蛋白、維持細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性以及調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝通路，從而提高菌株的脅迫抗性；其次，通過(guò)組合不同應(yīng)激處理方式亦可明顯提高菌株的抗脅迫能力，提高菌株的噴霧干燥存活率。因此，在未來(lái)的研究中，研究者需選擇合適的應(yīng)激處理?xiàng)l件，以增強(qiáng)乳酸菌在噴霧干燥過(guò)程中的脅迫抗性，提高乳酸菌發(fā)酵劑的活菌數(shù)。